專利名稱：一種精子的冷凍方法及其冷凍液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種冷凍處理方法，尤其涉及一種精子的冷凍方法及其冷凍液。
背景技術(shù)：
卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)單精子注射技術(shù)(ICSI)作為輔助受精的一種手段，在短短幾十年里得到了迅猛的發(fā)展，就ICSI應(yīng)用的性質(zhì)和范圍來看，當(dāng)前ICSI的應(yīng)用可以歸為兩大類，一是它可以解決精子本身因素及輸卵管阻塞等原因所導(dǎo)致的一系列不育問題，故而被廣泛用于生殖醫(yī)學(xué)的不育癥治療；二是作為一種生物技術(shù)用于生物工程領(lǐng)域，對畜牧生產(chǎn)、 野生動物保護(hù)和受精機(jī)理等發(fā)育生物學(xué)基礎(chǔ)理論的研究均具有非常重要的意義。ICSI技術(shù)通常包括精子和卵子的準(zhǔn)備或預(yù)處理、精子胞質(zhì)內(nèi)顯微注射、注射卵的激活以及注射卵體外發(fā)育情況的觀察與評定。而精子的質(zhì)量是ICSI技術(shù)成功的重要因素。近些年來，盡管人們對精子冷凍的研究日益深入，但冷凍精子的存活及受精尚未有顯著的改善。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種冷凍精子的方法，其主要包括步驟1)將精液與冷凍液按1 1的比例稀釋混勻；2) 4°C緩慢降溫，3h后用0. 25 0. 35ml塑料細(xì)管分裝封口，置于懸浮物上，距液氮面4 6cm，其溫度為-90 -95°C ；3) 10 15分鐘后投入液氮中。步驟1)中所述的冷凍液含有去離子水、Tris · HCL、檸檬酸、葡萄糖、卵黃、甘油。 所述的冷凍液通過下述方法獲得100ml去離子水中加入3. 52gTris · HCL、1. 96g檸檬酸、 1. 59g葡萄糖混勻作為基礎(chǔ)液；76ml基礎(chǔ)液中加入20ml卵黃、細(xì)1甘油獲得IOOml冷凍液。本發(fā)明還提供一種冷凍液，其主要含有去離子水、Tris · HCL、檸檬酸、葡萄糖、卵黃、甘油。每IOOml冷凍液中包含76ml由去離子水、Tris *HCL、檸檬酸和葡萄糖組成的基礎(chǔ)液以及20ml卵黃和細(xì)1甘油；所述基礎(chǔ)液中各組分的比例為去離子水Tris -HCL 檸檬酸葡萄糖=IOOml 3. 52g 1. 96g 1. 59g。所述的冷凍液通過下述方法制備100ml 去離子水中加入3. 52gTris · HCL、1. 96g檸檬酸、1. 59g葡萄糖混勻作為基礎(chǔ)液；76ml基礎(chǔ)液中加入20ml卵黃、細(xì)1甘油獲得IOOml冷凍液。 所述的冷凍液可以用于冷凍精子。本發(fā)明提供的精子冷凍方法，操作簡單，而且凍融后的精子仍具有較高的受精能力和胚胎發(fā)育率。為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉較佳實(shí)施例， 并配合附圖，作詳細(xì)說明如下。


圖1是操作盤示意圖；圖2是雌雄原核和第一二極體示意圖；圖3是2-細(xì)胞胚胎示意圖；圖4是4-細(xì)胞胚胎示意圖；圖5桑椹胚示意圖；圖6是囊胚示意圖；圖7是擴(kuò)張囊胚示意圖；圖8是孵化囊胚示意圖；圖9是凍融后活的胚胎示意圖；圖10是凍融后死的胚胎；圖11是顯微操作示意圖；圖12是出生的仔兔。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1精子的準(zhǔn)備1.新鮮精子取兔(6 8月齡新西蘭兔，SPF級，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供，許可證號SCXK<滬>2004-000幻新鮮精液用D-PBS液(商購)2000r/min離心洗滌三次然后緩慢的加入D-PBS液，放在38. 5°C,5% C02、100%濕度下的培養(yǎng)箱中緩慢上游10分鐘。2.凍融的精子采集兔精液與冷凍液(冷凍液的配方為100ml去離子水中加入3. 52gTris -HCL, 1. 96g檸檬酸、1. 59g葡萄糖混勻作為基礎(chǔ)液；IOOml冷凍液76ml基礎(chǔ)液中加入20ml卵黃、甘油，混勻分裝，4°C冰箱保存。)1 1稀釋混勻，4°C緩慢降溫，3h后用0.25 0. 30ml塑料細(xì)管分裝封口，置于漂浮器上(距液氮面如m，-90-_95°C )，10分鐘后投入液氮。將裝有要解凍精子的細(xì)管置于42°C水浴中20秒。兔凍融精液直接放入D-PBS液中，在 38. 5°C,5% C02、100%濕度下的培養(yǎng)箱中緩慢上游10分鐘。實(shí)施例2卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備1.新鮮卵母細(xì)胞供體母兔為6-8月齡、體重3kg左右的初產(chǎn)新西蘭兔，按Kennelly和R)ote (1965) 的方法，即連續(xù)3天每天2次(間隔12h)每次皮下注射FSH50IU/只(寧波第二激素廠生產(chǎn))，最后一次注射FSH后12h，耳緣靜脈注射HCG (寧波第二激素廠生產(chǎn))100IU/只并與結(jié)扎公兔交配，HCG注射后14、16、1 ι進(jìn)行取卵，在無菌條件下剪下輸卵管，吸取IOml的沖卵液，由喇叭口向?qū)m管結(jié)合部方向沖卵，每側(cè)用5mL沖卵液，將卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體放在裝有含0. 2%透明質(zhì)酸酶的D-PBS液的Eppendorf管中，在渦旋混合器上震蕩消化5min去除顆粒細(xì)胞，在體視顯微鏡下?lián)斐鼋?jīng)酶消化的卵母細(xì)胞，用培養(yǎng)液洗滌三次，然后放入38. 5°C、 5% C02、100%濕度下平衡12h以上的培養(yǎng)液微滴中，直到顯微注射。2.凍融的卵母細(xì)胞1)卵母細(xì)胞的冷凍
冷凍前2h左右將室溫調(diào)至25°C，同時(shí)將所有溶液及試驗(yàn)器具在25°C室溫下平衡 1 池。采用0. 25 0. 30ml塑料細(xì)管(France)，用記號筆標(biāo)記，然后用細(xì)乳膠管與注射器相連接。按順序吸入0. 5mol蔗糖溶液(5. 5cm)—空氣(1. 5cm)—玻璃化溶液(0. 5cm)— 空氣(0. 5cm)—玻璃化溶液(1.5cm)，平行放置于操作臺上，將卵母細(xì)胞移入玻璃化溶液中洗一次，然后將10枚卵母細(xì)胞置于細(xì)管中的玻璃化溶液中，卵母細(xì)胞導(dǎo)入后依次再吸入空氣(0. 5cm)—玻璃化溶液(0. 5cm)—空氣(0. 5cm)，最后吸0. 5mol蔗糖溶液(Icm)。用封口機(jī)將塑料細(xì)管封口。將含有卵母細(xì)胞的細(xì)管一端直接投入液氮，另一半用液氮?dú)庋衾鋬觯?待蔗糖部分凍結(jié)后轉(zhuǎn)入液氮罐中長期保存，從卵母細(xì)胞移入玻璃化溶液到細(xì)管投入液氮為止整個過程為1分鐘，如果室溫調(diào)至20°C，則整個過程需要2分鐘。2)卵母細(xì)胞的解凍塑料細(xì)管從液氮中取出后，快速置于25°C水浴中輕輕擺動約10秒鐘，待細(xì)管中蔗糖溶液段由乳白色變?yōu)橥该骱笕〕?，用吸水紙吸去?xì)管表面水分，剪去細(xì)管兩端的封口，用吸有ImLO. 5mol蔗糖溶液的注射器將細(xì)管內(nèi)容物沖入表面皿內(nèi)，在實(shí)體顯微鏡下回收卵母細(xì)胞，回收的卵母細(xì)胞移入0. 5mol蔗糖溶液內(nèi)平衡5分鐘去除乙二醇和聚蔗糖后，再轉(zhuǎn)入 D-PBS液中，然后待卵母細(xì)胞恢復(fù)正常形態(tài)后再用培養(yǎng)液洗滌2-3次繼續(xù)培養(yǎng)。解凍后放入38. 5°C>5% C02、100%濕度下平衡12h以上的培養(yǎng)液微滴中至少3h， 然后進(jìn)行操作。實(shí)施例3將精子灃射到卵母細(xì)胞中1.操作盤的制作操作盤的設(shè)計(jì)方式按《小鼠胚胎操作實(shí)驗(yàn)手冊》第三版ICSI章節(jié)所介紹的樣式設(shè)計(jì)，即于90mm細(xì)胞培養(yǎng)皿蓋上依次做成4-5排操作小滴，每排操作液滴由三個Ml 10% PVP (聚乙烯吡咯酮)滴和三個5ulmTCM199滴組成，吸取2ul浮游的上層精子加入到第二個 PVP滴中，卵子置于第四個mTCM199滴中，盤中間其余小滴都做holding管和注射針的清洗滴用，全部操作滴做好后，最后用3-5ml石蠟油覆蓋整個操作盤，操作盤操作滴的設(shè)計(jì)樣式見圖(圖1)。2. PVP滴中精子的加入PVP (IgPVP倒入IOmlD-PBS液中配置而成)滴中根據(jù)精子密度的大小按合適的比例加入，每個PVP滴中混合2. Oul精子懸浮液，具體操作是用IOul移液槍吸取2. Oul的精子游離液，在體視顯微鏡下，將槍頭深入到PVP滴中，吹出精子懸浮液到PVP滴中，反復(fù)吹吸操作數(shù)次，使精子在PVP滴中混合均勻，精子加完后，覆蓋石蠟油。3.顯微操作系統(tǒng)的裝針與調(diào)試在操作系統(tǒng)注射針時(shí)，用一根前端細(xì)長的水銀塑料吸管吸取1 2ul水銀，把水銀吸管前端細(xì)長的部分從注射針的后端伸入進(jìn)注射針，在離注射針末段1. 0 1. 5cm的位置緩慢吹出吸管內(nèi)的水銀，使水銀柱在針管中長度在2 3mm之間即可，水銀灌好后，把注射針連接到Piezo操作臂上。注射前，用撿卵針把5-10枚卵母細(xì)胞移入操作液滴中，然后用注射針抓取一個精子放入第三個PVP液滴中，用針尖在精子尾部迅速劃過進(jìn)行制動，看到尾部打折即可，隨后從尾部吸入注射針內(nèi)。注射時(shí)第一極體在12點(diǎn)鐘位置，從3點(diǎn)鐘的位置進(jìn)針，設(shè)置強(qiáng)度和頻率參數(shù)為2X2或3X2，激發(fā)1至2個脈沖擊穿透明帶，繼續(xù)進(jìn)針同時(shí)將精子小心的推至針
5尖處，直至針尖插入卵母細(xì)胞深處，幾乎貼近對側(cè)質(zhì)膜時(shí)，調(diào)換參數(shù)到1X1的檔，用Piez0 弱脈沖擊穿卵母細(xì)胞質(zhì)膜，將精子吐出，回吸注入卵內(nèi)多余的液體，輕輕退針，完成一次注射。依次操作，每次注射從開始制動到注射完畢在anin內(nèi)完成，所有顯微操作在室溫下完成。4.受精卵和孤雌活化卵的判定標(biāo)準(zhǔn)注射后6- 檢查原核和第二極體形成情況，只有當(dāng)出現(xiàn)2原核2極體(2PN、2PB) 時(shí)判定為受精；當(dāng)出現(xiàn)1原核1極體(IPNUPB)、1原核2極體(1PN、2PB)、2原核1極體 (2PNUPB)時(shí)判定為活化。實(shí)施例4警精卵的培養(yǎng)顯微注射后，注射卵經(jīng)培養(yǎng)液洗滌三次后，移入平衡好的培養(yǎng)液微滴中，放在 38. 55% CO2、100%濕度下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3_4天，培養(yǎng)6 他后觀察原核和第二極體形成情況，每隔1 觀察并記錄卵裂情況，間隔24h換液，適時(shí)照相。實(shí)施例5胚胎冷凍和解凍方法同實(shí)施例2中的卵母細(xì)胞的冷凍和解凍方法。實(shí)施例6胚胎移植新鮮的ICSI胚胎或凍融的胚胎，在TCM199培養(yǎng)液(18mlTCM199中加入anlFBS、 0. 00275g丙酮酸鈉、0. 00075gEDTA、0. 0015g青霉素、0. OOlg鏈霉素，充分混勻，調(diào)pH為 7. 3,0. 22um濾器過濾分裝，4°C冰箱保存)中培養(yǎng)2_3小時(shí)，形態(tài)正常的胚胎供移植用，受體為注射HCG后假孕60h、生過一胎、體質(zhì)健康、體重3. 5kg左右的成年母兔。受體兔在手術(shù)前禁食12h。首先用0. 5mL速眠新(即846合劑)肌肉注射麻醉，待兔麻醉后保定，在兩肷部附近分別剪毛、消毒、手術(shù)開口，暴露子宮，用針頭在子宮體上扎一小孔，然后用頭部鈍化的移卵管將胚胎移入子宮中，每側(cè)子宮移入7-8枚胚胎，每只母兔15-16枚胚胎。整個手術(shù)過程在無菌條件下進(jìn)行，盡量在較短時(shí)間內(nèi)G0-50min)完成手術(shù)，對術(shù)后母兔精心飼養(yǎng)管理。實(shí)施例7結(jié)果分析采用SSPS 13. 0中的卡方(χ2)檢驗(yàn)對結(jié)果進(jìn)行顯著性分析，以P < 0. 05為差異顯著性判定標(biāo)準(zhǔn)。請參照圖2 12，其中圖2是雌雄原核和第一二極體示意圖；圖3是2-細(xì)胞胚胎示意圖；圖4是4-細(xì)胞胚胎示意圖；圖5桑椹胚示意圖；圖6是囊胚示意圖；圖7是擴(kuò)張囊胚示意圖；圖8是孵化囊胚示意圖；圖9是凍融后活的胚胎示意圖；圖10是凍融后死的胚胎；圖11是顯微操作示意圖；圖12是出生的仔兔。1.不同卵齡時(shí)期取卵HCG注射后14、16、1他進(jìn)行取卵，用新鮮活精子進(jìn)行注射，激活用機(jī)械刺激的方法，第一極體在12點(diǎn)鐘位置，3點(diǎn)鐘的位置進(jìn)針，分三組進(jìn)行，每組重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)其受精率、 囊胚率。結(jié)果見表1。從表1中可以看出hCG注射后14h取卵，其卵裂率、桑椹胚率和囊胚率(82.2%、 72. 9%和 62. 2%)都比 16h(75. 9%、70. 0%和 53. 3% )的高，但是差異不顯著(P > 0. 05)； 1 取的卵注射后不能卵裂，與14h和IMi差異顯著(P <0.05)?？梢姡⑸銱CG后14h和 16h取卵都可以，但是14h取卵最佳。
表 權(quán)利要求
1.一種精子的冷凍方法，其特征在于，包括步驟1)將精液與冷凍液按1 1的比例稀釋混勻；2)4°C緩慢降溫，后用0.25 0. 35ml塑料細(xì)管分裝封口，置于懸浮物上，距液氮面 4 6cm，其溫度為-90 -95°C ；3)10 15分鐘后投入液氮中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中所述的冷凍液含有去離子水、 Tris · HCL、檸檬酸、葡萄糖、卵黃、甘油。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的冷凍液通過下述方法獲得100ml 去離子水中加入3. 52gTris · HCL、1. 96g檸檬酸、1. 59g葡萄糖混 勻作為基礎(chǔ)液；76ml基礎(chǔ)液中加入20ml卵黃、細(xì)1甘油獲得IOOml冷凍液。
4.一種冷凍液，其特征在于，含有去離子水、Tris · HCL、檸檬酸、葡萄糖、卵黃、甘油。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的冷凍液，其特征在于，每IOOml冷凍液中包含76ml 由去離子水、Tris ·Ηα、檸檬酸和葡萄糖組成的基礎(chǔ)液以及20ml卵黃和細(xì)1甘油；所述基礎(chǔ)液中各組分的比例為去離子水Tris · HCL 檸檬酸葡萄糖= IOOml 3. 52g 1.96g 1. 59g。
6.權(quán)利要求5所述的冷凍液的制備方法，其特征在于，包括步驟100ml去離子水中加入3. 52gTris · HCL、1. 96g檸檬酸、1. 59g葡萄糖混勻作為基礎(chǔ)液；76ml基礎(chǔ)液中加入20ml 卵黃、甘油獲得IOOml冷凍液。
7.權(quán)利要求4或5所述的冷凍液在冷凍精子中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種精子的冷凍方法，其主要包括步驟1)將精液與冷凍液按1∶1的比例稀釋混勻；2)4℃緩慢降溫，3h后用0.25～0.35ml塑料細(xì)管分裝封口，置于懸浮物上，距液氮面4～6cm，其溫度為-90～-95℃；3)10～15分鐘后投入液氮中。本發(fā)明提供的精子冷凍方法，操作簡單，而且凍融后的精子仍具有較高的受精能力和胚胎發(fā)育率。
文檔編號A01N1/02GK102450248SQ20101051956
公開日2012年5月16日 申請日期2010年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月26日
發(fā)明者陳浩杰 申請人:陳浩杰