專利名稱：絞股藍皂甙用于減少動物瘤胃內(nèi)甲烷產(chǎn)生的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及絞股藍皂甙用于減少動物瘤胃內(nèi)甲烷產(chǎn)生的方法，屬于添加劑的使用 方法，用于反芻動物的飼養(yǎng)，諸如奶牛，肉牛，山羊和綿羊等，減少瘤胃甲烷生成，提高飼料 能量利用，緩解反芻動物養(yǎng)殖中反芻動物瘤胃發(fā)酵產(chǎn)甲烷對環(huán)境的污染。
背景技術(shù)：
近幾個世紀，僅次于二氧化碳的甲烷有明顯的提高，是人類活動產(chǎn)生的第二種重 要溫室氣體。自18世紀工業(yè)革命以來，人類活動及人口的迅速增長，特別是農(nóng)業(yè)、化石燃料 的使用及廢物的處理，使甲烷釋放量呈倍數(shù)增加。目前大氣層中甲烷濃度已達1774ppb，每 年有5 5. 5億噸甲烷進入大氣，遠遠超過了大氣反應和土壤微生物利用所能消耗的總和， 導致甲烷氣體每年以0.9%的速度遞增，高于二氧化碳的0.5% (IPCC，1992)。預測今后50 年內(nèi)甲烷可引起15 17%的溫室效應(IPCC，1992)。大氣甲烷濃度的逐漸升高引起研究 人員對其來源和沉積的研究，近年來生物學家也開始對甲烷釋放產(chǎn)生興趣。減少甲烷氣體的排放量，需從各個方面采取緩解措施，如從工業(yè)，農(nóng)業(yè)，能量和家 庭起居生活入手。農(nóng)業(yè)所產(chǎn)甲烷占人類活動甲烷總產(chǎn)量的三分之二(IPCC，1995)，其中，反 芻動物瘤胃發(fā)酵所產(chǎn)甲烷約占人類活動總產(chǎn)量的22%，是全球甲烷總排放量的15%。農(nóng)業(yè) 甲烷排放最為重要的來源是反芻動物瘤胃及其排泄物釋放的甲烷。瘤胃內(nèi)棲息著多種多樣的微生物，形成一個十分復雜的微生態(tài)系統(tǒng)，特別是細菌， 原蟲及一些真菌共同降解植物聚合物成為揮發(fā)性脂肪酸(瘤胃主要的能源)，H2和二氧化 碳。其中H2被產(chǎn)甲烷古菌用作能量來還原二氧化碳，形成甲烷。據(jù)估計，每頭牛每天產(chǎn)生 250 500升的甲烷(Johnson和Johnson，1995)，全球13億頭牛所產(chǎn)甲烷占家畜甲烷總 產(chǎn)量的73% 80% (Johnson, 1994)。對于反芻動物來說，甲烷作為飼料能量損失被釋放 到大氣中。由于反芻家畜甲烷產(chǎn)量大，且動物群體數(shù)量多，因此，反芻動物甲烷產(chǎn)量是一個 不可忽視的因素。反芻動物甲烷的排放不僅引起飼料能量的損失(甲烷可占總能的2% 12% )，且造成環(huán)境污染。調(diào)控反芻動物瘤胃活動來減少甲烷釋放成為減少甲烷排放的一種 途徑。瘤胃中大約有9 25%瘤胃產(chǎn)甲烷菌與原蟲共生，并產(chǎn)生相應部分的甲烷。植物 皂甙作為抗生素促生長劑的替代品在飼料中得到廣泛應用，用于調(diào)控瘤胃微生物發(fā)酵和減 少甲烷釋放，提高瘤胃的飼料利用效率。原蟲對皂甙的敏感性被認為是植物皂甙能夠與細 胞膜中的膽固醇結(jié)合，導致細胞膜完整性喪失，最終導致細胞死亡。原蟲數(shù)量下降，引起與 其共生的產(chǎn)甲烷菌及瘤胃甲烷產(chǎn)量的下降，這種調(diào)控反芻動物甲烷釋放的機制引起人們的 興趣。目前，國內(nèi)外已對絞股藍皂甙在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應用有了廣泛的研究，且作為飼料 添加劑在單胃動物養(yǎng)殖中已開始應用，如豬、雞等。作為飼料添加劑用于調(diào)控反芻動物瘤胃 微生物發(fā)酵，減少反芻動物瘤胃微生物甲烷產(chǎn)生的作用效果尚未報道。
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種簡單、可靠的方法減少反芻動物瘤胃內(nèi)甲烷的產(chǎn)生，提 高飼料能量利用效率，緩解來自反芻動物瘤胃甲烷氣體對環(huán)境的污染。該天然植物提取物 可以在反芻動物正常飼養(yǎng)過程中使用，符合綠色飼料添加劑要求。技術(shù)方案本發(fā)明是采用體外試驗和動物試驗，結(jié)合PCR/DGGE和Real time PCR技術(shù)，分析 絞股藍皂甙對反芻動物瘤胃甲烷產(chǎn)量和微生物區(qū)系的影響，最終確定絞股藍皂甙可以用作 反芻動物瘤胃微生物發(fā)酵的調(diào)控劑，以減少甲烷產(chǎn)生，提高飼料能量利用率，緩解甲烷對大 氣環(huán)境的污染。本發(fā)明所提供絞股藍皂甙用于減少動物瘤胃內(nèi)甲烷產(chǎn)生的方法為，其特征在 于，使用絞股藍皂甙，按0. 05-0. 30g/kg. B. W劑量即基于每公斤反芻動物體重，每天添加 0. 05-0. 30g絞股藍皂甙，每天分早晚兩次拌料飼喂。有益效果絞股藍皂甙作為反芻動物特種飼料添加劑，屬于新的生物技術(shù)。絞股藍皂甙作為 抑菌、殺菌和消炎等作用。根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，絞股藍皂甙對瘤胃原蟲產(chǎn)生毒性作用，減少原蟲 數(shù)量，進而減少與其共生產(chǎn)甲烷菌數(shù)量，達到減少甲烷的合成，降低甲烷釋放造成的能量損 失，提高飼料能量利用效率，緩解甲烷對大氣環(huán)境的污染。結(jié)果表明，添加低劑量絞股藍皂 甙(10mg/60mL培養(yǎng)液)能夠提高瘤胃微生物揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量，對甲烷產(chǎn)量有顯著的抑制 作用。耐受性試驗中，利用產(chǎn)甲烷菌特異性引物擴增的PCR產(chǎn)物進行DGGE分析顯示，絞股 藍皂甙改變了產(chǎn)甲烷菌的區(qū)系，一些優(yōu)勢產(chǎn)甲烷菌消失。與對照組比較，絞股藍皂甙組產(chǎn)甲 烷菌數(shù)量降低50%以上，瘤胃原蟲降低27%。添加絞股藍皂甙降低了與原蟲共生產(chǎn)甲烷菌 數(shù)量，且對瘤胃液中游離產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)生抑制作用。同時絞股藍皂甙組的真菌數(shù)量提高50% 以上，黃化瘤胃球菌近3倍，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌32%，說明絞股藍皂甙對幾種纖維降解菌有 促進作用。血液生化指標結(jié)果顯示，如血糖，膽固醇，甘油三酯，血液尿素氮和血清總蛋白都 沒有發(fā)生顯著變化，表明該皂甙可作為反芻動物添加劑使用，符合綠色飼料添加劑要求，對 動物無毒副作用。本發(fā)明中技術(shù)使用方便，使用效果好。本發(fā)明具有降低反芻動物瘤胃微生物甲烷 生成，提高飼料能量利用率，降低甲烷對環(huán)境的污染，保護地球生態(tài)環(huán)境的重要意義。
四

圖1添加絞股藍皂甙后山羊瘤胃產(chǎn)甲烷菌區(qū)系的DGGE圖譜圖中箭頭所示為皂甙處理后產(chǎn)甲烷菌消失條帶。圖中A，B，C和D代表4只山羊；M，marker ；1，2，3和4，代表對照及三個處理組。圖2添加皂甙后六次傳代培養(yǎng)液中產(chǎn)甲烷菌區(qū)系的DGGE圖譜圖中箭頭所示為皂甙處理后產(chǎn)甲烷菌消失條帶。G0-G6，傳代次數(shù)；C和T，對照組和處理組。五具體實施例方式絞股藍皂甙來自陜西康威生物工程有限公司產(chǎn)品，含量彡98%。下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步描述。實施例1 絞股藍皂甙對山羊瘤胃微生物數(shù)量的影響4只一歲、體重約為30士2kg的具有瘤胃瘺管的波爾公山羊，采用4X4拉丁方試驗 設計。整個試驗期為64天，分4期。每期16天，11天預試期，5天采樣期。處理組絞股藍 皂甙的添加量每天為0. 067,0. 133和0. 267g/kg. B. W，對照組不添加絞股藍皂甙，分早晚兩 次飼喂。早晨飼喂前采集瘤胃液，提取總DNA，利用黃化瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和真 菌的特異性引物(Denman SE，et al. ,2006. Development of a real-time PCR assay for monitoring anaerobic fungal and cellulolytic bacterial populations within the rumen. FEMS Microbiol Ecol，58，572-582)及產(chǎn)甲燒菌的特異性引物(Denman SE，et al.， 2007.Quantitation and diversity analysis of ruminal methanogenic populations in response to the antimethanogenic compound bromochloromethane. FEMS Microbiol Ecol,62, 313-322)對微生物進行定量分析，4對引物擴增的片段長度分別為132，121，120 和140bp。利用血細胞計數(shù)板對原蟲進行計數(shù)。利用產(chǎn)甲烷的特異性引物519/915(Cheng YF,et al. ,2009. Molecular diversity analysis of rumen methanogenic archaea from goat in eastern China by DGGE methods using different primer pairs. Letters in Applied Microbiology, 48 585-592)結(jié)合DGGE技術(shù)對山羊瘤胃產(chǎn)甲烷菌區(qū)系進行分析， 此引物擴增片段長度為400bp左右。飼喂前和飼喂后3h頸靜脈采血并析出血清，分析相關(guān) 血液生化指標。試驗結(jié)果見表1，與對照組比較，其中0. 067g/kg. B. W組產(chǎn)甲烷菌數(shù)量下降50%以 上，瘤胃原蟲下降27%，結(jié)果顯示添加絞股藍皂甙降低了與原蟲共生產(chǎn)甲烷菌數(shù)量及瘤胃 原蟲數(shù)量。0. 067g/kg. B. W組瘤胃真菌數(shù)量提高50%以上，黃化瘤胃球菌提高近3倍，產(chǎn)琥 珀酸絲狀桿菌提高32%，結(jié)果說明添加低劑量絞股藍皂甙可促進瘤胃主要纖維降解菌的增 殖，從而在一定程度上影響甲烷生成前體氫的供應量。高劑量組(0. 133g/kg.B.W和 0. 267g/kg. B. W)對真菌和纖維降解菌產(chǎn)生顯著的抑制作用，說明高劑量組可抑制甲烷生 成前體一一氫的形成。DGGE圖譜上代表不同種優(yōu)勢產(chǎn)甲烷菌的條帶發(fā)生變化(擴增16S rRNA片段的堿基長度相似，但堿基存在差別，在DGGE膠上處在不同位置，代表不同的產(chǎn)甲 烷菌)，其中5條優(yōu)勢產(chǎn)甲烷菌消失(如圖1中箭頭所示)。對山羊血液生化指標沒有顯著 影響，見表2。表明低劑量絞股藍皂甙(0. 067g/kg. B. W)可抑制瘤胃原蟲和產(chǎn)甲烷菌數(shù)量， 同時促進纖維降解真菌與細菌的生長，對山羊正常的生理代謝無負面影響。實施例2 絞股藍皂甙對瘤胃微生物甲烷生成的影響早晨飼喂前通過瘤胃瘺管采集波爾山羊瘤胃液，四層紗布過濾后作為接種物，瘤 胃液與已預熱的厭氧微生物培養(yǎng)基按1 2的比例混合，成為培養(yǎng)液。(培養(yǎng)基由微量 元素A液，緩沖液B，緩沖液C，D液和還原劑溶液E組成。其中A液為每IOOmL蒸餾水中 加 Λ CaCl2 · 2Η20 13. 2g, MnCl2 · 4H20 10. Og, CoCl2 · 6Η201· Og, FeCl3 · 6H20 8. Og, B 液 為IL蒸餾水中加入NH4HCO3 4. 0g, NaHCO3 35. 0g, C液為IL蒸餾水中加入Na2HPO4 5. 7g， KH2PO4 6. 2g，MgSO4 · 7H20 0. 6g，D液為0. 的刃天青溶液，E液為每IOOmL蒸餾水中加入 鹽酸半胱氨0. 625gNa0H160mg, Na2S · 9H20 0. 625g。培養(yǎng)基配制過程:400mL蒸餾水中加入0. ImL溶液A，200ml溶液C，Iml刃天青溶液，用CO2飽和保存于39°C恒溫水浴箱中5_6 小時，再加入40ml還原劑溶液E，混勻，用CO2飽和，并加熱至39°C )。采用厭氧體外批次 培養(yǎng)技術(shù)(Theodorou MK, et al. , 1995. Determination of growth of anaerobic fungi on soluble and cellulosic substrates using a pressure transducer. Microbiology, 141，671-678)進行體外發(fā)酵，厭氧條件下將培養(yǎng)液60mL分裝到已加入底物及絞股藍皂甙 的發(fā)酵瓶中后，密閉。底物0.6g，由粗料和精料按7 3組成(即0.42g羊草和0. 18g精 料)，精料由玉米和豆粕按7 3組成(即0. 126g玉米和0.054g豆粕)，試驗組絞股藍皂 試添加量分別為5，10，20和40mg，對照組不添加絞股藍皂甙，39°C發(fā)酵24小時，利用氣相色 譜儀測定發(fā)酵氣體中的甲烷濃度。試驗結(jié)果，絞股藍皂甙處理組甲烷濃度分別下降2. 3%，9. 4%，6. 9%和20. 7%。實施例3 絞股藍皂甙對多次傳代后產(chǎn)甲烷菌區(qū)系的影響利用體外批次培養(yǎng)技術(shù)進行發(fā)酵，培養(yǎng)基配制及底物的量和比例同實施例2。在厭 氧條件下向已加入底物和絞股藍皂甙的發(fā)酵瓶中分裝50mL培養(yǎng)基，試驗組絞股藍皂甙添 加量分別為5、10和20mg，對照組不添加絞股藍皂甙，密閉121°C滅菌15min。39°C條件下6 次傳代培養(yǎng)，第一代接種物為早晨飼喂前四層紗布過濾的波爾山羊瘤胃液10ml，后5代接 種物依次為上代發(fā)酵24h的無污染發(fā)酵液IOml (接種物與培養(yǎng)基的比例是1 5)。每代發(fā) 酵結(jié)束時，采集發(fā)酵液提取總DNA，禾Ij用產(chǎn)甲烷菌特異性引物519/915和DGGE技術(shù)分析對照 組和20mg組產(chǎn)甲烷菌區(qū)系(同實施例1)。試驗結(jié)果，經(jīng)過6次傳代，絞股藍皂甙處理組產(chǎn)甲烷菌的區(qū)系產(chǎn)生很大的變化，7 條優(yōu)勢產(chǎn)甲烷菌條帶從DGGE圖上消失(如圖2中箭頭所示)，表明絞股藍皂甙能夠抑制產(chǎn) 甲烷菌。以上結(jié)果表明，絞股藍皂甙能夠降低反芻動物瘤胃甲烷生成，改變瘤胃產(chǎn)甲烷菌區(qū) 系，一些優(yōu)勢產(chǎn)甲烷菌消失。表1絞股藍皂甙對山羊瘤胃微生物數(shù)量的影響
黃化瘤胃球菌(X103)0. 3741.0540. 1990. 2500.1450.130. 3330. 269產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(X10_3)1. 2931.7130. 2580. 1890.216<0.010. 0110. 545真菌(X103)0. 2710. 6330. 2580. 1220.0840.170. 2690. 136產(chǎn)甲烷菌0. 5810. 2030. 2290. 2270.0450.020.0450. 242原蟲總數(shù)(105/ml)9. 668. 397.617. 020,.03<0.01<0.010. 57
注τ，顯著性；L，線性效應；Q，二次方效應t 表2絞股藍對山羊血液生化指標的影響指標
時間 皂甙劑量(g/d. kg體重)
顯著性lvalue 注T，顯著性；L，線性效應；Q，二次方效應
權(quán)利要求
絞股藍皂甙作為減少反芻動物瘤胃內(nèi)甲烷產(chǎn)生的飼用添加劑的應用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述絞股藍皂甙作為降低瘤胃內(nèi)甲烷產(chǎn)生的飼料添加劑的應用，其 特征在于來源于各類植物提取的絞股藍皂甙。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的絞股藍皂甙作為降低瘤胃發(fā)酵產(chǎn)甲烷的飼料添加 劑的應用，其特征在于所述的絞股藍皂甙的用量為，按每公斤反芻動物體重每天添加 0. 05-0. 30g絞股藍皂甙，分兩次早晚拌料飼喂。
全文摘要
本發(fā)明涉及絞股藍皂甙用于減少動物瘤胃內(nèi)甲烷產(chǎn)生的方法，屬于添加劑的使用方法，按每公斤體重添加0.05-0.30克絞股藍皂甙，每天分早晚兩次拌料飼喂。添加絞股藍皂甙改變了山羊瘤胃產(chǎn)甲烷菌區(qū)系，一些產(chǎn)甲烷優(yōu)勢菌在皂甙處理后消失，產(chǎn)甲烷菌數(shù)量下降50％以上。體外批次發(fā)酵試驗證實，添加絞股藍皂甙后甲烷濃度分別下降2.3％，9.4％，6.9％和20.7％。本發(fā)明結(jié)果說明，在飼料中添加絞股藍皂甙可減少瘤胃甲烷產(chǎn)量，提高飼料能量利用效率，降低反芻動物養(yǎng)殖業(yè)中反芻動物瘤胃發(fā)酵所產(chǎn)甲烷對大氣環(huán)境的污染。
文檔編號A23K1/18GK101904418SQ20101024802
公開日2010年12月8日 申請日期2010年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月6日
發(fā)明者朱偉云, 毛勝勇, 王新峰 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學