專利名稱：花生根瘤Fe(Ⅱ)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、生理學(xué)以及基因工程等領(lǐng)域，具體地說，涉及一種來源于 豆科作物花生根瘤的Fe (II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因。
背景技術(shù)：
氮素是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最重要的養(yǎng)分之一，多年來，為了維持或提高作物產(chǎn)量，化學(xué)氮 肥用量不斷增加，給能源的需求和持續(xù)供應(yīng)帶來了巨大壓力；同時(shí)，由于氮肥利用效率低， 大量氮肥通過氨揮發(fā)，反硝化和淋溶徑流等途徑進(jìn)入大氣、水體環(huán)境或盈余在農(nóng)田生態(tài)系 統(tǒng)中，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染和食品安全等問題，嚴(yán)重威脅著人類健康和生態(tài)系統(tǒng)的平衡 穩(wěn)定，也已經(jīng)成為世界關(guān)注的科學(xué)熱點(diǎn)問題。但值得關(guān)注的是豆科植物與根瘤菌在根際微 生態(tài)系統(tǒng)中形成的根瘤共生體，不但是一個(gè)高效的共生固氮體系而且是一個(gè)環(huán)境友好的共 生系統(tǒng)，豆科作物可以通過高效的固氮作用減少對(duì)肥料氮的需求，從而能夠提高作物產(chǎn)量 和達(dá)到環(huán)境保護(hù)，因此，挖掘豆科植物的生物固氮潛力對(duì)于可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展具有重要的 理論和實(shí)踐意義。根瘤是由豆科植物根皮層細(xì)胞分化增生而形成的組織，當(dāng)根瘤菌產(chǎn)生的結(jié)瘤因子 與寄主植物專一性識(shí)別后，寄主植物根表皮細(xì)胞、皮層細(xì)胞和中柱鞘細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)并形成 侵染線和根瘤原基，接著根瘤菌通過侵染線進(jìn)入根瘤原基細(xì)胞內(nèi)大量增殖，同時(shí)根瘤原基 細(xì)胞不斷分裂，突出根表形成能夠進(jìn)行生物固氮的根瘤。這主要是由于專一識(shí)別后根瘤菌 和寄主豆科植物在各自的代謝方式和形態(tài)結(jié)構(gòu)上會(huì)發(fā)生相應(yīng)改變，共同構(gòu)建出一個(gè)厭氧、 高效的固氮環(huán)境。具體來講，根瘤菌的形態(tài)由桿狀變?yōu)榍驙?類菌體)，被起源于寄主細(xì) 胞質(zhì)膜的一層稱為類菌體周膜(PBM)的生物膜所包裹，形成一個(gè)類似于細(xì)胞器的共生體， 該共生體由類菌體(bacteroid)、類菌體周膜(PBM) (peribacteroid membrane)和介于二 者之間的空間(PBS) (peribacteroid space)所組成(White L. F. , Day D. Α. , 1997. The peribacteroid membrane. Physiologia PIantarum. 100 :30_44)。#生/[本形@后，二者] 禾 共生的關(guān)系便開始了，豆科植物將部分光合作用合成的碳源和根系吸收的必需營養(yǎng)元素如 氮、磷和微量元素如鐵等提供給類菌體，以滿足其生長(zhǎng)及固氮所需，同時(shí)類菌體將固定的氮 素供給豆科植物所用。在二者互惠的過程中，交換的能量和營養(yǎng)物質(zhì)需借助類菌體周膜上 的轉(zhuǎn)運(yùn)通道或運(yùn)輸載體跨過類菌體周膜，供給對(duì)方，因此，類菌體周膜上運(yùn)輸載體及其轉(zhuǎn)運(yùn) 能力的研究極為重要。鐵是直接參與豆科作物共生固氮的重要營養(yǎng)元素之一，在共生體形成、根瘤發(fā)育、 類菌體高效固氮等各個(gè)環(huán)節(jié)都發(fā)揮著重要的作用。它是固氮酶、豆血紅蛋白、鐵氧還蛋白 等含鐵蛋白的重要金屬組分(Dakora，D. F. 1995. A functional relationship between leghaemogbin and nitrogenase based on novel measurements of the proteins in legume root nodules. Annals of Botany. 15 :49_54.),而根瘤的固氮酶活性禾口豆血紅蛋 白含量是評(píng)價(jià)根瘤固氮能力的兩個(gè)重要指標(biāo)。研究表明共生固氮體系對(duì)鐵的相對(duì)需求程 度比豆科植物本身還要高，可見，鐵元素的充足供給是高效共生的重要保障，因此，揭示鐵元素跨類菌體周膜(PBM)運(yùn)輸?shù)耐緩绞菫檫M(jìn)一步如何調(diào)控豆科植物并增強(qiáng)其共生固氮功 能發(fā)揮的重要研究?jī)?nèi)容。研究表明跨越類菌體周膜(PBM)運(yùn)輸進(jìn)入類菌體的鐵主要有兩 種方式一種是類菌體直接吸收和利用含鐵化合物如檸檬酸鐵(III)，第二種是植物細(xì)胞 中Fe(II)通過PBM上的Fe(II)運(yùn)輸載體進(jìn)入共生體內(nèi)部，事實(shí)上類菌體更容易利用通 過 Fe (II)運(yùn)輸載體運(yùn)輸?shù)?Fe (II) (Levier K.，Day D. Α.，Guerinot Μ. L. Iron uptake by symbiosomes from soybean root nodules. Plant Physiology.1996. Ill :893_900)。
Kaiser等(2003)首次從大豆根瘤中分離鑒定出一個(gè)定位于類菌體周膜，而且與 二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體NRAMP基因家族高度同源的GmDmtl ；1運(yùn)輸載體。該基因具有較強(qiáng) 的跨膜運(yùn)輸Fe(II)的能力，而且該基因在大豆根瘤尤其是發(fā)育成熟具有固氮能力的根瘤 中強(qiáng)烈表達(dá)，表明了這個(gè)鐵的運(yùn)輸載體在跨類菌體周膜運(yùn)輸二價(jià)鐵進(jìn)入共生體并進(jìn)而滿 足共生固氮對(duì)鐵的不斷需求上發(fā)揮著重要的作用(Kaiser BN, Moreau S，Castelli J，et al. The soybean NRAMP homo1οgue,GmDMTl,is a symbiotic divalent metal transporter capable of ferrous iron transport. Plant Journal. 2003. 35:295_304.)。NRAMP 基 S MiM (natural resistanceassociated macro-phage protein) i 一 ^ W ^； ^ IM 運(yùn)二價(jià)金屬離子的基因，它不僅轉(zhuǎn)運(yùn)Fe2+，還能轉(zhuǎn)運(yùn)其他二價(jià)金屬陽離子，如Cd2+、Zn2+、 Cu2+、Mn2+等，因而該家族基因?qū)D(zhuǎn)運(yùn)、儲(chǔ)存金屬離子以及維持細(xì)胞內(nèi)金屬離子平衡具有重 要作用(Rosakis A, Koster W. Divalent metal transport in the green microalga, Chlamydomonas reinhardtii is mediated by a protein similar to prokaryotic Nramp homolgues. BioMetals 2005 ；18 :107_120)。花生(Arachis hypogaea L.)是繼大豆之后另一個(gè)重要的油料作物，同時(shí)也是能 夠進(jìn)行生物固氮的豆科植物，對(duì)于鐵營養(yǎng)而言，從生理水平來講，大豆和花生都屬于缺鐵適 應(yīng)性反應(yīng)為機(jī)理I的植物，從遺傳背景而言，二者染色體和基因組大小也非常相似，在石灰 性土壤上，花生非常容易缺鐵黃化從而導(dǎo)致其產(chǎn)量和品質(zhì)的下降，這主要是由于鐵營養(yǎng)不 僅影響花生的正常生長(zhǎng)和發(fā)育，同時(shí)也影響其生物固氮，因此，提高花生鐵的利用效率和根 瘤固氮能力具有重要的實(shí)踐意義和生態(tài)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的為提供一種花生根瘤Fe (II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的花生根瘤Fe (II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其具有如SEQ ID No. 1 所示的氨基酸序列或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的 氨基酸序列。編碼前述花生根瘤Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因，其具有如SEQ ID No. 2所示的核苷酸 序列。含有編碼前述花生根瘤Fe (II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因或其片段的載體及含有該載體的宿主。含有編碼前述花生根瘤Fe (II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因或其片段的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。編碼前述花生根瘤Fe (II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因或其片段在提高植物鐵的利用效率和 根瘤固氮能力中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種用于擴(kuò)增前述花生根瘤Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的引物，包括正向引物 5 ‘ -DMT-F 5 ‘ -ACGCGGGGGAGCATAAATGTGGAAACACCACTAGCAT-3 ‘，以及反向引 物 3' -DMT-R 5' -AACTATGATGTTCAAAGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'。本發(fā)明提供的花生根瘤Fe (II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，名稱為AhDmtl，是具有序列表中SEQ ID No 1所示的氨基酸序列或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等 功能的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；序列表中的SEQ ID No :1由504個(gè)氨基酸組成 ，該蛋白自N端 第1位氨基酸到第25位氨基酸是其信號(hào)肽序列，其N-末端位于膜外，而C-末端位于膜內(nèi)， 具有11個(gè)典型的跨膜序列，分別為序列1 :46-68aa ；序列2 :75_97aa ；序列3 :154_176aa ； 序列 4 :183-205aa ；序列 5 :225_244aa ；序列 6 :265_287aa ；序列 7 :319_341aa ；序列 8 362-384aa ；序列 9 :399_416aa ；序列 10 :429_451aa ；序列 11 :484_504aa。其中序列 2-序 列10共9個(gè)跨膜區(qū)是典型的NRAMP功能區(qū)，并且在第7和第8區(qū)域之間具有NRAMP基因家 族同源蛋白典型的鐵轉(zhuǎn)移序列，表明該基因?qū)儆贜RAMP基因家族。上述花生根瘤Fe (II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因(AhDmtl)，具有序列表中SEQ ID No :2所 示的核苷酸序列；序列表中SEQ ID No 2為花生根瘤AhDmtl全長(zhǎng)cDNA序列，包括5'-端 UTR，蛋白編碼區(qū)和3' -UTR包括poly (A)，共有1898bp組成，分別為5' -UTR(l_156bp)和 3' -UTR(1674-1989bp)，中間區(qū)域?yàn)榈鞍拙幋a區(qū)(157_1673bp)。本發(fā)明利用上述含有AhDmtl基因的表達(dá)載體pYES2_AhDmtl、pDR195_AhDmtl和 轉(zhuǎn)入pYES2-AhDmtl、pDR195_AhDmtl表達(dá)載體的酵母突變體進(jìn)行酵母異源表達(dá)功能驗(yàn)證， 結(jié)果表明花生根瘤AhDmtl轉(zhuǎn)運(yùn)體能夠轉(zhuǎn)運(yùn)Fe2+、Mn2+，但是不能轉(zhuǎn)移Zn2+，同時(shí)證明其轉(zhuǎn)運(yùn) Fe2+的過程是依賴質(zhì)子的。本發(fā)明還根據(jù)序列表中SEQ ID No: 2設(shè)計(jì)AhDmtl基因?qū)Ｒ恍砸铮肦T-PCR 技術(shù)分析其組織表達(dá)情況，結(jié)果表明AhDmtl基因主要在花生根瘤中表達(dá)，在葉片、根部的 表達(dá)量很低。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)并證明了花生根瘤中二價(jià)鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因，揭示了 豆科植物與根瘤菌共生固氮過程中鐵元素的轉(zhuǎn)運(yùn)、利用方式，為通過基因工程技術(shù)提高豆 科植物鐵利用效率、發(fā)揮根瘤高效固氮潛力提供了必要的理論依據(jù)和技術(shù)支持，具有較大 的應(yīng)用前景。


圖1為本發(fā)明花生根瘤AhDmtl基因cDNA序列片段PCR擴(kuò)增結(jié)果；圖2為本發(fā)明花生根瘤AhDmtl基因的5，RACE PCR擴(kuò)增結(jié)果；圖3為本發(fā)明花生根瘤AhDmtl基因的3，RACE PCR擴(kuò)增結(jié)果；圖4為本發(fā)明花生根瘤AhDmtl基因全長(zhǎng)cDNA序列PCR擴(kuò)增結(jié)果；圖5A為本發(fā)明酵母表達(dá)載體pDDl圖譜；圖5B為本發(fā)明酵母表達(dá)載體pYDl圖譜；圖6A為本發(fā)明酵母表達(dá)載體pDDl鑒定結(jié)果；圖6B為本發(fā)明酵母表達(dá)載體pYDl鑒定結(jié)果；圖7為酵母異源功能互補(bǔ)驗(yàn)證AhDmtl轉(zhuǎn)運(yùn)二價(jià)鐵離子的功能；圖8為酵母驗(yàn)證AhDmtl轉(zhuǎn)運(yùn)二價(jià)鐵離子受pH的影響；圖9為酵母異源功能互補(bǔ)驗(yàn)證AhDmtl轉(zhuǎn)運(yùn)二價(jià)錳離子的功能；
圖10為酵母異源功能互補(bǔ)驗(yàn)證AhDmtl轉(zhuǎn)運(yùn)二價(jià)鋅離子的功能；圖11為本發(fā)明AhDmtl基因在花生不同器官中的表達(dá)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。以下實(shí)施例中涉及的材料及來源1.花生(Arachis hypogaea L.)品種魯花14號(hào)，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院；2.花生根瘤菌菌種05272，購自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院；3.酵母菌株(由首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院印莉萍教授惠贈(zèng))DEY1453 (fet3-2: HIS3/fet3_2 :HIS3, fet4_l: LEU2/fet4_l :LEU2, ade2/+ura3/ura3 trpl/trpl 1 eu2/lue2 his3/his3 canl/canl)DEY1457(MAT ade6 canl his3 leu2.trpl ura3)SMFl(MATa ade2 his3 leu2 trpl ura3 smfl::URA3 ura3::TRP1)ZHY3(MATa ade6 canl his3 leu2 trpl ura3 zrtl::LEU2 zrt2::HIS3)(Vert G. ,Briat J. F. , and Curie C. ,2001, Arabidopsis IRT2 gene encodes a root-periphery iron transporter. The Plant Journal, 26 (2) : 181—189 中包f舌上述酵母 體的使用描述)；4.大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞購自TIANGEN公司；Τ0Ρ10感受態(tài)細(xì)胞購自 invitrogen 公司；5. pMD20-T購自TAKARA公司；酵母表達(dá)載體pDR195由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境 學(xué)院袁立行教授惠贈(zèng)(Thomine S, Wang R, Ward MJ, Crawford 匪，Schroeder JI (2000) Cadmium and iron transport by members of a plant metal transporter family in Arabidopsis with homology to Nrampgenes. Proc Natl Acad Sci USA 97 :4991_4996中 使用該載體進(jìn)行試驗(yàn))，PYES2為invitrogen公司產(chǎn)品；6.質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、Amp抗生素 購自天根生物技術(shù)公司；T4連接酶、限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；各種氨基酸、鮭魚精DNA 購自北京拜爾迪公司；Trizol試劑、Super Script II陰性逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒、Taq等DNA聚 合酶、3' RACE試劑盒為invitrogen公司產(chǎn)品，5' RACE試劑盒為clonetech產(chǎn)品，RT-PCR 試劑、SYBE GREEN為東洋紡產(chǎn)品；其他主要化學(xué)試劑為國產(chǎn)AR級(jí)試劑。以下實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用引物均由上海生物工程 公司合成，DNA測(cè)序工作由上海英俊生物技術(shù)有限公司和上海生物工程公司完成。實(shí)施例1花生根瘤Fe (II)轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白及其編碼基因的獲得一、花生根瘤材料的獲得將花生種子用去離子水洗凈，用10%的雙氧水浸泡20-30分鐘后，用高純水將種子洗干凈，然后放入飽和硫酸鈣中浸泡6-7小時(shí)，取出種子，洗凈擺放在托盤中潤濕的吸水 紙上，然后蓋上潤濕的吸水紙，避光催芽；待種子露白后，將其放入根瘤菌液中浸泡20分鐘 (菌液濃度為1 X IO7個(gè)細(xì)胞/毫升)進(jìn)行接種，然后將接種后的種子播種于石英砂中，避光 發(fā)苗。待花生長(zhǎng)出兩片子葉后，將花生植株移入促進(jìn)根瘤形成的低氮營養(yǎng)液中培養(yǎng)，營養(yǎng)液 中各養(yǎng)分含量為ΚΝ03(3· 2mM)、KH2PO4 (1. ImM)、MgSO4 · 7H20 (0. 6mM)、CaSO4 · 2H20 (4. 32mM)、H3BO3 (50 μ Μ)、MnSO4 · 4Η20 (0. 77 μ Μ)、ZnSO4 · 7Η20 (0. 77 μ Μ)、CuSO4 · 5Η20 (0. 3 μ Μ)、
(NH4) 6Μο7024 · 4Η20 (0. 02 μ Μ)、EDTA-Fe (80 μ Μ)，ρΗ 值為 5. 8。培養(yǎng)過程中，保持通氣，培養(yǎng) 條件為光照28°C，16h/黑暗22°C，8h。待根瘤形成后，花生停止供鐵，缺鐵三天后取根瘤樣 品，液氮速凍，_80°C保存。二、花生根瘤總RNA的提取和cDNA第一條鏈的合成1.花生根瘤總RNA提取采用Trizol法。
2. cDNA第一條鏈的合成(1)用于AhDmtl基因cDNA中間片段及全長(zhǎng)序列擴(kuò)增的cDNA第一條鏈?zhǔn)抢?invitrogen公司的Super ScriptII陰性逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒，以O(shè)ligo (dT)15為引物，42°C進(jìn) 行RT-PCR合成。(2)用于AhDmtl基因5，端cDNA序列擴(kuò)增的cDNA第一條鏈?zhǔn)抢胏lonetech RNA 反轉(zhuǎn)錄5，末端交換機(jī)制cDNA末端快速克隆試劑盒(SMART RACE cDNA Amplification Kit)合成，用于5' RACE的預(yù)備cDNA。具體合成方法如下向離心管中加入以下混合物， 輕輕混勻，簡(jiǎn)短離心收集混合物，反應(yīng)混合物如表1所示表 1 70°C加熱2分鐘，然后置于冰上2分鐘；簡(jiǎn)短離心約10秒，收集混合物于管底，力口 入表2中的反應(yīng)混合物表2
反應(yīng)混合物_體積(μ ) 輕輕吹吸混勻以上反應(yīng)液，簡(jiǎn)短離心后42°C溫浴1.5小時(shí)，然后加入ΙΟΟμ 1 Tricine-EDTA緩沖液[N-三(羥甲基)甲基甘氨酸-乙二胺四乙酸緩沖液]稀釋反應(yīng)產(chǎn) 物，最后72°C加熱7分鐘，終止反應(yīng)。-20°C保存合成的cDNA樣品，用于AhDmtl5，端cDNA 片段的擴(kuò)增。(3)用于AhDmtl基因3，端cDNA序列擴(kuò)增的cDNA第一條鏈?zhǔn)抢肐nvitrogencDNA-3，末端快速克隆試劑盒(3' RACE system ForRapid Amplification of cDNA Ends) 合成的。具體合成方法如下首先，向離心管中加入表3中的反應(yīng)混合物表3 輕輕混勻，簡(jiǎn)短離心后收集反應(yīng)物，70°C水浴加熱10分鐘，冰上冷卻至少1分鐘， 然后加入表4中的反應(yīng)混合物表 4 輕輕混勻，簡(jiǎn)短離心后，42°C水浴3分鐘，加入1 μ 1 Super Script陰性逆轉(zhuǎn)錄酶， 42°C水浴50分鐘，70°C水浴15分鐘，冰上冷卻，簡(jiǎn)短離心后，加入1 μ 1 RNase H，37°C水浴 20分鐘，結(jié)束反應(yīng)，-20°C保存。三、AhDmtl基因cDNA序列的克隆1.引物設(shè)計(jì)以大豆根瘤GmDmtl基因cDNA序列為基礎(chǔ)，通過對(duì)GmDmtl與其所屬NRAMP基因 家族中其它同源基因進(jìn)行蛋白序列比對(duì)分析，找到該基因家族在不同植物中高度保守的蛋 白序列區(qū)域，然后根據(jù)分子進(jìn)化和比較基因組學(xué)的原理，選用GmDmtl基因中高度保守區(qū)域 對(duì)應(yīng)的cDNA序列設(shè)計(jì)同源專一性外側(cè)(WF1、WR1)和內(nèi)側(cè)(NFl、NRl)雙重嵌套引物，通過 兩輪嵌套式PCR從花生根瘤中擴(kuò)增出AhDmtl基因的cDNA中間片段；然后根據(jù)獲得的cDNA 片段分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增3，端和5，端cDNA序列的基因?qū)Ｒ恍砸?3GSP、5GSP)配合3' RACE、 5' RACE(3‘ and 5' RACE system For Rapid Amplification of cDNA Ends 3，/5，_cDNA 末端快速克隆試劑盒)試劑盒中提供的引物，分別擴(kuò)增得到花生根瘤AhDmtl的3'端cDNA 片段和5'端cDNA片段，最后將上述經(jīng)測(cè)序證實(shí)的花生根瘤AhDmtl的5'端cDNA片段、中 間片段和3'端cDNA片段進(jìn)行比較分析，利用DNA和蛋白翻譯序列(DNAman程序)發(fā)現(xiàn)重疊 序列后拼接得到包括5' UTR，ATG-TGA和3' UTR-poly(A)的AhDmtl正確的全長(zhǎng)cDNA，最后 根據(jù)該拼接后的序列設(shè)計(jì)基因?qū)Ｒ恍砸?Dmt-F、Dmt-R)，用于PCR獲得花生根瘤AhDmtl 完整的cDNA序列，具體引物序列如表5所示表5
2. PCR反應(yīng)體系(I)AhDmtl基因cDNA序列片段的獲得以上述反轉(zhuǎn)錄獲得的花生根瘤cDNA第一條鏈為模板，同源專一性外側(cè)(WF1、WR1) 和內(nèi)側(cè)(NF1、NR1)雙重嵌套引物，PCR擴(kuò)增AhDmtl基因cDNA序列片段，PCR反應(yīng)體系如下第一步利用外側(cè)引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系(50 μ 1)如表6所示表6 將各反應(yīng)物混勻后進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)條件為先94°C預(yù)變性4min ；92°C變性30S ； 45°C退火30S ；72°C延伸2min ；40個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。
第二步以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，利用內(nèi)側(cè)引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系 (50 μ 1)如表7所示表 7 將各反應(yīng)物混勻后進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min，92°C變性30S ； 45°C退火30S ；72°C延伸2min ；40個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。經(jīng)過上述兩輪PCR擴(kuò)增，獲得大概860bp的目的基因片段(圖1，A為第一輪PCR 產(chǎn)物；B為第二輪PCR產(chǎn)物，M為DNA Markerl00bp-1500bp)，與預(yù)期的GmDmtl ；1同源基因 大小接近，將此PCR產(chǎn)物片段純化回收后，通過克隆載體pMD20-T，轉(zhuǎn)化至E. coli的DH5 α 感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行目的基因克隆，測(cè)序分析。將所得花生cDNA序列在NCBI中進(jìn)行同源序列比對(duì)分析(Blast)表明，該序列與 大豆(GmDmtl ； 1) cDNA保守一致性為82%，蛋白序列高達(dá)89%，說明花生中該基因片段與大 豆具有很好的同源性，也證明了花生根瘤中存在促進(jìn)鐵的跨膜吸收和利用(GmDmtl ；1)的 同源基因。(2) AhDmtl基因5，端cDNA序列的獲得利用clonetech RNA反轉(zhuǎn)錄5’末端交換機(jī)制cDNA末端快速克隆試劑盒(SMART RACE cDNA Amplification Kit)試劑盒通過 5' RACE 的方法獲得 AhDmtl 5，端 cDNA 片段。 PCR反應(yīng)體系如表8所示表 8 將各成分混合后進(jìn)行PCR反應(yīng)，程序如下1.變性94°C5min (預(yù)變性)2.變性94°C30s (變性)3.延伸72 °C3min (延伸)4.返回至2(5個(gè)循環(huán))5.變性94°C30s (變性)6.退火70°C30s (退火)7.延伸72°C3min (延伸)8.返回至5(5個(gè)循環(huán))9.變性94°C30s (變性)10.退火68°C30s (退火)11.延伸72°C3min (延伸)12.返回至9(25個(gè)循環(huán))13.延伸72°CIOmin (延伸)利用花生專一性引物和5' RACE反應(yīng)體系經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增之后，產(chǎn)物通過瓊脂 糖凝膠電泳檢測(cè)得到921bp的專一性片段(圖2)，與預(yù)測(cè)計(jì)算的花生理論上應(yīng)獲得cDNA片 段的大小相同，將該cDNA片段純化回收、進(jìn)行分子克隆和測(cè)序分析。該序列與上述獲得的 AhDmtl中間cDNA片段有完全一致的重疊序列(約300bp)，同時(shí)將該序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中 進(jìn)行同源性序列比對(duì)分析結(jié)果表明該序列與大豆(GmDmtl ； 1) DNA —致性為83%，證明該基 因片段為花生AhDmtl 5'端cDNA片段。(3) AhDmtl基因3，端cDNA序列的獲得利用Invitrogen cDNA-3，末端快速克隆試劑盒(3 ‘ RACE systemFor Rapid Amplification of cDNA Ends)通過 3' RACE 的方法獲得 AhDmtl 3'端 cDNA 片段。PCR 反應(yīng)體系如表9所示表9 將各成分混合后進(jìn)行PCR反應(yīng)，程序?yàn)?4°C預(yù)變性3min ；92°C變性30s ；60°C退 火 30s ；72°C延伸 2min ；40 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin0 利用花生專一性引物和3' RACE反應(yīng)體系經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增之后，產(chǎn)物通過瓊 脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到約IOOObp的專一性片段(圖3)，與預(yù)測(cè)計(jì)算的花生理論上應(yīng)獲 得cDNA片段的大小相同，將該cDNA片段進(jìn)行純化回收，進(jìn)行分子克隆和測(cè)序分析?；ㄉ?AhDmtl 3'端cDNA片段測(cè)序結(jié)果表明，該片段大小為981bp，與上述AhDmtl中間cDNA片段 有完全一致的重疊序列(約300bp)，同時(shí)將該序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性序列比對(duì)分 析(Blast)，結(jié)果表明該序列與大豆(GmDmtl ； 1) DNA保守一致性為84%，證明該基因片段為 花生AhDmtl 3'端cDNA片段。(4) AhDmtl 基因全長(zhǎng) cDNA (5 ‘ UTR 和 ATG-TGA 和 3 ‘ UTR-poly (A))的獲得以上述反轉(zhuǎn)錄獲得的花生根瘤cDNA第一條鏈為模板，5' -DMT-F和5' -DMT-R為 引物，PCR擴(kuò)增AhDmtl基因全長(zhǎng)cDNA序列。PCR反應(yīng)體系如表10所示表10 將各成分混合后進(jìn)行PCR反應(yīng)，程序?yàn)?4°C預(yù)變性3min ；92°C變性30s ；45°C退 火 30s ；72°C延伸 2min ；35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin0
PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到約1900bp的片段(圖4)，與理論推 測(cè)基因大小相同，將該cDNA片段進(jìn)行純化回收，進(jìn)行分子克隆和測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果表 明，該片段大小為1898bp，該序列包括5'非翻譯區(qū)(5‘ UTR)、蛋白編碼區(qū)和3'非翻譯區(qū) (3' UTR)。同時(shí)將該序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性序列比對(duì)分析(Blast)，表明該序列 與大豆(GmDmtl ； 1)DNA保守一致性為83%，屬于NRAMP基因家族。實(shí)施例2酵母異源功能互補(bǔ)驗(yàn)證花生根瘤AhDmtl基因功能一.主要試劑配制及培養(yǎng)基配方1.主要試劑配制1. OM LiAC 10. 2g LiAC用稀的冰醋酸調(diào)pH至7. 5，加水定容至100ml，121°C滅菌 20min，室溫保存；50% PEG :50gPEG3350 加水定容到 100ml，121°C 滅菌 20mins，室溫保存；40%葡萄糖40g葡萄糖，加IOOml水，121°C滅菌20mins，4°C保存；IOmM BPDS 0. 1341g BPDS，加水定容至 25ml，過濾滅菌，4°C保存；0. 5MEDTA 3. 6531gEDTA，加水定容至 25ml，121°C滅菌 20min，4°C保存。2.培養(yǎng)基配方(1)細(xì)菌培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基IOg胰蛋白胨，5g酵母提取物，IOg NaCl，15g瓊脂粉(固體)，pH7. 0 ；(2)酵母培養(yǎng)基YPAD培養(yǎng)基20g蛋白胨，IOg酵母提取物，0.04g腺嘌呤半硫酸鹽，20g瓊脂粉(固 體)，pH 5.8 ；(3)酵母轉(zhuǎn)化子篩選培養(yǎng)基合成完全省卻成分培養(yǎng)基(Syntheticcomplete (SC) drop outmedium，縮寫為 SD
培養(yǎng)基)配方培養(yǎng)基成分用量(g)酵母氮基(不含氨基酸)6. 7腺嘌呤半硫酸鹽、精氨酸鹽酸鹽、組氨酸鹽酸鹽、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、蘇氨 0. 05酸、絡(luò)氨酸苯丙氨酸、色氨酸0.075纈氨酸0.225瓊脂粉20高純水950ml用NaOH調(diào)pH值至5. 8，121°C滅菌20min后，待培養(yǎng)基溫度降至55°C時(shí)，加入50ml 預(yù)熱的無菌40%葡萄糖。(4)酵母異源互補(bǔ)功能驗(yàn)證培養(yǎng)基DAhDmtl轉(zhuǎn)運(yùn)二價(jià)鐵離子功能驗(yàn)證SD+BPDS培養(yǎng)基SD培養(yǎng)基加入IOmM BPDS, 使其終濃度分別為0、55、80、100 μ M，pH為5. 8 ；同時(shí)用pH值分別為5、6、7、8，BPDS終濃度為80 μ M的培養(yǎng)基驗(yàn)證該轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)鐵的過程是否受pH值影響；2) AhDmtl轉(zhuǎn)運(yùn)二價(jià)錳離子功能驗(yàn)證SD+EGTA培養(yǎng)基SD培養(yǎng)基組成同前，再加入(7. 608g EGTA,使其終濃度為20mM, pH值為5. 8 ；3)AhDmtl轉(zhuǎn)運(yùn)二價(jià)鋅離子功能驗(yàn)證SD+EDTA培養(yǎng)基SD培養(yǎng)基中加入0.5M EDTA, 使其終濃度分別為0、0. ImM, PH值為5. 8。二.酵母表達(dá)載體構(gòu)建1.引物設(shè)計(jì) 分析載體pYES2、pDR195以及AhDmtl開放閱讀框序列中的酶切位點(diǎn)，選擇合適的 限制性內(nèi)切酶，利用其酶切位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)載體構(gòu)建的引物。具體引物序列如表11所示表11
構(gòu)建載體名稱 引物名稱引物序列酶切位點(diǎn) 下劃線標(biāo)注的核苷酸為使用的酶切位點(diǎn)序列。2.獲得兩端含有酶切位點(diǎn)序列的AhDmtl開放閱讀框序列以實(shí)施例1中克隆到的AhDmtl全長(zhǎng)cDNA(以質(zhì)粒形式保存)為模板，用上述引物 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如表12所示表12 將各成分混合后進(jìn)行PCR反應(yīng)，程序?yàn)?4°C預(yù)變性3min ；94°C變性30s ；60°C退 火30s ；72°C延伸2min ；30個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，將回收純化 的目的片段連入PMD20-T載體后，轉(zhuǎn)入DH5 α或TOPlO感受態(tài)細(xì)胞中，然后篩選陽性克隆菌 株及酶切鑒定，最后測(cè)序、分析確定兩端酶切位點(diǎn)序列及中間AhDmtl開放閱讀框核苷酸序 列完全正確的菌株。用該菌株提取pMD20-T+AhDmtl質(zhì)粒，用于載體構(gòu)建。
3. AhDmtl基因酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及其鑒定根據(jù)上述引入的酶切位點(diǎn)選擇相應(yīng)的內(nèi)切酶BamH Ι/Sphl或BamH Ι/Notl分別對(duì) 質(zhì)粒pMD20-T+AhDmtl、pDR195和pYES2進(jìn)行雙酶切，將回收到的AhDmtl酶切產(chǎn)物分別與 經(jīng)相同酶切后的載體用T4DNA連接酶于16°C連接12h，構(gòu)建含有AhDmtl基因的重組表達(dá)載 體，分別命名為PDDl (圖5A)、pYDl (圖5B)，將連接產(chǎn)物用熱激轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入DH5 α感受態(tài)細(xì) 胞中，然后用含有氨芐青霉素的LB平板，370C，培養(yǎng)過夜，初步篩選陽性重組質(zhì)粒。挑取單 菌落，370C，200rpm振蕩培養(yǎng)12h左右，小量提取質(zhì)粒，以提取的質(zhì)粒為模板，分別以與其對(duì) 應(yīng)的pYES-F/pYES-R或PDR-F/PDR-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)過1 %瓊脂糖凝膠 電泳分析均得到了一條約1500bp大小的條帶(圖6A)，與預(yù)期條帶大小相符；同時(shí)分別用 BamH Ι/sphl或BamH Ι/Notl雙酶切對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分析， 分別得到一條約6kb的載體帶和1. 5kb的目的條帶(圖6B)，與預(yù)期條帶相符，表明重組質(zhì) 粒構(gòu)建成功。三.酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化及成功轉(zhuǎn)化子的篩選1.表達(dá)載體轉(zhuǎn)入各酵母菌株首先，將待轉(zhuǎn)化酵母接種到5ml液體(2\八 々0培養(yǎng)基中，于301，200印111條件下 振蕩培養(yǎng)過夜。次日，計(jì)數(shù)過夜培養(yǎng)物細(xì)胞密度，以最終5X IO6個(gè)/ml的細(xì)胞密度(0D·= 0. 5)接種到50m YPAD培養(yǎng)基中，置于30°C，200rpm振蕩培養(yǎng)至2 X IO7個(gè)細(xì)胞/ml (OD600 = 2)后，3000g離心5min收集細(xì)胞，棄去上層培養(yǎng)液，把細(xì)胞懸浮在25ml無菌水中，再離心收 集細(xì)胞，棄水，把細(xì)胞懸浮在Iml無菌水中，轉(zhuǎn)移至無菌的1.5ml離心管中，離心，去上清，再 加入Iml無菌水懸浮細(xì)胞，根據(jù)轉(zhuǎn)化需要的量分裝細(xì)胞懸液，再次離心l-2min沉淀細(xì)胞，用 微量移液器小心吸出上清，然后，加入表13中的轉(zhuǎn)化混合液表13劇烈振蕩每個(gè)反應(yīng)管直到細(xì)胞完全混勻后，置于42°C水浴中熱激至少40min，然 后高速離心30sec，用微量移液器除去轉(zhuǎn)化混合液，吸0. 2-1. Oml無菌水加到每個(gè)反應(yīng)管 中，用移液器上下輕輕抽提以懸浮沉淀。用等份的100-200μ 1轉(zhuǎn)化混合液涂布在合成完全 省卻成分培養(yǎng)基選擇平板上，28-30°C培養(yǎng)2-4天，待單菌落長(zhǎng)出后，挑取單菌落接種在合 成完全省卻成分液體培養(yǎng)基中，于30°C，200rpm條件下振蕩培養(yǎng)。將上述質(zhì)粒PDR195、pYES2轉(zhuǎn)入DEY1457野生型酵母菌株作為正對(duì)照，質(zhì)粒 pDR195、pYES2轉(zhuǎn)入酵母突變株DEY1453、SMFU ZHY3作為負(fù)對(duì)照，構(gòu)建的AhDmtl酵母表達(dá)質(zhì)粒pYDl、pDD轉(zhuǎn)入酵母突變體DEY1453、SMF1、ZHY3作為功能驗(yàn)證菌株。2.菌落PCR篩選成功轉(zhuǎn)化子取20 μ 1菌液，離心棄去培養(yǎng)基，用無菌水洗1-2遍，加入10 μ 1無菌水，煮沸 3min，然后離心取上清液約2μ 1進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)程序與酵母表達(dá)載體 構(gòu)建中所用的PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序相同。通過PCR篩選，最終得到分別轉(zhuǎn)入pDR 195、 PYES2質(zhì)粒的DEY1457、DEY1453、SMFU ZHY3的八個(gè)菌株以及分別轉(zhuǎn)入pYDl、pDDl質(zhì)粒的 DEY1453、SMF1、ZHY3 的六個(gè)菌株。
四.酵母異源功能互補(bǔ)驗(yàn)證AhDmtl轉(zhuǎn)運(yùn)二價(jià)金屬離子的功能用新鮮合成完全省卻成分培養(yǎng)基活化、搖培上述各成功轉(zhuǎn)化的酵母菌株，待菌液 OD值約等于IdXlO7個(gè)細(xì)胞/ml)時(shí)，將各菌株的菌液按細(xì)胞密度(0D值)分別做10倍梯 度稀釋，然后按順序?qū)⒕悍謩e點(diǎn)布在相應(yīng)的酵母異源互補(bǔ)功能驗(yàn)證培養(yǎng)基上，于28°C培 養(yǎng)3-4天，觀察并記錄各菌株的生長(zhǎng)情況。以轉(zhuǎn)入pDR195、pYES2質(zhì)粒的DEY1457野生型酵 母菌株為正對(duì)照，轉(zhuǎn)入pDR195、pYES2質(zhì)粒的DEY1453、SMF1、ZHY3酵母突變株為負(fù)對(duì)照，觀 察轉(zhuǎn)入pYDl、pDDl質(zhì)粒的DEY1453、SMFl、ZHY3酵母菌株的生長(zhǎng)情況，確定AhDmtl轉(zhuǎn)運(yùn)不 同二價(jià)金屬離子的能力。1. AhDmtl轉(zhuǎn)運(yùn)二價(jià)鐵離子能力的功能驗(yàn)證在含有不同濃度BPDS (Fe2+螯合劑)的合成完全省卻成分培養(yǎng)基上驗(yàn)證AhDmtl轉(zhuǎn) 運(yùn)二價(jià)鐵離子能力。結(jié)果表明，隨著BPDS濃度的增大，即培養(yǎng)基中Fe2+的含量不斷減少，無 論是用PDR195還是pYES2作為表達(dá)載體進(jìn)行功能驗(yàn)證，都可以觀察到轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒的酵母生 長(zhǎng)逐漸受到抑制，而轉(zhuǎn)入AhDmtl基因的酵母生長(zhǎng)良好(圖7)，說明AhDmtl具有轉(zhuǎn)運(yùn)Fe2+的 能力，是一個(gè)高親和的Fe2+轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白；而且當(dāng)含有80μΜ BPDS的SC培養(yǎng)基ρΗ值由5升 高到8時(shí)，野生型酵母正常生長(zhǎng)的情況下，轉(zhuǎn)入AhDmtl的酵母突變株的生長(zhǎng)逐漸受到抑制， 最后與負(fù)對(duì)照一樣，其轉(zhuǎn)運(yùn)功能完全喪失(圖8)，說明AhDmtl轉(zhuǎn)運(yùn)鐵的過程是質(zhì)子依賴的， 有研究表明，質(zhì)子的存在一方面可以改變膜表面的電化學(xué)勢(shì)，另一方面可以提高AhDmtl轉(zhuǎn) 運(yùn)體對(duì)二價(jià)金屬離子的親和能力。2. AhDmtl轉(zhuǎn)運(yùn)二價(jià)錳離子能力的功能驗(yàn)證在含有20mM EGTA(Mn2+螯合劑)的合成完全省卻成分培養(yǎng)基上，用pDR195、pYES2 作為表達(dá)載體進(jìn)行功能驗(yàn)證得到相同的結(jié)果，即當(dāng)培養(yǎng)基中錳離子濃度很低時(shí)，轉(zhuǎn)入空質(zhì) 粒的酵母突變株SMFl生長(zhǎng)狀況明顯差于轉(zhuǎn)入AhDmtl基因的酵母突變株SMFl (圖9)，說明 AhDmtl具有轉(zhuǎn)運(yùn)Mn2+的能力，是一個(gè)高親和的Mn2+轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白。3. AhDmtl轉(zhuǎn)運(yùn)二價(jià)鋅離子能力的功能驗(yàn)證在不含EDTA螯合劑的SC培養(yǎng)基上，無論轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒還是轉(zhuǎn)入AhDmtl基因的酵母 都能生長(zhǎng)，二者長(zhǎng)勢(shì)沒有明顯的差異，但加入0. ImMEDTA后，野生型酵母能夠正常生長(zhǎng)，而 轉(zhuǎn)入空質(zhì)?；駻hDmtl基因的酵母突變體生長(zhǎng)都受到很明顯的抑制，基本上失去了生長(zhǎng)活 性(圖10)，表明AhDmtl轉(zhuǎn)運(yùn)體的存在并不能改善轉(zhuǎn)運(yùn)鋅能力缺失的酵母突變體的生長(zhǎng)，進(jìn) 而說明AhDmtl不具備轉(zhuǎn)運(yùn)鋅的能力。實(shí)施例3花生不同器官中AhDmtl基因的表達(dá)分析水培花生并接種根瘤菌誘導(dǎo)結(jié)瘤，具體方法同前，分別提取花生葉片、根、根瘤的 總RNA，DNaseI去除DNA污染后，紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定不同器官RNA的含量，取等量的上述RNA，反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。以該單鏈cDNA為模板，以花生18S rDNA作為內(nèi)參，擴(kuò)增引 物為18S-F :5’ -CCGTCTCAAACAAGAACAAAACC-3，，18S-R :5’ -TCACACCAAGTATCGCATTTCG-3，； 花生 AhDmtl 的 PCR 擴(kuò)增引物為QDMT_F1 :5，-GTGCTGTTTCCTTTTCGCCTTG-3，，QDMT-Rl 5，-AGTGTATCCATTGAAAGTCTTGAGT-3，，通過RT-PCR分析AhDmt 1基因在花生不同器官中的表 達(dá)情況。分析的儀器是ABI7000熒光定量PCR儀，定量分析反應(yīng)體系如表14所示表14
反映程序50°C預(yù)熱2min ；95°C預(yù)變性 Imin ；95°C變性 30sec ；60°C退火 30sec ； 72°C延伸45sec ；40個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束。分析每個(gè)樣品的擴(kuò)增曲線，獲得每個(gè)樣品的Ct值， 根據(jù)公式AhDmtl相對(duì)表達(dá)量=2[ct(25s)-ct(dmtl)]計(jì)算出該基因在花生不同器官中的表達(dá)量， 每個(gè)樣品重復(fù)3次。分析結(jié)果表明=AhDmtl基因主要在花生根瘤表達(dá)，而在花生葉片和根 表達(dá)要弱的多(圖11)，說明AhDmtl主要在花生根瘤中轉(zhuǎn)運(yùn)二價(jià)金屬離子。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
花生根瘤Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其特征在于，其具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述的花生根瘤Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，其具有如SEQID No. 2所示的核苷酸序列。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因或其片段的載體。
5.含有權(quán)利要求4所述載體的宿主。
6.含有權(quán)利要求2或3所述基因或其片段的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。
7.權(quán)利要求2或3所述的基因或其片段在提高植物鐵的利用效率和根瘤固氮能力中的應(yīng)用。
8.一種用于擴(kuò)增權(quán)利要求1所述的花生根瘤Fe (II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的引物，包括 正向引物 5 ‘ -DMT-F 5 ‘ -ACGCGGGGGAGCATAAATGTGGAAACACCACTAGCAT-3 ‘，以及反向引物 3' -DMT-R 5' -AACTATGATGTTCAAAGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種花生根瘤Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因，所述花生根瘤Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，其編碼基因具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。本發(fā)明提供的花生根瘤Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因，揭示了豆科植物與根瘤菌共生固氮過程中鐵元素的轉(zhuǎn)運(yùn)、利用方式，為通過基因工程技術(shù)提高豆科植物鐵利用效率、發(fā)揮根瘤高效固氮潛力提供了必要的理論依據(jù)和技術(shù)支持，具有較大的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A01H5/00GK101838321SQ201010196538
公開日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2010年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月2日
發(fā)明者左元梅, 張福鎖, 熊宏春, 王朋飛, 申紅蕓 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)