專利名稱：含有對映體牛尿酚的組合物和產(chǎn)物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對映體牛尿酚(equol)化合物，即S-牛尿酚和R-牛尿酚的制備和分 離，以及含有對映體牛尿酚化合物的食物和藥物，所述食物和藥物用于治療哺乳動物和人 類的疾病和病情。
背景技術(shù)：
大豆和由純化大豆蛋白制備的食物的營養(yǎng)價值是眾所周知的，而再次對大豆食物 產(chǎn)生興趣主要是對異黃酮的潛在健康益處的證明研究的結(jié)果，其中異黃酮是大豆中富含的 一類植物雌激素。盡管最近FDA許可大豆食物制造商可聲稱每份含至少6. 25g大豆蛋白的 大豆食物有利心臟健康(FDA，1999)，這還是沒有認識到大豆中異黃酮組分的價值，現(xiàn)在的 研究表明植物雌激素具有降低膽固醇的作用，同時還具有有助于降低心血管危險因子的重 要非類固醇性質(zhì)。經(jīng)常食用大豆的亞洲國家的激素依賴性疾病的低發(fā)病率據(jù)稱部分是由于 大豆異黃酮的作用。植物雌激素，尤其是來自大豆，三葉草和野葛(kudzu)的異黃酮，例如染料木素 (genistein)、葛根黃豆苷元(daidzein)、黃豆黃素(glycitein)、peurarin及其糖苷衍生 物、雞豆黃素(biochanirOA和芒柄花黃素(formononetin)，及其糖苷衍生物，在一些哺乳 動物和人組織中顯示雌激素的性質(zhì)，并在其它組織中通過在雌激素受體位點競爭性抑制雌 激素結(jié)合而顯示抗-雌激素的性質(zhì)。和雌激素不同，這些異黃酮植物雌激素似乎與乳腺癌 和子宮癌的危險增高無關(guān)，并實際上可抑制乳腺癌和前列腺癌的發(fā)病。心血管疾病是發(fā)病率和死亡率的主要病因，特別在美國和西歐國家更是如此。數(shù) 種致病因子參與心血管疾病的發(fā)病，包括對該疾病的遺傳素因、性別、生活方式因子例如吸 煙和飲食、年齡、高血壓、高脂血癥，包括高膽固醇血癥。數(shù)種這些因子，尤其是高脂血癥和 高膽固醇血癥，導(dǎo)致動脈硬化的發(fā)病，而動脈硬化是血管和心臟疾病的主要病因。高血膽固醇濃度是人類血管疾病和冠心病的關(guān)鍵危險因子之一。升高的低密 度脂蛋白膽固醇(下文稱"LDL-膽固醇")和總膽固醇與冠心病危險增高直接相關(guān) (Cholesterol and Mortality 30 Years of FoIlow-Up from theFramingham Study, Anderson, Castelli, & Levy, JAMA, Vol. 257，pp. 2176-80 (1987))，而低水平的高密度脂蛋 白膽固醇(下文稱"HDL-膽固醇")也是誘病因子。數(shù)個臨床實驗支持HDL-膽固醇對動脈 硬化的保護作用。研究還顯示，婦女的血HDL-膽固醇每增加Ι-mg/dL，冠狀血管疾病的危險 t生就氏 3% (High-density Lipoprotein Cholesterol and Cardiovascular Disease Four ProspectiveAmerican Studies， Gordon， Probstfield， and Garrison et.al.， Circulation, Vol. 79，pp.8-15 (1989))。雌激素在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和保持血管健康方面起重要作用，正如絕經(jīng)后血漿膽固醇增加，以及在美國和大多數(shù)西方國家中死于心血管疾病的婦女多于男子這一事實可證明。 為此，一直相信HRT能通過預(yù)防CVD來使絕經(jīng)后婦女受益。最近對16，608名以上絕經(jīng)后堅 持HRT 8年以上的婦女進行的婦女健康初步研究(Women' s Health Initiative Study) 沒有顯示這種益處，并且實際上發(fā)現(xiàn)由于血栓栓塞和心臟疾病導(dǎo)致的死亡危險增加，尤其 是在聯(lián)用雌激素和孕激素的第一年中，同時乳腺癌的危險性顯著增加。由于這些報道的結(jié) 果，HRT使用急劇減少，而且現(xiàn)在婦女不斷地尋找雌激素的替代形式來改善絕經(jīng)后雌激素缺 乏。植物雌激素如異黃酮通過與雌激素受體的構(gòu)象結(jié)合而起到天然選擇性雌激素受體調(diào)節(jié) 物的作用，是潛在有吸引力的替代物，并且雖然公開了很多大豆或三葉草異黃酮的用途，但 是關(guān)于重要的代謝物質(zhì)牛尿酚的潛在價值只有很少的數(shù)據(jù)。最近研究表明，大豆異黃酮對于降低動物內(nèi)血總膽固醇和L DL-膽固醇濃度有重 要作用，從而抑制動脈硬化發(fā)病。異黃酮對人血膽固醇水平的作用更加有爭議，但數(shù)項研究 現(xiàn)在表明需要大豆中存在異黃酮來觀察到膽固醇_降低作用。Crouse等人的重要研究顯 示，血清總膽固醇和LDL-膽固醇和大豆蛋白中的異黃酮量之間的劑量依賴關(guān)系。與異黃酮 可具有膽固醇自身平衡的作用無關(guān)，有證據(jù)顯示異黃酮對血管具有重要影響。研究已顯示 脂質(zhì)過氧化減少，動脈活性、血流和血壓的改善，以及血小板聚集的降低。我們最近發(fā)現(xiàn)，包 含異黃酮的每日飲食可降低C-反應(yīng)性蛋白的水平，所述蛋白是炎癥的重要標(biāo)志物，并被認 為是心血管疾病的加速因子之一。所有上述內(nèi)容都是重要的心血管疾病危險性降低因子。異黃酮顯示對減少骨質(zhì)損失的作用(bone-sparing effect) 0目前的17項體外培 養(yǎng)骨細胞研究，24項絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動物模型的體內(nèi)研究，以及17項飲食干預(yù)研究顯示， 異黃酮具有減少骨質(zhì)損失的作用。在所有這些研究中都檢驗大豆異黃酮或三葉草異黃酮。 我們首次表明，牛尿酚是重要的骨質(zhì)營養(yǎng)因子，與雌激素不同，它對絕經(jīng)后婦女不僅具有降 低骨再吸收細胞的活性的能力，實際上還具有增加骨鹽密度的作用。盡管大量科學(xué)文獻關(guān)注大豆或三葉草中的天然異黃酮，很少有報道關(guān)于它們的腸 來源代謝物的作用和效果，并仍需要進一步發(fā)展能在哺乳動物和人中安全提供治療或預(yù)防 作用的化合物和方法。1932年，非類固醇雌激素牛尿酚(7-羥基-3-(4'-羥基苯基)_苯并二氫呋喃 (chroman))首次從懷孕的母牛尿液中分離并鑒定，并隨后在食用大豆食物的人的尿中鑒 定。牛尿酚的結(jié)構(gòu)類似于類固醇雌激素雌二醇(estradiol)。牛尿酚在異黃酮類物質(zhì)中是 獨特的，這是因為它具有手性中心，并因此以兩種不同的對映體形式即R-和S-對映體形式 而存在。以前對牛尿酚的所有研究似乎都利用牛尿酚的外消旋形式進行的。通常對兩種形 式的牛尿酚的存在缺乏認識，并且就我們的知識而言，對于單個對映體的具體作用或活性 尚未有過報道。當(dāng)牛尿酚最初在母牛的尿中鑒定時，據(jù)報道其是光學(xué)活性的，以R-對映體 而存在。隨后，發(fā)現(xiàn)這是錯誤的，并有證據(jù)表明從馬尿中分離的牛尿酚形式實際上是S-對 映體。我們第一次證明了人腸中產(chǎn)生的牛尿酚形式只是S-對映體，且我們合成并分離了獨 立的對映體，并顯示了它們對雌激素受體(ER)即ERa和ERi3的親合力有明顯差異。雖然最初發(fā)現(xiàn)將大劑量的牛尿酚注射到卵巢切除后的小鼠時，牛尿酚沒有顯示雌 激素作用，后來的發(fā)現(xiàn)顯示它是造成綿羊的不育綜合癥的原因。最初也報道過(_)牛尿酚在卵巢切除后的小鼠中不具有雌激素活性，但隨后證實 牛尿酚的外消旋混合物作為弱雌激素起作用，而其前體，葛根黃豆苷元和芒柄花黃素沒有或具有可忽略的雌激素活性。牛尿酚不通常存在于大多數(shù)健康成人的尿中，除非他們吃了大豆。牛尿酚在體內(nèi) 的形成僅依賴于腸道微生物區(qū)系，這可從以下的發(fā)現(xiàn)證實無細菌的動物不分泌牛尿酚，以 及在從出生起就僅喂給大豆食物的新生嬰兒的血漿和尿中沒有發(fā)現(xiàn)牛尿酚。牛尿酚完全是一種不天然存在于任何基于植物的產(chǎn)物中的非類固醇雌激素
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明涉及用于制備商業(yè)產(chǎn)品的組合物，其包含S-牛尿酚。優(yōu)選地，所述組合物通過從S-牛尿酚和R-牛尿酚的外消旋混合物中分離S-牛尿 酚制備。優(yōu)選地，所述組合物主要由S-牛尿酚組成，并且對映體純度為90%最小對映體過 量(EE)，更優(yōu)選為96%最小EE，甚至更優(yōu)選為98%最小EE。本發(fā)明還涉及用于制備商業(yè)產(chǎn)品的組合物，其包含R-牛尿酚。優(yōu)選地，其中所述組合物主要由R-牛尿酚組成，并且對映體純度為90%最小對映 體過量(EE)，更優(yōu)選為96%最小EE，甚至更優(yōu)選為98%最小EE。本發(fā)明還涉及商業(yè)制品，其包含S-牛尿酚和R-牛尿酚的非外消旋混合物。優(yōu)選地，其中所述非外消旋混合物包含比例為約1 99到約49 51的S-牛尿 酚與R-牛尿酚，或約51 49到約99 1的S-牛尿酚與R-牛尿酚。優(yōu)選地，其中所述商業(yè)制品包括食品。優(yōu)選地，其中所述牛尿酚的非外消旋混合物是通過將選自S-牛尿酚和R-牛尿酚 的第一牛尿酚組分和由S-牛尿酚和R-牛尿酚的外消旋混合物組成的第二牛尿酚組分混合 制成的。本發(fā)明還涉及食品組合物，其包含添加劑組分，所述添加劑組分選自S-牛尿酚， R-牛尿酚，以及S-牛尿酚和R-牛尿酚的非外消旋混合物。優(yōu)選地，其中所述食品每份包括至少約lmg，至多約300mg的S-牛尿酚，更優(yōu)選至 少約10mg，至多約200mg的S-牛尿酚，并甚至更優(yōu)選至少約30mg，至多約50mg的S-牛尿酚。本發(fā)明還涉及局部用于皮膚的組合物，其包含添加劑組分，所述添加劑組分選自 S-牛尿酚，R-牛尿酚，以及S-牛尿酚和R-牛尿酚的非外消旋混合物。優(yōu)選地，所述局部用于皮膚的組合物，優(yōu)選為油膏、液體或乳液的形式，所述組合 物包含S-牛尿酚和賦形劑，其中S-牛尿酚為所述組合物重量的至少0. 1%，至多10%。優(yōu)選地，其中所述S-牛尿酚在C-4'或C-7位置偶聯(lián)以形成選自下組的偶聯(lián)物 葡糖苷酸、硫酸酯、乙酸酯、丙酸酯、葡糖苷、乙酰_葡糖苷、丙二酰_葡糖苷及其混合物。本發(fā)明還涉及將牛尿酚的外消旋混合物分離成第一和第二對映體的方法，包括以 下步驟(1)提供包含牛尿酚的外消旋混合物的組合物；(2)提供包含手性相的HPLC柱； (3)使用流動相，使一定量的所述組合物通過所述HPLC柱的入口，所述流動相包含C3-C7烷 烴(alkyl)和C2-C4醇；(4)自通過步驟起第一段時間后，從HPLC柱出口收集包含第一對 映體的第一流出物；并(5)自通過步驟起第二段時間后，從柱出口收集包含第二對映體的 第二流出物。
具體地，本發(fā)明涉及將牛尿酚的外消旋混合物分離成第一和第二對映體的方法， 包括以下步驟(1)提供包含牛尿酚的外消旋混合物的組合物； (2)提供包含手性相硅石基質(zhì)的HPLC柱，優(yōu)選其中所述硅石基質(zhì)包含纖維素三 (3，5_ 二甲基苯基氨基甲酸酯)和纖維素三(4-甲基苯甲酸酯)；(3)使用流動相，使一定量的所述組合物通過所述HPLC柱的入口，所述流動相包 含C3-C7烷烴和C2-C4醇，優(yōu)選其中所述流動相包含比例為95 5-5 95，甚至更優(yōu)選為 50 50-90 10的己烷丙醇；(4)自通過步驟起第一段時間后，從HPLC柱出口收集包含第一對映體的第一流出 物；以及(5)自通過步驟起第二段時間后，從HPLC柱出口收集包含第二對映體的第二流出 物。本發(fā)明還涉及進行研究的方法，其中將異黃酮給藥人類受試者，并測定該受試者 的至少一種生理數(shù)據(jù)，其包含以下步驟1)將一定劑量的異黃酮給藥至少選定受試組中一 個人類受試者2)檢測所述受試者的尿中牛尿酚的水平，和3)鑒定所述受試者為牛尿酚產(chǎn) 生者還是非-牛尿酚產(chǎn)生者。具體地，本發(fā)明涉及進行研究的方法，其中將異黃酮給藥人類受試者，并測定至少 一種生理數(shù)據(jù)，其包含以下步驟1)將一定劑量的異黃酮給藥至少選定受試組中一個人類受試者，所述異黃酮優(yōu)選 選自葛根黃豆苷元，大豆黃素，染料木素，染料木苷，芒柄花黃素，雞豆黃素A和peurarin， 及其混合物，2)檢測所述受試者的尿中牛尿酚的水平，和3)鑒定所述受試者為牛尿酚產(chǎn)生者還是非_牛尿酚產(chǎn)生者。具體地，其中所述生理數(shù)據(jù)受雌激素活性影響。優(yōu)選地，該研究方法還包括選自以下步驟的步驟(a)區(qū)別分析鑒定為牛尿酚產(chǎn) 生者的多個受試者的數(shù)據(jù)和鑒定為非-牛尿酚產(chǎn)生者的多個受試者的數(shù)據(jù)，和(b)從選定 的受試組中排除非_牛尿酚產(chǎn)生者。本發(fā)明還涉及制備包含S-牛尿酚的組合物的方法，包括以下步驟1)提供第一組 合物，其包含能夠轉(zhuǎn)化成S-牛尿酚的異黃酮；2)將第一組合物和能將異黃酮轉(zhuǎn)化成S-牛 尿酚的生物體一同培養(yǎng)，3)將所述培養(yǎng)組合物溫育足夠時間，以使部分異黃酮轉(zhuǎn)化成S-牛 尿酚。具體地，本發(fā)明涉及制備包含S-牛尿酚的組合物的方法，所述組合物優(yōu)選選自食 品和局部用于皮膚的組合物，包括以下步驟1)提供第一組合物，其包含能夠轉(zhuǎn)化成S-牛尿酚的異黃酮，其優(yōu)選選自葛根 黃豆苷元、大豆黃素、染料木素、染料木苷、芒柄花黃素、雞豆黃素A、二氫葛根黃豆苷元、 peurarin，其偶聯(lián)形式，及其混合物，2)將第一組合物和能將異黃酮轉(zhuǎn)化成S-牛尿酚的生物體一同培養(yǎng)，3)將所述培養(yǎng)組合物溫育足夠時間，以使部分異黃酮轉(zhuǎn)化成S-牛尿酚，和4)任選失活所述生物體。
優(yōu)選地，上述方法中，其中所述生物體選自糞腸球菌，植物乳桿菌菌株，威氏利斯 特氏菌，從已知為“牛尿酚產(chǎn)生者”的哺乳動物的腸道分離的各種生物體的混合培養(yǎng)物、脆 弱擬桿菌、乳酸雙歧桿菌、粘液真桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌、副干酪乳桿 菌、單核細胞增生利斯特氏菌、藤黃微球菌、費氏丙酸桿菌、Sacharomyces boulardii、乳酸 乳球菌、屎腸球菌和唾液乳桿菌，及其混合物。本發(fā)明還涉及制備包含S-牛尿酚的組合物，包括以下步驟1)提供包含能轉(zhuǎn)化成 S-牛尿酚的異黃酮的第一組合物，2)將第一組合物和選自下組的酶結(jié)合從能夠?qū)?黃酮 轉(zhuǎn)化為S-牛尿酚的細菌中提取的酶，α -葡糖苷酶，β -葡糖苷酶，β -半乳糖苷酶，葡糖淀 粉酶，或果膠酶，及其混合物；和3)將所述混合組合物溫育足夠的時間以將部分異黃酮轉(zhuǎn) 化成S-牛尿酚。具體地，本發(fā)明涉及制備包含S-牛尿酚的組合物，包括以下步驟1)提供包含能轉(zhuǎn)化成S-牛尿酚的異黃酮的第一組合物，優(yōu)選選自葛根黃豆苷元、 大豆黃素、染料木素、染料木苷、芒柄花黃素和雞豆黃素Α，2)將第一組合物和選自下組的酶結(jié)合從能夠?qū)慄S酮轉(zhuǎn)化為S-牛尿酚的細菌 中提取的酶、α "葡糖苷酶、β "葡糖苷酶、β "半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶或果膠酶，以及3)將所述混合組合物溫育足夠的時間以將部分異黃酮轉(zhuǎn)化成S-牛尿酚。本發(fā)明還涉及制備S-牛尿酚產(chǎn)品的方法，包括以下步驟1)提供包含主要由 S-牛尿酚組成的牛尿酚對映體的組合物，所述組合物通過生物體的異黃酮代謝在生物合成 中產(chǎn)生；2)從所述組合物提取S-牛尿酚，以形成包含S-牛尿酚的產(chǎn)物，所述提取選自a) 溶劑提取，包括將所述組合物與低分子量醇混合以使得醇和水的比例為至少40 60且不 超過95 5，和b)含水酸提取，包括在約4. 0-約5. 5的pH混合所述組合物；3)將所述提取 物濃縮使得固體含量為約15%到約55% ；4)將濃縮物稀釋到固體含量為約6%到約13% ； 和5)將所述固體沉淀從稀釋的溶液中分離，從而形成S-牛尿酚產(chǎn)物。在一個優(yōu)選實施方案中，該方法包括6)任選純化和/或結(jié)晶所述固體沉淀，從而 形成S-牛尿酚產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及將S-牛尿酚遞送給哺乳動物以預(yù)防或治療疾病或相關(guān)病情的方 法，包括將包含S-牛尿酚或其偶聯(lián)的類似物(conjugated analog)的組合物給藥所述哺乳 動物。本發(fā)明還涉及將R-牛尿酚遞送給哺乳動物以預(yù)防或治療疾病或相關(guān)病情的方 法，其包括將包含R-牛尿酚或其偶聯(lián)的類似物的組合物給藥所述哺乳動物。本發(fā)明還涉及用酶水解葡糖苷的方法，包括將所述葡糖苷與來自Helixpomatia 在一定條件下接觸一段時間，所述條件和時間足以使該葡糖苷轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的糖苷配基。附圖簡述


圖1顯示R-牛尿酚和S-牛尿酚對映體的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖2顯示將芒柄花黃素和葛根黃豆苷元轉(zhuǎn)化成牛尿酚的化學(xué)反應(yīng)圖3顯示通過與Helix pomatia消化液中存在的酶一同溫育從大豆細菌水解異黃 酮糖苷的速率。圖4顯示來自食用大豆的成人的尿樣的牛尿酚對映體洗出物與通過光學(xué)二向色 性表征的純對映體標(biāo)準(zhǔn)物的比較質(zhì)譜圖。
圖5顯示對合成牛尿酚的三甲基硅醚(trimethylsilyl ether)衍生物進行的 GC-MS分析。圖6顯示從外消旋混合物手性分離S-牛尿酚和R-牛尿酚的另一質(zhì)譜圖。圖7顯示手性分離的質(zhì)譜圖，所述分離是從培養(yǎng)自“牛尿酚_產(chǎn)生者”的腸細菌對 葛根黃豆苷元進行細菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的溫育產(chǎn)物。圖8顯示手性分離的質(zhì)譜圖，所述分離是從培養(yǎng)自“非牛尿酚-產(chǎn)生者”的腸細菌 對葛根黃豆苷元進行細菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的溫育產(chǎn)物。圖9顯示從手性相柱分離并洗脫牛尿酚對映體。
圖10顯示健康成年婦女在口服給藥后體內(nèi)(士)牛尿酚的血漿出現(xiàn)/消失曲線。
圖11顯示染料木素和(士)牛尿酚對未成熟大鼠的子宮的雌激素活性。發(fā)明詳述牛尿酚與大多數(shù)異黃酮的區(qū)別在于其由于缺乏雜環(huán)中的雙鍵而具有手性中性。來 自大豆、葛根黃豆苷元、黃豆黃素和染料木素、來自三葉草、芒柄花黃素和雞豆黃素A，以及 來自野葛，peurarin的植物雌激素異黃酮都不具有手性中心。圖IR-牛尿酚和S-牛尿酚 的化學(xué)結(jié)構(gòu)。R-和S-對映體的構(gòu)象不同，并且預(yù)測這將影響牛尿酚如何恰好進入二聚體化ER 復(fù)合物的腔中的結(jié)合位點。許多不同的體外實驗系統(tǒng)已經(jīng)用于比較異黃酮的動情力。與所 用實驗系統(tǒng)無關(guān)，牛尿酚，葛根黃豆苷元和雌二醇對子宮胞苷酸受體的相對摩爾結(jié)合親合 力的數(shù)據(jù)分別為0.4、0. 1和1.0。然而這些數(shù)據(jù)在認識到存在不同的ER亞型以及ERi3的 發(fā)現(xiàn)之前，因此相對結(jié)合親合力反映對ERa的親合力(這是由于ERa是子宮內(nèi)最主要的 受體)，并且沒有將牛尿酚的對映體形式的可能的結(jié)構(gòu)_活性差異考慮在內(nèi)數(shù)種植物雌激素包括牛尿酚由于其對ERi3蛋白的優(yōu)先結(jié)合而在許多雌激素樣物 質(zhì)中是獨特的，并且這解釋了大豆異黃酮在表達這種受體亞型的組織中的一些有益作用， 所述組織例如骨、腦和血管內(nèi)皮。最近，將牛尿酚對人ERa和ERi3的結(jié)合親和力與多種其 它異黃酮比較。牛尿酚與這兩種受體的結(jié)合與染料木素類似，但牛尿酚誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄比 其它任何異黃酮都強，尤其是與ERa結(jié)合的時候。有趣的是，這些體外系統(tǒng)中的葛根黃豆 苷元顯示極低的親合力和轉(zhuǎn)錄活性。大約50%的牛尿酚以游離或未結(jié)合的形式循環(huán)，并認為它們比血漿中的游離葛根 黃豆苷元(18. 7% )或雌二醇(4. 6% )的比例高得多。由于未結(jié)合的部分可用于進行受體 占據(jù)，這可有效增強牛尿酚的總效力。此外，R-牛尿酚和S-牛尿酚都通過在體外和體內(nèi)拮 抗二氫睪酮的能力而具有獨特的抗雄激素性質(zhì)，由此擴大了 R-牛尿酚作為雄激素相關(guān)疾 病的潛在藥劑的潛在治療作用。我們預(yù)計R-牛尿酚也可作為新型雌激素受體ERi3 2的配 體，所述受體在調(diào)節(jié)雌激素受體ER α和ERi3的表達中起作用，并由此證明是治療或預(yù)防乳 腺癌以及與這些受體介導(dǎo)的信號途徑相關(guān)的激素疾病的潛在藥劑。R-牛尿酚也具有抗氧化 活性。所以當(dāng)R-牛尿酚不是在胃腸道中對異黃酮攝入而生理產(chǎn)生時，其是目前沒有認識到 的獨特的異黃酮，并可能是重要的藥劑。如實驗部分所示，確定牛尿酚的S-對映體僅在食用大豆食物的成年人即“牛尿酚 產(chǎn)生者”的尿和血漿中發(fā)現(xiàn)。這提示牛尿酚的細菌產(chǎn)生在腸內(nèi)可能是對映體特異性的，并如 實驗部分的實驗(d)所示，S-牛尿酚是體外培養(yǎng)的人腸細菌所產(chǎn)生的唯一牛尿酚對映體。
含有S-牛尿酚的組合物本發(fā)明的組合物包含S-牛尿酚，并通常主要由S-牛尿酚組成。所述組合物用于 制備商業(yè)和公共產(chǎn)品(institutional product)。所述組合物或由其制備的產(chǎn)品，可口服食 用或局部應(yīng)用。所述產(chǎn)物通常包含出售的或?qū)嶒炇称?、藥物、OTC藥物、油膏、液體、乳膏或其它適 合局部應(yīng)用的物質(zhì)。每份食品組合物可包含至少Img到200mg的S-牛尿酚。每劑口服給 藥的藥物可包含至少Img到200mg的S-牛尿酚。局部應(yīng)用的產(chǎn)品可包含至少0. 到10%重量的S-牛尿酚。本發(fā)明的局部組合 物可包括其它化妝品或藥物活性物質(zhì)和賦形劑。適宜的化妝品和藥劑包括但不限于，抗 真菌劑、維生素、抗炎劑、抗微生物劑、止痛劑、一氧化氮合酶抑制物、驅(qū)昆蟲劑、自染色劑 (self-tanning agents)、表面活性劑、濕潤劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、殺菌劑、稠化劑、潤滑劑、保 濕劑、鰲合劑、皮膚滲透增強劑、潤膚劑、香料和著色劑。S-牛尿酚也可是牛尿酚偶聯(lián)物，其在C-4'或C-7位置與以下偶聯(lián)物偶聯(lián)葡糖苷 酸、硫酸酯、乙酸酯、丙酸酯、葡糖苷、乙酰_葡糖苷、丙二酰_葡糖苷及其混合物。用于給藥受試者以治療和/或預(yù)防與其相關(guān)的疾病，或降低對所述疾病的易患性 的組合物或制劑，其也可含本領(lǐng)域抑制的一或多種可藥用的佐劑，載體和/或賦形劑，例如 Handbook of Pharmaceutical Excipients， secondedition， American Pharmaceutical Association，1994(在此引入作為參考)所述的那些。S-牛尿酚可以片劑、膠囊、用于溶 解的粉末、糖漿、食物(例如棒、餅干、點心和其它本領(lǐng)域抑制的標(biāo)準(zhǔn)食品形式)或飲料配制 物。飲料可含有調(diào)味劑、緩沖液等。本發(fā)明的組合物可包括適合口服，經(jīng)直腸，經(jīng)眼，經(jīng)頰(例如舌下)，經(jīng)胃腸外(例 如皮下，肌肉內(nèi)，皮內(nèi)和靜脈內(nèi))以及透皮給藥。在任何情況下最適合的途徑取決于被治療 疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重性，以及患者的狀態(tài)。本發(fā)明還包括商業(yè)制品，其包含含有牛尿酚非外消旋混合物的組合物，并通常包 含主要由S-牛尿酚組成的牛尿酚。所述商業(yè)制品可以是食物，包括軟飲料，以及健康或個 人護理產(chǎn)品。通常所述組合物可通過從R-牛尿酚和S-牛尿酚的外消旋混合物(也稱(士)牛 尿酚)中分離S-牛尿酚對映體來制備。通常所述外消旋混合物是通過合成途徑制備的合 成外消旋混合物，例如本文所述的混合物。通常，S-牛尿酚組合物中S-牛尿酚的對映體純 度為90%最小對映體過量(〃 EE")。通常，可制備其中的S-牛尿酚具有96%最小EE，甚 至具有98%最小EE的更純的所述組合物。本發(fā)明的組合物也可包含S-牛尿酚和R-牛尿酚的非外消旋混合物，所述混合 物具有S-牛尿酚的EE為至少0%到小于90%。具有0%的EE的組合物是兩種對映體為 50 50的外消旋混合物。所述組合物可直接從外消旋混合物通過從所述外消旋混合物不 完全分離和去除R-牛尿酚對映體來制備。所述組合物也可通過將包含含有牛尿酚的非外 消旋混合物和外消旋混合物的混合物的第一牛尿酸組分，和包含主要由S-牛尿酚組成的 第二組分混合來制備。這樣產(chǎn)生的非外消旋組合物具有過量的S-牛尿酚。相反，非外消旋 混合物也可被制備成具有過量的R-牛尿酚對映體，所述混合物可通過將包含含有牛尿酚 的非外消旋混合物和外消旋混合物的混合物第一牛尿酚組分，與包含主要由R-牛尿酚組成的第二組分混合來制備。根據(jù)組合物中S-牛尿酚和R-牛尿酚的具體益處或指示，可制 備一種組合物，其中包含的S-牛尿酚和R-牛尿酚的比例為大于約50 50到約99. 5 1， 更優(yōu)選約51 49到約99 1，以及從小于約50 50到約1 99. 5，更優(yōu)選約49 51 到約1 99。所述S-牛尿酚組合物可為食品組合物(其也包括軟飲料)的添加劑成分。所述 食品組合物可包括幼兒食品(probiotic food)、胎兒食品(prebiotic food)或飲食食品。 通常所述食品將包含的S-牛尿酚水平為每份至少Img到約lOOmg，但更優(yōu)選為每份5_50mg 的S-牛尿酚。本發(fā) 明的食品組合物也可包含作為本文所述的(士)牛尿酚的非外消旋混合物的 組分的S-牛尿酚。本發(fā)明的示例性組合物可包含一或多種可藥用的或工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)填充物(filler)。所 述填充物必須對用所述組合物處理的受試者無害。所述填充物可以是固體和/或液體。所 述填充物可和活性S-牛尿酚一起配制為單位劑量，例如片劑，其通?？珊屑s10% -80% 重量的S-牛尿酚。組合物可通過任何已知的制藥方法制備，例如混合各種成分，任選包括 制藥領(lǐng)域已知的賦形劑，稀釋劑(例如水)和輔助劑。適宜口服給藥的組合物可存在于分離的單位中，例如膠囊、扁膠囊(cachet)、錠劑 或片劑，每種都含有預(yù)定量的提取物；作為粉末或顆粒；作為溶液或水性或非水性液體中 的懸浮液；或者作為水包油或油包水的乳液。這種組合物可通過任何適宜的制藥方法制備， 其包括將活性S-牛尿酚與一或多種適宜的載體(其可包含一或多種上述附加成分)接觸 的步驟。通常，本發(fā)明的組合物的制備可通過將S-牛尿酚與液體和/或微?；墓腆w載體 均勻且密切地混合，并隨后如必要使產(chǎn)生的混合物成型來進行。例如，片劑可通過包含或模 制(moulding)含有所述提取物的粉末或顆粒以及任選的一或多種附加成分來制備。壓縮 的片劑可通過將粉末或顆粒形式的提取物在適宜的機器中壓制來制備，所述提取物任選與 粘合劑，潤滑劑，惰性稀釋劑，和/或表面活性劑/分散劑混合。模制的片劑可通過在適宜 的機器中對用惰性液體粘合劑濕潤的粉末狀化合物進行模制來制備。適宜的填充劑包括，例如糖(如乳糖，蔗糖，甘露醇或山梨醇)，纖維素制備物和/ 或磷酸鈣(例如磷酸三鈣或磷酸氫鈣)，粘合劑(例如淀粉漿糊，所述淀粉漿糊利用例如玉 米，小麥，大米或馬鈴薯淀粉，明膠，西黃蓍膠，甲基纖維素和/或聚乙烯吡咯烷酮)，并且如 需要可包含崩解物(例如上述淀粉，以及羧甲基淀粉，交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮，瓊脂或褐藻 酸或其鹽，例如褐藻酸鈉)。賦形劑可以是流動調(diào)節(jié)劑和潤滑劑，例如硅酸，滑石，硬脂酸或 其鹽，例如硬脂酸鎂或鈣，和/或聚乙二醇。對糖丸核心可提供適宜并任選的腸溶性包衣， 所述包衣可使用包含阿拉伯樹膠(gum Arabic)、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二 氧化鈦的濃縮糖溶液，或者適當(dāng)?shù)挠袡C溶劑或溶劑混合物中的包衣液，或者用于制備腸溶 性包衣的適宜纖維素制備物(如乙酰纖維素鄰苯二甲酸酯或者羥基丙基甲基纖維素鄰苯 二甲酸酯)的溶液。染料或色素可加入片劑或糖丸包衣中，例如用于鑒定的目的或表明活 性成分的不同劑量。其它可口服給藥的藥物組合物是由例如明膠制備的干充填(dry-filled)膠囊， 以及由明膠和增塑劑如甘油或山梨醇制備成的密封軟膠囊。干充填膠囊可包含顆粒形式的 提取物，例如與填充物以及適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑混合，所述填充物例如乳糖，粘合劑如淀粉和/或gliCants(例如滑石或硬脂酸鎂)。在軟性膠囊中，所述提取物優(yōu)選溶解或懸浮于適宜的液 體中，例如脂肪油類，石蠟油，或液體聚乙二醇，所述液體中也可加入穩(wěn)定劑。
為對食物進行營養(yǎng)強化(fortification)，將S-牛尿酚與多種食物或食物成分混 合，所述食物包括谷類、酸奶、豆奶、湯、奶酪、面食、醬(spread)、糖棒(candy bar)、運動食 物棒(sports bar)、飲料或飲食食物。適宜經(jīng)頰(舌下)給藥的制劑包括錠劑，其包含位于有味道的基質(zhì)(通常為蔗糖 和阿拉伯樹膠或者西黃蓍膠)中的提取物；和軟錠劑(pastille)，其包含位于惰性基質(zhì)例 如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯樹膠中的化合物。適宜直腸給藥的配制劑優(yōu)選為單位劑量的栓劑。這些可通過將異黃酮與一或多種 常用固相載體如可可油(cocoa butter)混合，隨后使產(chǎn)生的混合物成型來制備。含有R-牛尿酚的組合物本發(fā)明的組合物可包含R-牛尿酚，并通常主要由R-牛尿酚組成。所述組合物用 于制備商業(yè)和公共產(chǎn)品。所述組合物，或者由其制成的產(chǎn)物或商業(yè)制品，可口服使用或局部 應(yīng)用。所述產(chǎn)物可包含本發(fā)明上述的任何與S-牛尿酚相關(guān)的產(chǎn)品，其中R-牛尿酚的劑 量水平和組合物水平與對S-牛尿酚所述的相同。 所述R-牛尿酚也可是牛尿酚偶聯(lián)物，其在C-4 ‘或C-7位置與選自葡糖苷酸、硫酸 酯、乙酸酯、丙酸酯、葡糖苷、乙酰_葡糖苷、丙二酰-葡糖苷，或其混合物的偶聯(lián)物偶聯(lián)。包含R-牛尿酚的組合物或制備物也可包含一或多種可藥用的佐劑，載體和/或賦 形劑，并且是如上述與S-牛尿酚相關(guān)的產(chǎn)物的形式，所述組合物或制備物給藥受試者以治 療和/或預(yù)防疾病和相關(guān)病情，或者用于降低對所述疾病和相關(guān)病情的易患性。所述組合物通?？赏ㄟ^從R-牛尿酚和S-牛尿酚的外消旋混合物分離R-牛尿酚 對映體來制備，如上文對S-牛尿酚的相關(guān)敘述。鑒定牛尿酚產(chǎn)生者和非_牛尿酚產(chǎn)生者健康成人中利用[13C]葛根黃豆苷元和[13C]染料木素示蹤物進行的研究明確表 明，牛尿酚從葛根黃豆苷元而不是從染料木素形成。水解來自大豆的葛根黃豆苷元糖苷偶 聯(lián)物，以及甲氧基化的異黃酮芒柄花黃素或在三葉草中所發(fā)現(xiàn)的其糖苷偶聯(lián)物以后，形成 了牛尿酚。在所有情況下，所述反應(yīng)通過二氫中間體繼續(xù)，如圖2所示。一旦形成，牛尿酚 顯示為代謝惰性，除了階段Π代謝或肝中的較小程度的另外的羥基化作用，其不經(jīng)過任何 進一步的生物轉(zhuǎn)化。對于葛根黃豆苷元和染料木素而言，最主要的階段II反應(yīng)是葡糖醛酸 化(glucuronidation)，以及很小程度的硫酸鹽化作用。最初發(fā)現(xiàn)牛尿酚存在于尿液是大豆 食物消化的功能以后，觀察到即使每天用大豆食物攻擊，大約50-70%的成年人群的尿中也 不分泌牛尿酚，而原因不明確。此外，即使給予純異黃酮化合物，由此去除食物基質(zhì)的任何 影響，顯示許多人不將葛根黃豆苷元轉(zhuǎn)化成牛尿酚。這一現(xiàn)象導(dǎo)致將人定義為“牛尿酚-產(chǎn) 生者”或“非-牛尿酚產(chǎn)生者”(或“牛尿酚_產(chǎn)生較少者”)來描述這兩種不同的人群。根據(jù)經(jīng)驗產(chǎn)生截斷值，使得個體分配到這些種類之一中。血漿牛尿酚濃度低于 10ng/mL(40nmol/L)的人可被分類為“非-牛尿酚產(chǎn)生者”，而血漿牛尿酚濃度高于IOng/ mL(40nmol/L)的人稱為“牛尿酚產(chǎn)生者”。這一區(qū)分也可從尿中的水平獲得，牛尿酚產(chǎn)生者 排尿的牛尿酚高于lOOOnmol/L。盡管牛尿酚的排出在個體中高度可變，可產(chǎn)生牛尿酚以及不能產(chǎn)生牛尿酚的人之間有很大差別，這與催化該反應(yīng)的酶動力學(xué)中的前體-產(chǎn)物關(guān)系一 致。因此尿中的葛根黃豆苷元和牛尿酚水平之間存在相反關(guān)系(reverserelationship)，并 因此沒有發(fā)現(xiàn)明顯的性別差異。 作為牛尿酚產(chǎn)生者或非_牛尿酚產(chǎn)生者的個體的狀態(tài)對于招募用于評估異黃酮 (尤其是葛根黃豆苷元，染料木素，芒柄花黃素和雞豆黃素A)給藥的臨床研究受試者很重 要。例如，進行的許多骨和大豆飲食研究都有可變的結(jié)果。使用骨轉(zhuǎn)化(bone-turnover)的 替代型標(biāo)志物進行的12周以下的短期研究表明，當(dāng)飲食中包含含異黃酮的大豆食物時，骨 轉(zhuǎn)化降低，所述標(biāo)志物例如尿吡啶啉和脫氧吡啶啉(deoxypyrodinoline)交聯(lián)，血漿/血清 骨鈣蛋白，堿性磷酸酶，和IGF-1。據(jù)報道多個為期9個月以下的臨床研究顯示對減少骨質(zhì) 損失的作用(bone-sparing effect)。所有研究都在各個位點都測定到骨鹽密度(BMD)改 變，并且所述結(jié)果與四個中有兩個沒有顯示任何影響相矛盾。在除一項研究以外的所有研 究中，沒有意圖限定牛尿酚的狀態(tài)。在所述的一項研究中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)牛尿酚產(chǎn)生者使用大豆食 物兩年以上時，其BMD明顯增加。因此，基于我們的數(shù)據(jù)，牛尿酚是骨營養(yǎng)劑(bone-trophic agent)，并因此將個體鑒定為“牛尿酚產(chǎn)生者”具有治療含義，而遞送牛尿酚將對防止骨質(zhì) 損失和增加骨形成有益。本發(fā)明包括進行研究的方法，其中將異黃酮給藥人類受試者并測定至少一種生理 數(shù)據(jù)，包括以下步驟1)將一定劑量的牛尿酚前體異黃酮給藥至少選定受試組中一個人類 受試者；2)檢測所述受試者的尿或血中牛尿酚的水平，和3)鑒定所述受試者為牛尿酚產(chǎn)生 者或非-牛尿酚產(chǎn)生者。所述生理數(shù)據(jù)通常可被異黃酮的雌激素活性影響。將受試者鑒定 為牛尿酚產(chǎn)生者或非_牛尿酚產(chǎn)生者后，可清楚地分析從研究收集的數(shù)據(jù)，從而獲自一或 多個鑒定為牛尿酚產(chǎn)生者的數(shù)據(jù)和來自一或多個鑒定為非牛尿酚產(chǎn)生者的數(shù)據(jù)可被收集， 分離，分析或報道。鑒定為牛尿酚產(chǎn)生者或非_牛尿酚產(chǎn)生者的個體可從研究受試組中排 除(或包括在內(nèi))。牛尿酚的化學(xué)合成在該過程中，使用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)處理氫化雜環(huán)的雙鍵并用來去除位置C-3上的羰基。 常用起始物質(zhì)是異黃酮，例如葛根黃豆苷元、染料木素、黃豆黃素、peurarin、芒柄花黃素和 雞豆黃素A及其糖苷偶聯(lián)物。任何偶聯(lián)形式將通過上述定義的水解還原成其糖苷配基。該 反應(yīng)的適宜溶劑包括有機酸，例如冰醋酸，低級醇例如異丙醇，及其混合物。通常采用的還 原催化劑包括鈀，例如木炭上10%的Pd。反應(yīng)溫度可為環(huán)境溫度到60°C，壓力從略高于環(huán) 境壓力到200psig(14atm. gauge)，反應(yīng)時間為達30小時以上。反應(yīng)完成后，去除催化劑和蒸發(fā)任何濾出物。純化粗殘余物，通常通過采用硅膠柱 進行層析，使用的洗脫液包含C2-C4醇，C3-C7烷烴，及其混合物。純化的殘余物可從正己 烷結(jié)晶以產(chǎn)生純(+_)牛尿酚產(chǎn)物(通常99%)，其產(chǎn)率通常至少75%。牛尿酚結(jié)晶產(chǎn)物是 無色的，不吸濕的，并在空氣中是穩(wěn)定的，而且在最后的過濾步驟中不分解。所述牛尿酚產(chǎn)物可通過以下方法來證明三甲基硅醚，或叔丁基二甲基硅醚，或合 成產(chǎn)物的任何其它異揮發(fā)衍生物的GC-MS分析為單一的純物質(zhì)峰，且其質(zhì)譜與可信牛尿酚 的三甲基硅(TMS)醚衍生物的公開的電離譜一致。從外消旋牛尿酚分離單獨的R-和S-對映體的方法本發(fā)明還涉及將牛尿酚的外消旋混合物分離成其兩種單獨的對映體的方法。所述方法利用通常獲自如上述化學(xué)合成的外消旋牛尿酚混合物。使用流動相，將一定量的外消 旋牛尿酚導(dǎo)入HPLC柱的入口，所述流動相包含C4-C8烷烴和C2-C4醇。從使消旋混合物 進入所述入口第一段時間以后，從HPLC柱的出口收集第一流出物，所述時間取決于柱的類 型，洗脫液的類型，洗脫液流速，溫度，以及外消旋混合物質(zhì)量。第一洗出物將包含第一對映 體，通常是S-牛尿酚。從使消旋混合物進入所述入口第二段時間以后，從HPLC柱的出口收 集第二流出物，所述時間取決于柱的類型，洗脫液的類型，洗脫液流速，溫度，以及外消旋混 合物質(zhì)量。所述第二洗出物將包含第二對映體，通常為R-牛尿酚。將牛尿酚分離成S-牛尿酚和R-牛尿酚可在手性相柱上進行。手性相柱的一個 常見例子是 Chiralcel OD 柱或 OJ 柱，由 Daicel Chemical Industries Ltd.提供。用于 分離商業(yè)數(shù)量的各對映體的柱可在工業(yè)系統(tǒng)中制備，所述系統(tǒng)包括產(chǎn)品和流動相泵，工業(yè) 化體積的柱，各種器械和控制系統(tǒng)。所述流動相包括C3-C7烷烴或類似的極性溶劑，C2-C4 醇，及其混合物。所述流動相包含己烷與丙醇，其比例通常為95 5-5 95，更優(yōu)選為 50 50-90 10。所述流動相的常見實例包括70%的己烷和30%的乙醇。
牛尿酚對映體從柱的洗脫可通過在260-280nm處UV吸收來檢測或通過更特定的 檢測系統(tǒng)例如質(zhì)譜儀并監(jiān)測對牛尿酚特異的離子來檢測。可最優(yōu)化所述條件以完全分離 S-牛尿酚和R-牛尿酚對映體(通過分析性HPLC證實)。手性相柱通常包括硅石基質(zhì)，所述硅石基質(zhì)可用來選擇性分離牛尿酚對映體的物 質(zhì)。常見的選擇物質(zhì)包括纖維素三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)和纖維素三(4-甲基苯 甲酸酯)。S-牛尿酚的生物制備S-牛尿酚可大批量(in bulk)制備，并可利用常規(guī)食物技術(shù)在多種食品中原位制 備。可提供堿性溶液介質(zhì)，食品或植物提取物，其包含葛根黃豆苷元或可衍生葛根黃豆苷元 的另一種相關(guān)的異黃酮。所述葛根黃豆苷元或其它異黃酮可通過標(biāo)準(zhǔn)細菌或酶發(fā)酵法轉(zhuǎn)化 成S-牛尿酚，以提供包含S-牛尿酚的本體溶液(bulk solution)，食品或植物提取物。食品中S-牛尿酚的產(chǎn)生可通過利用在食物中生長的細菌的代謝活性來實現(xiàn)，所 述食品包含令人滿意的起始物質(zhì)，例如大豆黃素、葛根黃豆苷元、芒柄花黃素或peurarin， 或其偶聯(lián)物或混合物。如圖2所示，葛根黃豆苷元轉(zhuǎn)化為牛尿酚包括三個主要步驟1)任 何葡糖苷偶聯(lián)基團的水解，2)將異黃酮糖苷配基轉(zhuǎn)化成二氫中間體，和3)將所述二氫_中 間體轉(zhuǎn)化成牛尿酚。所述代謝途徑和三個步驟中每一步所需的酶不必要存在于一個細菌 中。來自對人的研究的證據(jù)提示可有一種或多種細菌，它們聯(lián)合進行這些反應(yīng)，如通常二氫 葛根黃豆苷元可以大量存在于血漿和尿中而牛尿酚的量可較低或基本不能檢測到這一事 實可證明。盡管牛尿酚可通過單一生物體從葛根黃豆苷元制備，認為當(dāng)使用各種細菌的混 合物時可實現(xiàn)更好或更有效的轉(zhuǎn)化，其中每種所述細菌都具有自己的代謝圖譜。有效轉(zhuǎn)化 成S-牛尿酚的重要條件包括細菌生物體或生物體混合物的選擇，溫育的條件，以及所述生 物體可利用的氧的量。這些條件可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)來優(yōu)化。用于實現(xiàn)該轉(zhuǎn) 變的生物體可通過食品工業(yè)中所用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)失活，或可選擇地允許其以活性狀態(tài)保留在 所述產(chǎn)品中。用于發(fā)酵過程中以將葛根黃豆苷元和/或其它結(jié)構(gòu)相關(guān)的異黃酮，或中間化合物 轉(zhuǎn)化成S-牛尿酚的細菌，可包括在人，馬，嚙齒類或其它是“牛尿酚產(chǎn)生者”的哺乳動物的腸道內(nèi)建群(colonize)的一或多種細菌菌株。由于哺乳動物體內(nèi)的腸細菌見于糞便中，產(chǎn) 牛尿酚的細菌也可在“牛尿酚產(chǎn)生者”哺乳動物的糞便中發(fā)現(xiàn)。通常用于發(fā)酵過程中的細菌應(yīng)顯示優(yōu)化的轉(zhuǎn)化率和轉(zhuǎn)化程度，使得牛尿酚的生物 制備有效。通常，需要一或多種細菌菌株將葛根黃豆苷元(或其它相關(guān)異黃酮)經(jīng)中間 產(chǎn)物轉(zhuǎn)變成S-牛尿酚，這通常涉及三個主要反應(yīng)中的一或多個將異黃酮糖苷配糖基 (glycone)轉(zhuǎn)化成糖苷配基異黃酮；將糖苷配基異黃酮轉(zhuǎn)化成二氫異黃酮；并將二氫異黃 酮轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物牛尿酚。例如，從馬糞便分離的生物體的混合培養(yǎng)物和來自已知是“牛尿酚產(chǎn) 生者”人的胃腸道的生物體混合培養(yǎng)物可將糖苷配糖基葛根黃豆苷元轉(zhuǎn)化成最終產(chǎn)物S-牛 尿酚，這和它們在體內(nèi)的表現(xiàn)一致?？蓪⑻擒张涮腔D(zhuǎn)化成糖苷 配基(例如將葛根黃豆苷元轉(zhuǎn)化成葛根黃 豆苷元)的常見細菌菌株包括糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、植物乳桿菌 (Lactobacillus plantarum)、威氏利其jf 特氏菌(Listeria welshimeri)、分離自牛尿 酚產(chǎn)生哺乳動物的腸道的生物體混合培養(yǎng)物、脆弱擬桿菌(Bacteriodesfragi 1 i s)、乳 酸雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis)、粘液真桿菌(Eubactrialimosum)、干酪乳桿 菌(Lactobacillus casei)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilous)、德氏乳桿菌 (Lactobacillus delbrueckii)、畐Ij干酷IL桿菌(Lactobacillus paracasei)、單核細胞±曾 生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)、費氏丙酸 Iflif (Proprionobacteriumfreudenreichii)禾口 Sacharomyces boulardii，及其t昆合物?？蓪⑻擒张浠D(zhuǎn)化為牛尿酚(例如將葛根黃豆苷元轉(zhuǎn)化為S-牛尿酚)的常見的 細菌菌株包括費氏丙酸桿菌；乳酸雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、乳酸乳球菌、屎腸球菌、干酪乳桿 菌和唾液乳桿菌的混合培養(yǎng)物；和分離自牛尿酚產(chǎn)生哺乳動物腸道的生物體混合培養(yǎng)物。葡糖苷到糖苷配基，或糖苷配基到牛尿酚產(chǎn)物的細菌轉(zhuǎn)化所需的時間將取決于細 菌相關(guān)因子，尤其是濃度，氧可利用度，以及溫育系統(tǒng)的溫度和PH。在大多數(shù)情況下，可在 24小時內(nèi)實現(xiàn)基本完全的轉(zhuǎn)化。異黃酮葡糖苷到糖苷配基異黃酮的細菌轉(zhuǎn)化的pH范圍是從約3到約9。最佳pH 主要依賴于所用的細菌類型，并應(yīng)相應(yīng)選擇。葡糖苷到糖苷配基以及糖苷配基到牛尿酚產(chǎn)物的酶轉(zhuǎn)化所需的時間取決于酶相 關(guān)的因子，尤其是濃度，以及該系統(tǒng)的溫度和PH。在大多數(shù)情況下，可在24小時內(nèi)實現(xiàn)基本 完全的轉(zhuǎn)化，更優(yōu)選在約2小時以內(nèi)，且最優(yōu)選在約1小時以內(nèi)。在生物制備牛尿酚的可選擇的方法中，S-牛尿酚可通過葛根黃豆苷元或其它結(jié)構(gòu) 相關(guān)的異黃酮，酶轉(zhuǎn)化為S-牛尿酚在食品或其它適宜的基質(zhì)中原位產(chǎn)生。適宜的酶可利用 分離和純化這些酶的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從細菌中分離并濃縮，所述細菌可有效地將葛根黃豆苷元或 結(jié)構(gòu)相關(guān)的異黃酮轉(zhuǎn)化成牛尿酚。這些是已知的，并被本領(lǐng)域以及酶學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域的 技術(shù)人員使用。所述牛尿酚的制備可通過有效轉(zhuǎn)化而無需細菌在食物本身中生長而獲得。用于將葛根黃豆苷元和/或其它相關(guān)異黃酮，或中間化合物轉(zhuǎn)化成牛尿酚的酶， 可包括從細菌或細菌混合物中分離的酶，所述酶顯示出可將適宜的異黃酮轉(zhuǎn)化成牛尿酚。 這種細菌或細菌混合物的實例可包括，但不限于，在人，馬，或其它是“牛尿酚產(chǎn)生者”的哺 乳動物的腸道中建群的細菌。通常用于將葛根黃豆苷元或中間體化合物轉(zhuǎn)化成牛尿酚的過程中的酶應(yīng)顯示優(yōu)化的轉(zhuǎn)化率和轉(zhuǎn)化程度，以使得牛尿酚的生物制備效率較高。可用的酶可從一或多種細菌或其混合物中分離，所述細菌為本文所述用于將葛根 黃豆苷元或結(jié)構(gòu)相關(guān)的異黃酮，或中間體化合物轉(zhuǎn)化成牛尿酚的細菌。在常用的方 法中，細菌在營養(yǎng)性胰蛋白胨培養(yǎng)液中在無氧條件、約37°C培養(yǎng)約15 小時到約72小時，更優(yōu)選從約24小時到36小時。所述細菌隨后通過常規(guī)技術(shù)從培養(yǎng)液中 分離，最通常通過在約1500g到25000g以及25，OOOg以上的重力下進行離心。所述細胞在 鹽水溶液(從約0. 1 %到約5%，并優(yōu)選約0.9%)中通過將它們懸浮于所述鹽水溶液中，并 再次離心懸液而得以洗滌。利用酶學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的技術(shù)，用所述洗滌 后的分離細胞制備活性酶提取物。酶粗提混合物可原樣用作酶提取物，或者可通過常規(guī)酶 制備技術(shù)進一步純化。制備的酶提取物可加入到食物中，所述食物含有適宜的異黃酮，例如葛根黃豆苷 元、大豆黃素或芒柄花黃素?？杉尤肫渌蛛x的酶，其中一些是可購得的，以加快酶介導(dǎo)的 反應(yīng)途徑中起始物質(zhì)到中間體的轉(zhuǎn)化。所述產(chǎn)物通常在約25°C到約45°C的溫度，優(yōu)選在約 30°C至約40°C地溫度下溫育，所述溫度優(yōu)選從約30°C到約40°C，同時在正在生長的樣品中 保持適當(dāng)?shù)臒o氧條件。葛根黃豆苷元型化合物轉(zhuǎn)化成牛尿酚的速率取決于加入食物基質(zhì)中 的活性酶的量。當(dāng)轉(zhuǎn)化迅速進行時獲得最好的結(jié)果(在約2小時內(nèi)基本完全)，但更長的轉(zhuǎn) 化時間在低酶活性時是必要的。食物中產(chǎn)生的牛尿酚的量可通過限制食物中含葛根黃豆苷 元的化合物的量，或者通過在溫育開始后適當(dāng)?shù)臅r間失活所述酶，例如將產(chǎn)生的食物產(chǎn)品 加熱到約95到100°C來控制。S-牛尿酚的酶制備的第一步是將葡糖苷轉(zhuǎn)化為糖苷配基。作為利用以上述方式分 離的酶來實現(xiàn)該轉(zhuǎn)化的替換，可使用可購得的酶。葡糖苷到糖苷配基的酶轉(zhuǎn)化可通過在適 宜的PH和溫度使適宜的酶與異黃酮葡糖苷接觸來進行。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)異黃酮葡糖苷到糖苷配 基異黃酮的轉(zhuǎn)化取決于多種類型的因子，包括所用酶的類型，酶的活性，以及轉(zhuǎn)化過程中溫 育的溶液的PH和溫度。實現(xiàn)所述轉(zhuǎn)化所需的酶是能夠斷裂異黃酮葡糖苷的異黃酮部分和 葡萄糖分子之間的糖苷鍵連的酶。在優(yōu)選實施方案中，所述酶是能夠斷裂1，4_糖苷鍵的糖 酶或葡糖淀粉酶。這類酶是可購得的α-和β-葡糖苷酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，和果膠 酶。這些酶的常見例子包括可得自Deltagen，Redwood City California的Biopectinase 200AL (其優(yōu)選在約2. 5到約6. 5的pH范圍使用)，BiolactasdO，000 (最佳pH范圍從約 3到約6)和中性乳糖酶(Neutral Lactase)(最佳pH范圍從約6到約8)，均可得自Quest International, 1833 57th Street, Post OfficeBox 3917, Sarasota, Fla. 34243。其它 具體優(yōu)選的補充酶包括乳糖酶(Lactase)NL(最佳pH范圍從約6到約8)和Enzeco真 菌乳糖酶濃縮物(FungalLactase Concentrate)(最佳pH范圍從約4. 5到約6. 5)，可得 自 EnzymeDevelopment Corporation,2 Penn Plaza, Suite 1102,360ffest 31st Street, NewYork, NY 10001 ；來自大腸桿菌的β -半乳糖苷酶(最佳pH從約6. 0到約8. 0)，其 由 Worthington Biochemicals 生產(chǎn)，并得自 ScimaR,4 Ruskin Close, Templestowe, Victoria. 3106，Australia ；Lactozyme 3000L(which 優(yōu)選在約 6 至約 8 地 pH 范圍內(nèi) 使用)，和A-Gal 600L(其優(yōu)選在約4到約6.5的pH范圍使用)，得自Novo Nordisk Bioindustrials, Inc. ,33 Turner Road, Danbury, Conn. 06813 ；Maxilact L2000 (其優(yōu)選在約 4 到約 6 的 pH 范圍使用)，得自 DSM FoodSpecialties PO Boxl，2600MA，Delft, The Netherlands。異黃酮葡糖苷到糖苷配基異黃酮的轉(zhuǎn)化的pH范圍為約3到約9。所用pH主要取 決于所用酶的類型，并應(yīng)當(dāng)相應(yīng)選擇。所述酶在其生產(chǎn)商說明的最佳PH范圍內(nèi)有活性，如 上文對數(shù)種具體的酶的說明。通常所述酶在中性PH范圍即從約6-8，或酸性pH范圍即從約 3-6有活性。用于葡糖苷到糖苷配基的轉(zhuǎn)化的富含異黃酮物質(zhì)的溫度范圍是從約5°C到約 75°C。該溫度明顯影響酶的活性，并由此影響轉(zhuǎn)化率。所述酶可在70°C以上有活性，例如 A-Gal 600L在75°C有活性。然而，優(yōu)選在低溫下進行所述轉(zhuǎn)化以避免酶失活。在優(yōu)選實施 方案中，所述轉(zhuǎn)化在約35 °C -45°C進行。葡糖苷到糖苷配基的轉(zhuǎn)化所需的時間取決于酶相關(guān)因子，尤其是濃度，以及系統(tǒng) 的溫度和PH。在大多數(shù)情況下，可在24小時內(nèi)實現(xiàn)基本完全的轉(zhuǎn)化，然而優(yōu)選加入所述酶 以急劇增加反應(yīng)速率。選定的酶，酶濃度，PH和溫度優(yōu)選使轉(zhuǎn)化在約2小時以內(nèi)，并優(yōu)選在 1小時內(nèi)基本完成。將Helix Pomatia用作β -葡糖苷酶
本發(fā)明還涉及用酶水解葡糖苷，尤其是異黃酮葡糖苷的新方法，包括將葡糖苷與 來自Helix pomatia的含酶提取物在一定條件下接觸一段時間，使得足以將葡糖苷轉(zhuǎn)化成 相應(yīng)的糖苷配基。含酶提取物通常是Helix Pomatia的消化液。在從牛尿酚的異黃酮葡糖苷起始物質(zhì)合成牛尿酚的過程中，發(fā)現(xiàn)Helixpomatia 的消化液可有效地作為葡糖苷酶來將異黃酮葡糖苷轉(zhuǎn)化為糖苷配基異黃酮。Helix pomatia消化液以β -葡糖醛酸糖苷酶和硫酸酯酶制備物在市場上購買，并且其作為用于 水解類固醇和異黃酮偶聯(lián)物的酶制劑選擇已有30年。其用作葡糖苷酶是未知并且是 意料之外的。β“葡糖苷酶活性足以能夠在體外完全水解和糖苷配糖基偶聯(lián)的異黃酮。所述消化液可以原樣形式，或者以純化的形式使用。Helix pomatia消化液水解異 黃酮糖苷的效率通過于37°C下，在體外，將各自IOOyg的大豆黃素(daizin)和IOOygW 染料木苷(genistin)與0. ImL的Helixpomatia消化液(懸于IOmL的0. 05M乙酸鈉緩沖 液中，pH 4.5) —同溫育而確定。加入所述酶/緩沖液混合物之前，將所述混合物通過固相 C18 Bond Elut過濾管柱(cartridge)以去除我們過去發(fā)現(xiàn)存在于該酶制備物中的殘余量 的異黃酮。保存下來的大豆黃素和染料木苷，以及溫育過程中形成的葛根黃豆苷元和染料 木素的濃度通過對在隨后的24小時內(nèi)間隔取出的混合物的等分樣品進行HPLC確定。圖3顯示Helix pomatia對大豆黃素和染料木苷進行水解的時間過程，該過程是 通過HPLC從保存在溫育混合物中的糖苷對糖苷配基的比例來確定的。這些體外研究顯示 在采用的分析條件下，Helix pomatia在15分鐘內(nèi)完全水解成大豆黃素和染料木苷，并且 這種酶制備物除了具有β-葡糖醛酸糖苷酶和硫酸酯酶活性以外，還是β-葡糖苷酶的有 用來源。從本體溶液分離S-牛尿酚大批量生產(chǎn)的S-牛尿酚可從細菌或酶生成S-牛尿酚的本體溶液中通過本領(lǐng)域已 知的方法分離，包括結(jié)晶，溶劑提取，蒸餾，和沉淀/過濾。產(chǎn)生的本體溶液可含有未反應(yīng)的 葛根黃豆苷元或使用的其它相關(guān)異黃酮，副產(chǎn)物，以及任何反應(yīng)物。這種方法可包括反相(reverse phase)或正相(straightphase)液相層析柱，并且這些方法可以和手性相層析
纟口口。從本體溶液或固相中去除S-牛尿酚的常用方法是提取。將提取劑溶液加入含有 S-牛尿酚的溶液或固相中。通常，所述提取劑是低分子量醇，例如甲醇、乙醇、異丙醇或丙 醇，或PH范圍為3. 5到5. 5的水溶液。通常如果使用含水醇(aqueous alcohol)法，加入 足量的醇以使得醇/水比例在最小為40 60到最大為95 5的范圍之內(nèi)。更常見，所述 比例至少60 40，或更常見 為65 35到90 10。如果使用含水酸提取法，制備含水酸溶液，將其pH調(diào)節(jié)到約3. 5到約5. 5，甚至更 優(yōu)選PH范圍在約4. 0-5. 0的范圍內(nèi)。將足量的水加入以產(chǎn)生具有足夠低粘度的稀釋液，以 使得可通過離心或過濾從液體中分離固體。從其中去除了不溶性固體物質(zhì)的液體可通過常規(guī)去除液體的方法濃縮。常用方 法包括，但不限于，通過蒸發(fā)去除溶劑，優(yōu)選在減壓下。殘余的液體濃縮到含至少約15% 的固體到約55%的固體，更常見濃縮到含30%到50%的固體。所述濃縮物隨后用水稀釋 以降低固體含量并增加水和醇的比例。加入的水的量可在大范圍內(nèi)變化，但最終固體含量 為6% -15%，且更優(yōu)選為約13%。將混合物的pH調(diào)節(jié)到約pH 3. 0-ρΗ 6. 5，優(yōu)選為約pH 4. 0-pH5. 0。通常所述溫度在約2°C -10°C，更常見為約5°C _7°C。隨后通過標(biāo)準(zhǔn)分離技術(shù)(離心或過濾)從液體中分離所述固體物質(zhì)，并產(chǎn)生富含 牛尿酚的固體物質(zhì)。所述富含牛尿酚的物質(zhì)可任選純化，通常通過利用硅膠柱進行層析，并采用包含 C2-C4醇、C3-C7烷烴、及其混合物的洗脫液。純化的殘留物可從正己烷中結(jié)晶以產(chǎn)生純 S-牛尿酚產(chǎn)物，其純度通常為至少99%，產(chǎn)率通常為至少75%。所述牛尿酚結(jié)晶產(chǎn)物是無 色、不吸濕的并在空氣中是穩(wěn)定的，而且不在最終的過濾步驟中分解。所述S-牛尿酚產(chǎn)物可如下證實三甲基硅醚或叔丁基二甲基硅醚，或合成產(chǎn)物的 任何其它易揮發(fā)性衍生物的GC-MS分析為單一的純物質(zhì)峰，且其質(zhì)譜與可信牛尿酚的三甲 基硅(TMS)醚衍生物的公開的電離譜一致。產(chǎn)物的確認還可通過在將樣品通過HPLC手性 相柱導(dǎo)入儀器后利用電噴射電離進行直接質(zhì)譜法來進行。通過給藥S-牛尿酚治療疾病本發(fā)明提供使受試個體克服不能在體內(nèi)產(chǎn)生牛尿酚的問題的方法，所述方法通過 直接遞送牛尿酚對映體，具體為S-牛尿酚或S-牛尿酚和R-牛尿酚混合物，避開需要腸細 菌來產(chǎn)生牛尿酚的需要。S-牛尿酚的遞送也可補充“牛尿酚_產(chǎn)生者”和“非_牛尿酚產(chǎn) 生者”體內(nèi)的S-牛尿酚產(chǎn)量。本發(fā)明提供了遞送足夠量的S-牛尿酚以對健康產(chǎn)生益處的方法。所述活性S-牛 尿酚物質(zhì)可通過直接攝入或給藥純S-牛尿酚化合物或S-牛尿酚的任何偶聯(lián)的類似物來 遞送。通常，可給藥足量的含S-牛尿酚組合物以在哺乳動物中產(chǎn)生至少5納克每毫升 (nanogram per milliliter, ng/mL)，或更常見為至少10ng/mL以上的血漿S-牛尿酚瞬時 水平，或者大于lOOOnmol/L的尿S-牛尿酚瞬時水平。所述S-牛尿酚也可是S-牛尿酚偶 聯(lián)物，在C-4'或C-7位置與選自葡糖苷酸、硫酸酯、乙酸酯、丙酸酯、葡糖苷、乙酰-葡糖苷、 丙二酰-葡糖苷，或其混合物的偶聯(lián)物偶聯(lián)。通常，所述組合物以至少約Img(更常見為至 少5mg)到至多IOOmg(或更常見為至多50mg)的劑量給藥。
認為遞送足量S-牛尿酚的能力在數(shù)個方面優(yōu)于遞送牛尿酚的外消旋混合物。首 先，預(yù)測S-牛尿酚的效力是外消旋混合物的至少兩倍。其次，人體僅產(chǎn)S-牛尿酚，并因此 僅包含S-牛尿酚的組合物代表具有機體所熟悉的S-牛尿酚成分的“天然”產(chǎn)物。第三，由 于認為人體不產(chǎn)生R-牛尿酚對映體，僅包含或基本僅包含S-對映體的治療組合物不會引 入機體不熟悉的物質(zhì)。
本發(fā)明的組合物可用于治療各種激素依賴性疾病和與其相關(guān)病情。本發(fā)明包括S-牛尿酚在治療和預(yù)防疾病或病情中的用途，所述疾病或病情包括 腦疾病，阿爾茨海默型癡呆，以及其它與年齡增長和短期及長期記憶喪失相關(guān)的認知功能 降低或障礙。S-牛尿酚的雌激素活性通過增強神經(jīng)傳遞和恢復(fù)突觸密度從而在腦內(nèi)起作 用。認為S-牛尿酚在腦內(nèi)起作用的位點和雌激素的相同，顯示雌激素反應(yīng)。本發(fā)明包括S-牛尿酚在治療和預(yù)防骨質(zhì)減少和骨質(zhì)疏松中的用途。在兩年的隨機研究中，絕經(jīng)后婦女每天喝兩杯有或沒有異黃酮的豆奶。數(shù)據(jù)顯 示，在食用有可忽略量的異黃酮的組中，兩年中腰椎BMD和BMC分別降低4. 0%和4. 3% (ρ <0.01)。這些水平與自然絕經(jīng)第一個兩年中正常預(yù)期的5-7%的骨質(zhì)損失接近。反之，食 用含有50mg異黃酮的豆奶的婦女顯示腰椎BMD和BMC分別增加1. 和2% (相對于基線 值)。這項研究顯示與缺乏異黃酮的大豆蛋白相反，含異黃酮的大豆蛋白在兩年的時間中 可保持骨質(zhì)穩(wěn)定。所述數(shù)據(jù)表明，通過腰椎BMD中的變化測定的骨質(zhì)損失可在異黃酮存在 下得以預(yù)防。應(yīng)提到該差異不是僅在一年之后才觀察到。由于骨轉(zhuǎn)化率較慢，前一項骨研究的 數(shù)據(jù)的變異率很可能是大豆食物短期飲食介入的結(jié)果。最引人注目的觀察是血漿牛尿酚濃度大于10ng/mL(隊列的45% )的“牛尿酚-產(chǎn) 生者”婦女，其顯示腰椎骨鹽密度(BMD，p = 0. 02)和骨鹽含量(BMC，p = 0. 009)分別平均 增加了 2. 4%和2. 8%，而“非-牛尿酚產(chǎn)生者”組中BMD和BMC分別增加僅0. 6%和0. 3%。 給予對照物質(zhì)的婦女顯示BMD和BMC分別平均降低4. 0和4. 3% (與基線相比ρ < 0. 01)。 該數(shù)據(jù)顯示代謝異黃酮以產(chǎn)生牛尿酚的能力以及牛尿酚在機體中的存在與BMD和BMC的增 加有直接聯(lián)系。這些數(shù)據(jù)提示，牛尿酚是重要的骨營養(yǎng)劑。給藥足量的含牛尿酚組合物以減 少骨轉(zhuǎn)化的替代標(biāo)志物，或者防止通過骨鹽密度測定的骨質(zhì)流失。也可給藥足量的含S-牛 尿酚組合物以增加骨形成或防止骨質(zhì)疏松并減少骨折。本發(fā)明包括S-牛尿酚在治療和預(yù)防脂質(zhì)疾病例如高膽固醇(高膽固醇血癥)、月旨 血癥(Iipidemia)、脂血(Iipemia)和血脂異常(dyslipidemia)(脂質(zhì)紊亂)中的用途。上 述研究還包括對受試者體內(nèi)膽固醇濃度的研究。結(jié)果顯示牛尿酚產(chǎn)生者中的血漿總膽固醇 濃度與基線水平相比降低7. 2% (ρ = 0. 04)，而非-牛尿酚產(chǎn)生者的血漿總膽固醇濃度與 基線水平相比降低3.0% (ρ = NS)。大豆蛋白不能在血膽固醇水平正常的成人中顯示明顯 的膽固醇-降低效應(yīng)(幾乎很少有例外)，這很可能是由于研究人群在大豆異黃酮代謝以及 不能認識到牛尿酚形成的關(guān)聯(lián)性方面的異質(zhì)性。這些數(shù)據(jù)提示牛尿酚以有利的方式影響脂 類。給藥足量的含S-牛尿酚組合物以降低血流中脂質(zhì)的水平。本發(fā)明還包括S-牛尿酚在治療和預(yù)防急性和慢性卵巢雌激素缺乏狀態(tài)(包括血 管收縮障礙和盜汗，通常稱為“熱潮紅(hot flush)”或熱潮紅(hot flash))中的用途。這 也包括用于乳癌治療的伴有熱潮紅的抗雌激素治療。
本發(fā)明還包括S-牛尿酚在治療和預(yù)防心血管疾病和肝臟疾病中的用途。本發(fā)明還包括S-牛尿酚通過增加對血壓急性改變的反應(yīng)性或適應(yīng)性，改善血流， 和降低血壓用來改善降低的血管質(zhì)量的用途。本發(fā)明包括S-牛尿酚在降低脂質(zhì)過氧化和作為抗氧化物清除體內(nèi)自由基中的用 途。本發(fā) 明還包括S-牛尿酚在減輕炎癥中的用途，這可由其降低炎癥標(biāo)記物例如C反 應(yīng)性蛋白的效果證實。本發(fā)明還包括S-牛尿酚在治療和預(yù)防癌癥中的用途，所述癌癥包括良性乳腺癌， 乳腺癌，良性前列腺癌，前列腺癌，皮膚癌和結(jié)腸癌。本發(fā)明還包括S-牛尿酚在治療和預(yù)防腺瘤性息肉(adenomatous polyps)和家族 性息肉病(familial polyposis)中的用途，所述兩種疾病都有很高的結(jié)腸癌變危險。由于 雌激素在降低婦女結(jié)腸癌危險性中的重要性，有理由預(yù)期牛尿酚對映體具有類似的預(yù)防或 治療作用，尤其是結(jié)腸是牛尿酚前體產(chǎn)生牛尿酚的主要位置。本發(fā)明的組合物可用于治療各種非激素依賴性疾病和相關(guān)病情，包括胃腸道，前 列腺，乳腺，皮膚和骨的炎性疾病。牛尿酚分子中手性中心的存在可能與其生物效能相關(guān)。對映體的效力大于消旋 體，尤其是對ER β而言。本發(fā)明的方法中，鈣或維生素D可共同給藥(在給藥牛尿酚前，同時，或以后)，例 如作為分離的藥片，或者作為適當(dāng)劑型的一部分。牛尿酚具有與細胞功能相關(guān)的其它性質(zhì)。作為多酚，其與類黃酮都具有作為氫 /電子供體的能力，并由此可清除自由基。在體內(nèi)在FRAP，TEAC和Cu(II)-誘導(dǎo)的或鐵 (III)-誘導(dǎo)的脂質(zhì)體過氧化實驗中，牛尿酚的抗氧化能力在所有檢測的異黃酮中最大。盡 管異黃酮在體外檢測時被認為是弱抗氧化劑，它們的體內(nèi)作用可足以造成回體脂質(zhì)過氧化 降低，當(dāng)成人使用大豆蛋白食物時，上述現(xiàn)象在除了一項臨床研究以外的所有研究中均可 觀察到。由于牛尿酚的抗氧化活性比其它異黃酮好，對“牛尿酚-產(chǎn)生者“或不能產(chǎn)生牛尿 酚的那些人直接遞送牛尿酚可有以下情況作為藥劑，補充劑，或遞送到食品中。在所有情 況下，增加的循環(huán)牛尿酚水平可提供對脂質(zhì)過氧化更強的抑制，并由此更大程度地降低心 血管疾病的危險性。認為非-牛尿酚產(chǎn)生者通常比牛尿酚產(chǎn)生者患特定疾病的危險更高，所述疾病通 常是激素依賴性疾病或病情，包括乳腺癌。對于產(chǎn)生牛尿酚較少或不產(chǎn)生的人而言，可通過 口服，局部，經(jīng)鼻，經(jīng)皮下，或靜脈內(nèi)給藥牛尿酚對映體或其混合物獲得相當(dāng)?shù)囊嫣?。在牛尿酚產(chǎn)生者的飲食中補充牛尿酚，具體為S-牛尿酚，可在牛尿酚產(chǎn)生者產(chǎn) 生的S-牛尿酚正常水平不足的情況下產(chǎn)生有益效果，這是由于1)攝入的用于產(chǎn)生牛尿 酚的異黃酮不足，2)應(yīng)用的抗生素消除了腸細菌從前體異黃酮產(chǎn)生牛尿酚的活性，或3) 其它影響牛尿酚產(chǎn)生水平的健康因子。此外，認為牛尿酚尤其是S-牛尿酚的補充水平 (supplemental level)對人的健康狀況提供了增強效果。通過給藥R-牛尿酚治療疾病本發(fā)明還提供了使個體受試者克服不能在體內(nèi)產(chǎn)生牛尿酚的問題的方法，其是通 過直接遞送牛尿酚對映體，具體為R-牛尿酚或R-牛尿酚和S-牛尿酚的混合物，來回避產(chǎn)生牛尿酚對所需腸細菌。本發(fā)明提供了遞送足量R-牛尿酚以產(chǎn)生對健康的益處的方法。所述R-牛尿酚物 質(zhì)可通過直接攝入或給藥純R-牛尿酚化合物或R-牛尿酚的任何偶聯(lián)的類似物來遞送。通 常，可給藥足量的含R-牛尿酚組合物以在哺乳動物中產(chǎn)生至少5納克每毫升(ng/mL)，或 更常見為至少lOng/mL以上的血漿R-牛尿酚瞬時水平，或者大于lOOOnmol/L的尿S-牛尿 酚瞬時水平。所述R-牛尿酚也可是R-牛尿酚偶聯(lián)物，在C-4'或C-7位置與選自葡糖苷 酸、硫酸酯、乙酸酯、丙酸酯、葡糖苷、乙酰-葡糖苷、丙二酰-葡糖苷，或其混合物的偶聯(lián)物 偶聯(lián)。通常，所述組合物以至少約lmg(更常見為至少5mg)到100mg(或更常見為到50mg) 的劑量口服給藥。 認為遞送足量R-牛尿酚的能力在一些情況下，例如乳腺癌預(yù)防，或用于拮抗配體 與特異性ER例如ERi3 1或ERi3 2的結(jié)合，在一定程度上優(yōu)于遞送牛尿酚的外消旋混合物。本發(fā)明的含R-牛尿酚組合物可用于治療各種激素依賴的疾病和相關(guān)病情。本發(fā)明包括R-牛尿酚在治療和預(yù)防疾病或病情中的用途，所述疾病或病情包括 腦疾病，阿爾茨海默型癡呆，以及其它與年齡增長和短期及長期記憶喪失相關(guān)的認知功能 降低或障礙。認為R-牛尿酚在腦內(nèi)起作用的位點和雌激素的相同，顯示通過在腦內(nèi)特定區(qū) 域內(nèi)富集的特異性雌激素受體介導(dǎo)的雌激素反應(yīng)，同時也具有防止神經(jīng)元受到氧化應(yīng)激的 抗氧化作用。本發(fā)明包括R-牛尿酚在治療骨質(zhì)減少和骨質(zhì)疏松中的用途，這是由于抗氧化劑 對破骨活性具有保護性作用。給藥足量的含R-牛尿酚組合物以減少骨轉(zhuǎn)化的替代標(biāo)志物，或者防止通過骨鹽 密度測定的骨質(zhì)流失。也可給藥足量的含R-牛尿酚組合物以增加骨形成，或防止骨質(zhì)疏松 并減少骨折。本發(fā)明包括R-牛尿酚在治療和預(yù)防脂質(zhì)疾病例如高膽固醇(高膽固醇血癥)、月旨 血癥、脂血和血脂異常(脂質(zhì)紊亂)中的用途。大豆蛋白不能在血膽固醇水平正常的成人 中顯示明顯的膽固醇-降低效應(yīng)(幾乎很少有例外)，這很可能是由于研究人群在大豆異黃 酮代謝以及不能認識到牛尿酚形成的關(guān)聯(lián)性方面的異質(zhì)性。這些數(shù)據(jù)提示牛尿酚以有利的 方式影響脂類。給藥足量的含S-牛尿酚組合物以降低血流中脂質(zhì)的水平并減少脂質(zhì)過氧 化。本發(fā)明還包括R-牛尿酚在治療和預(yù)防急性和慢性卵巢激素缺乏狀態(tài)(包括血管 收縮障礙和盜汗，通常稱為“熱潮紅(hot flush)”或熱潮紅(hot flash))中的用途。這也 包括用于乳癌治療的伴有熱潮紅的抗雌激素治療。本發(fā)明還包括R-牛尿酚在治療和預(yù)防心血管疾病和肝臟疾病中的用途。本發(fā)明還包括R-牛尿酚通過增加對血壓急性改變的反應(yīng)性或適應(yīng)性，改善血流， 和降低血壓用來改善降低的血管質(zhì)量。本發(fā)明包括R-牛尿酚在作為抗氧化物清除體內(nèi)自由基中的用途。本發(fā)明還包括R-牛尿酚在減輕炎癥中的用途，這可由其降低炎癥標(biāo)記物例如C反 應(yīng)性蛋白和細胞因子的效果證實。本發(fā)明還包括R-牛尿酚在治療和預(yù)防癌癥中的用途，所述癌癥包括良性乳腺癌， 乳腺癌，良性前列腺癌，前列腺癌，皮膚癌和結(jié)腸癌。
本發(fā)明還包括R-牛尿酚在治療和預(yù)防腺瘤性息肉(adenomatous polyps)和家族 性息肉病(familial polyposis)中的用途，所述兩種疾病都有很高的結(jié)腸癌變危險。由于 雌激素在降低婦女結(jié)腸癌危險性中的重要性，有理由預(yù)期牛尿酚對映體具有類似的預(yù)防或 治療作用，尤其是結(jié)腸是牛尿酚前體產(chǎn)生牛尿酚的主要位置。實驗(a)測定“牛尿酚產(chǎn)生”的成年人中的牛尿酚對映體分析來自食用大豆食物的成人的尿樣品。所述成人以前鑒定為“牛尿酚產(chǎn)生者”。 通過使樣品通過固相Bond Elut C18管柱從尿(25mL)中分離牛尿酚。用水洗滌該管柱后， 用乙醇(5mL)洗脫回收異黃酮，并在氮氣流下干燥甲醇相。用Helix pomatia對樣品進行 酶水解，并在Bond Elut C18管柱上再提取。所述甲醇提取物在氮氣下干燥，并溶解于HPLC 流動相(100 μ 1)。利用Chiralcel OJ手性相柱利用實施例2中的方法通過HPLC鑒定牛尿 酚對映體。牛尿酚的檢測通過選定離子監(jiān)控型電噴射電離質(zhì)譜(ESI-MS)實現(xiàn)。圖4顯示 S-牛尿酚純標(biāo)準(zhǔn)物和來自食用大豆食品的成人的尿的質(zhì)譜圖。由于沒有檢測到牛尿酚的R-對映體保留指數(shù)和質(zhì)譜確定人尿中僅分泌牛尿酚的 S-對映體。分析來自相同“牛尿酚-產(chǎn)生者”也顯示僅有牛尿酚S-對映體。
(b)外消旋牛尿酚的化學(xué)合成葛根黃豆苷元(200mg，0. 8mmol)溶解于冰醋酸(20mL)和異丙醇(20mL)的混合物 中，并用木炭(150mg)上的10% (1在55 · s. i. g. (3. 7atm gauge)還原。在反應(yīng)最后(2小 時，TLC 異丙醇/正己烷1/4)，將催化劑濾到，并蒸發(fā)濾出物。粗殘余物通過在硅膠柱上利 用異丙醇和正己烷(1 4 ν/ν)混合物作為洗脫液通過層析純化，以產(chǎn)生從正己烷結(jié)晶的 純(士)牛尿酚產(chǎn)物(160mg，產(chǎn)率82% )。所述無色晶體的產(chǎn)物，是不可吸濕的，并在空氣 中穩(wěn)定，并在最后的過濾步驟中不分解?；瘜W(xué)合成產(chǎn)物在各方面都與(士)牛尿酚(外消旋 牛尿酚)的可信樣品相同。圖5顯示合成產(chǎn)物的三甲基硅醚衍生物的GC-MS分析是單個純 峰，并且其質(zhì)譜和可信牛尿酚的三甲基硅(TMS)醚衍生物的公開的電離譜一致。所述分子 離子和預(yù)期的一樣為m/z 470且基峰值在m/z 234處。純化的牛尿酚產(chǎn)物的純度大于99%， 如HPLC和質(zhì)譜所確定的。(c)通過光學(xué)二向色性的S-和R-對映體的洗脫順序S-牛尿酚和R-牛尿酚的外消旋混合物通過在Chiralcel OJ柱上進行如下手性層 析采用l.OmL/min的流率，并使用梯度洗脫，其初始流動相是己烷中的10%乙醇，然后將 己烷中的乙醇在15分鐘的時間內(nèi)根據(jù)表A的方案增加到90% 表 A時間(min. )%己烷 ％乙醇090101. 0901015. 0109016. 0901017. 09010圖6顯示S-和R-牛尿酚外消旋混合物的離子記錄(m/z 241的質(zhì)譜。分別收集第一洗脫物質(zhì)，命名為對映體-1，和第二洗脫物質(zhì)，命名為對映體_2。稱重每種對映體并將稱重后的樣品溶于ImL的光譜級乙醇中。每種對映體旋光度的測定在 20°C利用波長為鈉的D線的光進行。對映體-1物質(zhì)(1.6mg提取重量)第一次和第二次測定值分別為-0. 023 和-0. 022，產(chǎn)生的旋光度為-14[-0. 0225X1000/1. 6]，這對應(yīng)于牛尿酚的S-對映體。對映 體-2物質(zhì)(1.7mg提取重量)第一次和第二次測定值分別為+0. 023和+0. 023，產(chǎn)生的旋光 度為+13. 5 [+0. 023 X 1000/1. 7]，這對應(yīng)于牛尿酚的R-對映體。(d)通過人腸細菌產(chǎn)生S-牛尿酚來自牛尿酚-產(chǎn)生者和非-牛尿酚產(chǎn)生者的新鮮排出糞便(Ig)分別和9mL無菌蒸 餾水，胰胨豆胨培養(yǎng)液和加入有葛根黃豆苷元(10mg/L)的腦-心浸出培養(yǎng)液一同溫育。所 述培養(yǎng)液在無氧條件下在37°C溫育24小時。所述溫育混合物隨后被離心并使其通過Bond Elut C18固相管柱(Varian Inc,Harbor City,CA)分離異黃酮，并用甲醇洗脫。甲醇提取 物隨后在氮氣條件下干燥并再溶解于100 μ L的流動相，以便通過高壓液相色譜和連接的 電噴射電離質(zhì)譜(ESI-MS)進行分析。將樣品提取物(20μ L)注入柱中，使用的是手性相柱和上述實驗(C)中的洗脫參 數(shù)。通過兩種牛尿酚對映體特異性的、m/z 241處離子的負離子模式中的選定離子記錄實 現(xiàn)。將溫育提取物的質(zhì)譜與含約等比例的S-牛尿酚和R-牛尿酚的外消旋牛尿酚純標(biāo)準(zhǔn)物 進行對比。鑒定是基于兩種對映體的保留差異，其中S-牛尿酚對映體在R-牛尿酚對映體 之前洗脫。圖7顯示溫育產(chǎn)物的離子記錄(m/z 241)的質(zhì)譜。所述產(chǎn)物是通過培養(yǎng)自“牛尿 酚_產(chǎn)生者”的腸細菌將葛根黃豆苷元轉(zhuǎn)化為牛尿酚所產(chǎn)生的。圖7顯示對應(yīng)于S-牛尿酚 對映體的明顯的峰。反之，圖8顯示溫育產(chǎn)物的離子記錄(m/z 241)的質(zhì)譜。所述產(chǎn)物是 通過培養(yǎng)自“非_牛尿酚_產(chǎn)生者”的腸細菌將葛根黃豆苷元轉(zhuǎn)化為牛尿酚所產(chǎn)生的，表明 在對應(yīng)S-牛尿酚保留時間處的較小峰值檢測到為零或微量水平的S-牛尿酚。根據(jù)ESI-MS分析，腸細菌將葛根黃豆苷元轉(zhuǎn)化為牛尿酚形成的產(chǎn)物是單峰(對映 體-1)，其僅對應(yīng)S-牛尿酚對映體。這些研究確定了人腸細菌只產(chǎn)生S-牛尿酚對映體，并且這于S-牛尿酚出現(xiàn)在人 血漿和尿中一致。e)測定S-和R-對映體的受體結(jié)合能力進行體外結(jié)合研究來檢測S-和R-對映體牛尿酚與雌激素受體ER α和ER β的相 對親合力。激素受體蛋白的合成全長大鼠ERa表達載體(pcDNA-ERa ；RH PriceUCSF)禾口 ER^表達載體(pcDNA-ERp ；TA Brown,Pfizer,Groton, CT)用于在體外利用TnT-偶聯(lián)的網(wǎng) 狀細胞溶解物系統(tǒng)(Promega，Madison, WI)和T7-RNA聚合酶，在30°C反應(yīng)90分鐘合成激 素受體。將翻譯反應(yīng)混合物保存在-80°C備用。飽和等溫線為計算并確定S-牛尿酚和R-牛尿酚對映體對ERa和的結(jié)合 親合力，將100 μ L的網(wǎng)狀細胞溶解物等分試樣在濃度漸增(0. Ol-IOOnM)的[3H] 17 β -雌二 醇(Ε2)的情況下在適宜的時間和溫度溫育，即室溫90分鐘(ERβ )和4°C 18小時(ERa )。 這些時間通過經(jīng)驗測定，并代表受體與雌激素的最佳結(jié)合。非特異性結(jié)合通過使用300倍 過量的ER拮抗劑乙烯雌酚在平行試管內(nèi)進行評估。溫育后，通過將溫育的反應(yīng)物通過ImL的親脂性S印hadex LH-20 (Sigma-Aldrich Co.，Saint Louis, MO)柱分離結(jié)合和未結(jié)合的 [3HlE20根據(jù)以前公開的方案(Handa等，1986 ;0，Keefe andHanda，1990)，通過將一次性 吸液管頭(lmL，Labcraft ；Curtin MathesonScientific, Inc, Houston, TX)和 TEGMD (IOmM Tris-Cl, 1. 5mM EDTA, 10%甘油，25mM鉬酸鹽，和 ImM二硫蘇糖醇，pH7. 4)-飽和的 S印hadex 組裝在一起構(gòu)建。為進行層析，用TEGMD(100y 1)重新平衡柱子，并將溫育反應(yīng)物分別加入 各柱中，并在柱上再溫育30分鐘。這次溫育后，將600 μ L的TEGMD加入到各柱中，收集流 出物，加入 4mL 閃爍液，并在 2900TR Packard 閃爍計數(shù)儀(Packard Bioscience,Meriden, CT)中計數(shù)樣品。使用競爭結(jié) 合實驗評估牛尿酚的S-牛尿酚和R-牛尿酚對映體的雌激素性質(zhì)。根 據(jù)S和R與[3H]E2競爭ER結(jié)合的能力，顯示兩種對映體對體外翻譯的ER的親合力有很大 區(qū)別。S-牛尿酚對映體顯示對ERβ的親合力最大[Kd(nm) = 0. 73士0. 2]，而其對ER α的 親合力經(jīng)比較相對較低[Kd(riM) =6. 41 士 1.0]。所述R-牛尿酚對映體對ERβ的親合力 [Kd (nm) = 15. 4 士 1. 3]和對ER α的親合力[Kd (ηΜ) = 27. 38 士 3. 8]更低。作為對照，在該 系統(tǒng)中17 β-雌二醇與Er α以Kd(nM) =0.13結(jié)合且與Er β以Kd(nM) = 0. 15結(jié)合。該研究表明，僅S-牛尿酚對映體與ER以足夠的親合力結(jié)合，從而可能與人體中報 道的循環(huán)牛尿酚水平相關(guān)。與17 β -雌二醇的相比，S-牛尿酚和R-牛尿酚對映體與ERa 的相對結(jié)合親合力分別低49倍和211倍。但S-牛尿酚對映體似乎大多為ERβ選擇性的， 其對ERi3的親合力相對較高；而R-牛尿酚對映體與ERβ結(jié)合的親合力大約低100倍。僅 S-牛尿酚見于人血漿和尿中的分離和結(jié)合的測定，就兩種對映體的結(jié)合特異性方面而言是 顯著的。
實施例實施例1 通過HPLC將外消旋牛尿酚分離成分離的對映體合成的S-和R-牛尿酚外消旋混合物根據(jù)實驗部分的實驗(b)所述的化學(xué)合成法 制備，并通過 Chiralcel OJ (0. 46cm 直徑 X 25cm 長)，由 Daicel ChemicalIndustries Ltd 提供。所述柱使用10 μ m硅膠底物上的纖維素三(4-甲基苯甲酸酯)。使用的流動相是梯度 洗脫液，其開始是己烷90% /乙醇10%并在15分鐘內(nèi)根據(jù)表A以1毫升每分的流速(mL/ min)線性增加到最終組合物即己烷10%/乙醇90%。牛尿酚從柱的洗脫通過260nm的UV 吸收來檢測。圖9顯示使用手性相柱洗脫牛尿酚對映體。R-牛尿酚的保留時間為7. 05min, 而S-牛尿酚對映體的保留時間為7. 75min。對映體的鑒定通過它們的保留指數(shù)與通過光學(xué) 二向色性確定的純對映體標(biāo)準(zhǔn)物的比較來確定。實施例2 牛尿酚的吸收和生物利用度將25-mg劑量的牛尿酚以單次口服丸的形式給藥健康成年女性受試者，并檢測牛 尿酚血漿濃度。通過腸道吸收快速進行，在4-6小時后，達到最大血漿濃度，并隨后從循環(huán) 中消失，其終消除(terminal elimination)半衰期為8. 8小時。如表B所示，(士)牛尿 酚的藥代動力學(xué)與其它異黃酮的相似，但與其前體葛根黃豆苷元(C1/F= 17. 5L/h)相比， (士)牛尿酚的血漿清除率較慢(C1/F = 6. 85L/h)并顯示相對高劑量調(diào)節(jié)的生物利用度 (AUC inf/F = 145. 8ng/Ml/hr/mg牛尿酚)。
圖10顯示(士)牛尿酚的血漿出現(xiàn)/消失曲 線，其表示為對數(shù)/線性圖，顯示對健康成年女性口服給藥(士)牛尿酚以后，牛尿酚的藥代動力學(xué)。表B還顯示以前公開的健康婦女中葛根黃豆苷元的比較值。表B
成年婦女牛尿酚 葛根黃豆苷元tl/2(h)8. 769. 34Vd/F (L)86. 7236.4Cl/F (L/h)6. 8517. 5AUCinf (ng/Ml/hr) 36461470實施例3 牛尿酚的雌激素活性將化學(xué)合成牛尿酚的外消旋混合物皮下注入(IOOmg和500mg劑量)幼年22天大 的Sprague-Dawley大鼠以比較牛尿酚對未成熟大鼠子宮的雌激素活性。還檢驗了(500mg 劑量)和DMSO(對照)。在第17，19和21天測定子宮重量。
圖11顯示該模型中外消旋牛 尿酚的雌激素活性是染料木素的兩倍以上，從而使得注入劑量的一半是無活性的R-牛尿 酚對映體。實施例4 大豆食物中葡糖苷到糖苷配基的細菌轉(zhuǎn)化在食物中將葛根黃豆苷元轉(zhuǎn)化為牛尿酚的第一步是將異黃酮的葡糖苷形式轉(zhuǎn)化 為糖苷配基形式，為將糖苷配基酶還原到牛尿酚作準(zhǔn)備。檢測大量生物體實現(xiàn)所述轉(zhuǎn)化的 能力。用實驗生物體接種含約3. 5%的蛋白，8%的碳水化合物和大約16mg/L的大豆黃素的 無菌大豆飲料，并在適宜溫度溫育。溫育溫度為20-40°C認為是適宜的，對于大多數(shù)實驗生 物體而言，優(yōu)選30-37°C。對于大多數(shù)細菌菌株在無氧條件下進行溫育。大豆黃素轉(zhuǎn)化成葛 根黃豆苷元的步驟以后，分析樣品中未反應(yīng)的葛根黃豆苷元，所述樣品是在溫育開始后10 小時到72小時的時間內(nèi)間隔取樣的。結(jié)果顯示于表C中。在54種/菌株實驗細菌種，26 種不能將大豆黃素轉(zhuǎn)化為葛根黃豆苷元。在能夠?qū)⒋蠖裹S素轉(zhuǎn)化為葛根黃豆苷元的28中 生物體中，4種能快速轉(zhuǎn)化，需要10小時到24小時來實現(xiàn)基本上100%的轉(zhuǎn)化。有12種類 型的轉(zhuǎn)化是中等速率的，需要25到72小時來實現(xiàn)基本上完全的轉(zhuǎn)化。剩下的生物體提供 的轉(zhuǎn)化較慢，在72小時的溫育期內(nèi)低于50%的轉(zhuǎn)化完成。顯示快速轉(zhuǎn)化的生物體包括糞腸 球菌，植物乳桿菌，威氏利斯特氏菌(Listeriawelshimeri)，以及從馬糞便中分離的生物體 的混合培養(yǎng)物。在7種實驗植物乳桿菌菌株中，一種較快，四種為中等速率，而兩種為較慢 的轉(zhuǎn)化者。其它能夠?qū)⑵咸擒沼行мD(zhuǎn)化為糖苷配基的其它生物體包括脆弱擬桿菌，乳酸雙 歧桿菌，粘液真桿菌，干酪乳桿菌，嗜酸乳桿菌，德氏乳桿菌，副干酪乳桿菌，單核細胞增生 利斯特氏菌，藤黃微球菌，費氏丙酸桿菌和Sacharomyces boulardii。表C食物基質(zhì)中各種微生物將大豆黃素轉(zhuǎn)化為葛根黃豆苷元的速率(在37°C無氧條件下溫育)
權(quán)利要求
食品組合物，其包含食品組分和包含S 牛尿酚的添加劑組分。
2.權(quán)利要求1的食品組合物，其中所述食品組合物每份食品包含約Img至約300mg的 S-牛尿酚。
3.權(quán)利要求2的食品組合物。其中所述食品組合物每份食品包含約IOmg至約200mg 的S-牛尿酚。
4.權(quán)利要求1的食品組合物，其中所述添加劑還包含R-牛尿酚，該食品組合物具有非 外消旋比例的S-牛尿酚和R-牛尿酚。
5.權(quán)利要求1的食品組合物，其中所述S-牛尿酚在C-4'或C-7位置偶聯(lián)以形成選自 下列的偶聯(lián)物葡糖苷酸、硫酸酯、乙酸酯、丙酸酯、葡糖苷、乙酰_葡糖苷、丙二酰-葡糖苷 及其混合物。
6.權(quán)利要求1的食品組合物，其中所述添加劑組分基本上由S-牛尿酚組成。
7.權(quán)利要求1的食品組合物，其中所述S-牛尿酚由S-牛尿酚和牛尿酚的R-對映異構(gòu) 體(R-牛尿酚)的外消旋混合物中分離。
8.權(quán)利要求1的食品組合物，其中所述S-牛尿酚為自包含S-牛尿酚的組合物中的提 取物，該組合物通過生物體的異黃酮代謝在生物合成中產(chǎn)生。
9.權(quán)利要求1的食品組合物，其中所述食品組合物包括幼兒食品、胎兒食品或飲食食PΡΠ O
10.局部組合物，其包含牛尿酚，其中所述牛尿酚基本上由S-牛尿酚組成；和 載體。
11.權(quán)利要求10的局部組合物，其中所述S-牛尿酚以組合物重量的約0.至約10%的量存在。
12.權(quán)利要求10的局部組合物，其中所述S-牛尿酚在C-4'或C-7位置偶聯(lián)以形成選 自下列的偶聯(lián)物葡糖苷酸、硫酸酯、乙酸酯、丙酸酯、葡糖苷、乙酰-葡糖苷、丙二酰-葡糖 苷及其混合物。
13.權(quán)利要求10的局部組合物，其還包含R-牛尿酚，該組合物具有非外消旋比例的 S-牛尿酚和R-牛尿酚。
14.一種預(yù)防或治療哺乳動物的疾病或病癥的方法，其包括向所述哺乳動物給藥S-牛 尿酚或其偶聯(lián)的類似物，其中所述疾病或病癥包括選自下列的激素依賴性疾病或病癥心 血管疾病、降低的血管質(zhì)量、脂質(zhì)疾病、骨質(zhì)減少、骨質(zhì)疏松、肝臟疾病、急性卵巢雌激素缺 乏、良性乳腺癌、乳腺癌、良性前列腺癌、前列腺癌、皮膚癌、結(jié)腸癌、卵巢雌激素缺乏或抗雌 激素治療相關(guān)的血管舒縮障礙和盜汗、認知受損、癡呆，以及表現(xiàn)為短期或長期記憶喪失的 腦功能障礙。
15.權(quán)利要求14的方法，其中該方法包括給藥藥物組合物，該藥物組合物基本上由 S-牛尿酚和可藥用助劑、載體或賦形劑組成。
16.利要求15的方法，其中所述S-牛尿酚的對映體純度為90%最小對映體過量(EE)。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述S-牛尿酚的對映體純度為96%最小對映體過量 (EE)。
18.權(quán)利要求14的方法，其中該方法包括給藥藥物組合物，該藥物組合物包含對映異構(gòu)體純的S-牛尿酚作為活性劑和可藥用助劑、載體或賦形劑。
19.權(quán)利要求14的方法，其中所述S-牛尿酚以足以在哺乳動物的血漿中產(chǎn)生至少 5ng/mL的S-牛尿酚瞬時水平的量給藥。
20.權(quán)利要求14的方法，其中所述S-牛尿酚在C-4'或C-7位置偶聯(lián)以形成選自下列 的偶聯(lián)物葡糖苷酸、硫酸酯、乙酸酯、丙酸酯、葡糖苷、乙酰_葡糖苷、丙二酰_葡糖苷及其 混合物。
21.權(quán)利要求14的方法，其中該組合物以至少約ImgS-牛尿酚的劑量給藥于哺乳動物。
22.權(quán)利要求14的方法，其中所述S-牛尿酚以足以減少血液或血清中的脂質(zhì)水平的量給藥。
23.權(quán)利要求14的方法，其中所述S-牛尿酚以足以減少骨轉(zhuǎn)化的替代性標(biāo)記物或防止 通過骨鹽密度測定的骨質(zhì)流失的量給藥。
24.權(quán)利要求14的方法，其中所述S-牛尿酚以足以增加骨形成的量給藥。
25.權(quán)利要求14的方法，其中所述S-牛尿酚以足以防止骨質(zhì)疏松并減少骨折的量給藥。
26.權(quán)利要求14的方法，其中所述S-牛尿酚于食品或食品添加劑內(nèi)給藥。
27.權(quán)利要求14的方法，其中所述S-牛尿酚經(jīng)口服、經(jīng)直腸、經(jīng)眼、經(jīng)頰、經(jīng)腸胃外、經(jīng) 局部或透皮給藥。
28.一種預(yù)防或治療哺乳動物的疾病或病癥的方法，該方法包括向哺乳動物給藥S-牛 尿酚或其偶聯(lián)的類似物，其中所述疾病或病癥包括選自下列的非激素依賴性疾病或病癥 胃腸道、前列腺、乳腺、皮膚和骨的炎性疾病，以及腺瘤性息肉和家族性腸息肉病相關(guān)的病癥。
29.權(quán)利要求28的方法，其中該方法包括給藥藥物組合物，該藥物組合物基本上由 S-牛尿酚和可藥用助劑、載體或賦形劑組成。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述S-牛尿酚的對映體純度為90%最小對映體過量 (EE)。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述S-牛尿酚的對映體純度為96%最小對映體過量 (EE)。
32.權(quán)利要求28的方法，其中該方法包括給藥藥物組合物，該藥物組合物包含對映異 構(gòu)純的S-牛尿酚作為活性劑和可藥用助劑、載體或賦形劑。
33.權(quán)利要求28的方法，其中所述S-牛尿酚以足以在哺乳動物的血漿中產(chǎn)生至少 5ng/mL的S-牛尿酚瞬時水平的量給藥。
34.權(quán)利要求28的方法，其中所述S-牛尿酚在C-4'或C-7位置偶聯(lián)以形成選自下列 的偶聯(lián)物葡糖苷酸、硫酸酯、乙酸酯、丙酸酯、葡糖苷、乙酰_葡糖苷、丙二酰_葡糖苷及其 混合物。
35.權(quán)利要求28的方法，其中所述組合物以至少約ImgS-牛尿酚的劑量口服給藥于哺 乳動物。
36.權(quán)利要求28的方法，其中所述S-牛尿酚于食品或食品添加劑中給藥。
37.權(quán)利要求28的方法，其中所述S-牛尿酚經(jīng)口服、經(jīng)直腸、經(jīng)眼、經(jīng)頰、經(jīng)腸胃外、經(jīng)局部或透皮給藥。
38.權(quán)利要求14的方法，其中所述方法包括給藥藥物組合物，該藥物組合物包含治療 有效量的S-牛尿酚和可藥用助劑、載體或賦形劑，其中所述組合物基本上不含R-牛尿酚。
39.權(quán)利要求28的方法，其中該方法包括給藥藥物組合物，該藥物組合物包含治療有 效量的S-牛尿酚和可藥用助劑、載體或賦形劑，其中所述組合物基本上不含R-牛尿酚。
40.藥物組合物，其基本上由牛尿酚的R-對映異構(gòu)體(R-牛尿酚)和可藥用助劑、載體 或賦形劑組成。
41.權(quán)利要求40的藥物組合物，其中所述組合物通過從S-牛尿酚和R-牛尿酚的外消 旋混合物中分離R-牛尿酚制備。
42.權(quán)利要求40的藥物組合物，其中所述R-牛尿酚的對映體純度為90%最小對映體 過量(EE)。
43.權(quán)利要求42的藥物組合物，其中所述R-牛尿酚的對映體純度為96%最小EE。
44.一種向哺乳動物遞送R-牛尿酚以預(yù)防或治療疾病或病癥的方法，該方法包括向所 述哺乳動物給藥包含R-牛尿酚或其偶聯(lián)的類似物的組合物。
45.權(quán)利要求40的組合物，其中所述R-牛尿酚在C-4'或C-7位置偶聯(lián)以形成選自下 列的偶聯(lián)物葡糖苷酸、硫酸酯、乙酸酯、丙酸酯、葡糖苷、乙酰-葡糖苷、丙二酰-葡糖苷及 其混合物。
46.藥物組合物，其包含對映異構(gòu)純的R-牛尿酚作為活性劑以及可藥用助劑、載體或 賦形劑。
47.配制用于口服消費或局部應(yīng)用的組合物，其包含R-牛尿酚，其中該組合物基本上 不含S-牛尿酚。
48.權(quán)利要求47的組合物，其中該組合物為食品、藥物、非處方藥物、油膏、液體或乳膏。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于制備商品食物和護膚品的組合物，所述組合物包含S-牛尿酚，或R-牛尿酚，或其混合物，包括S-牛尿酚和R-牛尿酚的非外消旋混合物和外消旋混合物，所述組合物可用于制備商品例如食品添加劑、藥物和藥劑。所述組合物可用于將S-牛尿酚遞送到哺乳動物以預(yù)防或治療疾病或相關(guān)病情的方法中，所述疾病或病情例如激素依賴的疾病或病情，例如心血管疾病，脂質(zhì)疾病，骨質(zhì)減少，骨質(zhì)疏松，肝臟疾病和急性卵巢雌激素缺乏。所述S-牛尿酚對映體可由生物體對異黃酮的代謝在生物合成中產(chǎn)生。
文檔編號A01N37/00GK101965974SQ20101015601
公開日2011年2月9日 申請日期2003年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月24日
發(fā)明者悉尼·J·科爾, 肯尼思·D·R·塞特切爾 申請人:兒童醫(yī)院醫(yī)療中心;澳大利亞健康及營養(yǎng)品協(xié)會有限公司