專利名稱：：一株能夠吸附霉菌毒素的糞腸球菌及其在吸附霉菌毒素中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及的一株能夠吸附霉菌毒素的糞腸球菌，菌種命名為EnterococcusfaecalisSRG，已與2010年03月02日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)為CCTCCM2010046。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明實(shí)施例1能夠吸附霉菌毒素的糞腸球菌EnterococcusfaecalisSRGCCTCCM2010046的篩選、培養(yǎng)及對(duì)霉菌毒素吸附作用的檢測1.主要儀器試劑試劑MRS培養(yǎng)基，苯，己腈，次氯酸鈉溶液，AFB1檢測試劑盒，水合硅鋁酸鹽；儀器與主要耗材10mL離心管，大、中、小槍頭，酶標(biāo)儀(Thermo)。2.試驗(yàn)菌株①實(shí)驗(yàn)室原有的菌株LP，7340，RDH，F(xiàn)LQ，ZYRLQ，SRG，RS1XL。②雞腸道以及牛糞中分離的菌株無菌取雞腸內(nèi)容物/新鮮牛糞5g，加入裝有50mL滅菌生理鹽水的帶玻璃珠的三角瓶中，混勻后再添加2%CaC03的MRS培養(yǎng)基平板劃線分離，37t:培養(yǎng)24h，挑取有Ca2+圈的菌落，繼續(xù)在平板中劃線純化，然后進(jìn)行菌體形態(tài)的觀察和屬的鑒定，將純化后的乳酸菌接種于相應(yīng)的試管斜面中，挑取乳酸菌屬的菌株備用，挑選出來的菌株的特性如表1所示。由表1可知，Rl、R2、R5均為球菌，平板上培養(yǎng)為乳白色或白色圓形菌落；R3、R4為桿菌，平板上培養(yǎng)為乳白色或白色圓形菌落。表1乳酸菌的形狀特征<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>③黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)惠贈(zèng)的乳酸菌菌株NK1、NK5、GLRSG。3.初篩3.1乳酸菌發(fā)酵液pH值的測定測定結(jié)果見表2。由表2可知，在發(fā)酵過程中乳桿菌比乳球菌的終pH值低，在這幾株乳酸菌中以7340發(fā)酵液的pH最低為3.42，其次為GLSRG、LP、RSG0131和SRG的pH值較低，分別為3.58、3.63、4.08、4.13。表2乳酸菌發(fā)酵液的pH值<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3.2乳酸菌菌株吸附AFB1性能的測定3.2.1吸附時(shí)間(lh、2h)對(duì)乳酸菌吸附率的影響分別將乳酸菌接種到MRS(pH6.5)液體培養(yǎng)基中，37。C厭氧培養(yǎng)24h，分別取5mL乳酸菌培養(yǎng)液于無菌的離心管中，4°C、5000rpm離心5min，棄上清液，在沉淀的乳酸菌細(xì)胞中加入生理鹽水，輕輕吹打，重復(fù)離心1次，加入10iiL黃曲霉毒素Bl苯-乙晴溶液(AFB1濃度為100g/mL)。將混有AFBl的乳酸菌細(xì)胞懸液在37°C，180rpm振蕩條件下培養(yǎng)lh和2h。在4"以10000rpm離心10min，棄上清液，并向沉淀中加入5mL生理鹽水并重復(fù)離心1次，用試劑盒2次離心所得上清液中黃曲霉毒素B1的量。按下列公式計(jì)算乳酸菌吸附AFB1的強(qiáng)度乳酸菌吸附黃曲霉毒素Bl的強(qiáng)度(％)=(1-上清液中AFB1的量/實(shí)驗(yàn)前加入標(biāo)準(zhǔn)的AFB1量)X100%。結(jié)果見表3。表3吸附時(shí)間(lh、2h)對(duì)乳酸菌吸附率的影響乳酸菌菌株7340FIX)ZYRLQRG0131(R4)NK5由表3可知，乳酸菌與黃曲霉毒素Bl混合lh與2h，對(duì)乳酸菌的吸附能力差異無顯著性(P>0.05)。同時(shí)可以得出，不同的乳酸菌菌株吸附AFB1的能力存在差異。3.2.2不同乳酸菌菌株吸附AFB1性能的比較試驗(yàn)選取15株性能優(yōu)良的乳酸菌菌株，測定其對(duì)AFB1的吸附能力，乳酸菌與黃曲霉毒素B1混合時(shí)間為lh。方法同3.2.1，結(jié)果見表4。表415株不同乳酸菌菌株吸附AFB1性能的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由表4可知，不同菌株對(duì)AFB1的吸附能力差異顯著，其中GLRSG和SRG對(duì)AFB1的去除能力較強(qiáng)，分別為67.67%和41.95%，可以選作備用菌株。3.3滅活處理對(duì)乳酸菌黏附性能的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>無菌取5mL乳酸菌發(fā)酵液，IO(TC煮沸10min滅活處理。檢測方法同3.2.1，結(jié)果見表5。表5滅活處理對(duì)乳酸菌黏附性能的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表5可以看出，滅活處理對(duì)乳酸菌吸附能力有一定的影B向，滅活處理對(duì)不同菌株吸附AFB1的能力具有差異性。SRG經(jīng)過滅活之后其對(duì)AFB1的吸附能力由41.46%上升至57.54X，而GLRSG經(jīng)過滅活之后其對(duì)AFB1的吸附能力減弱。3.4膽鹽對(duì)篩選菌株存活的影響試驗(yàn)選取pH較低的SRG和GLRSG菌株，菌液按5X(v/v)接種于膽鹽濃度為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%(w/v)的PBS中，以不加膽鹽的PBS緩沖液為對(duì)照，在37t:條件下培養(yǎng)10min后，取樣進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。篩選菌株存活率計(jì)算公式a/a。X100%。a。各處理的活菌數(shù)。表6膽鹽MRS培養(yǎng)基中乳酸菌的存活率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從表6可以看出，在MRS膽鹽培養(yǎng)基中，SRG對(duì)膽鹽的耐受性比GLRSG耐受膽鹽的能力強(qiáng)，在0.1%、0.2%的膽鹽濃度中SRG的存活率在80%以上，在膽鹽濃度高達(dá)5%時(shí)，仍然有1.15%的SRG存活下來，SRG在膽鹽MRS中的存活率顯著高于GLRSG的存活水平。3.5水合硅鋁酸鹽與乳酸菌的復(fù)配取一定量的水合硅鋁酸鹽與乳酸菌發(fā)酵液(活菌數(shù)為20億)按照不同的比例混合，本試驗(yàn)分為5個(gè)濃度梯度，每升乳酸菌菌液中加入水合硅鋁酸鹽的量分別為0.OOmg，0.20mg，0.40mg，0.60mg，0.80mg，搖勻，加入100yL黃曲霉毒素B苯-乙晴溶液(AFB1濃度為100iig/mL)?；旌弦涸?7。C下，180rpm培養(yǎng)lh。4°C以lOOOOrpm離心10min，將沒有結(jié)合的霉菌毒素(仍在溶液中)與結(jié)合型霉菌毒素(在吸附劑中)分離，并向沉淀中加入5mL生理鹽水并重復(fù)離心1次，棄上清液，用試劑盒2次離心所得上清液中黃曲霉毒素B1的量。試驗(yàn)結(jié)果見表7。表7水合硅鋁酸鹽與乳酸菌的復(fù)配效果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>由表7可知，SRG在沒有加入水合硅鋁酸鹽的條件下，其去除AFB1的能力可達(dá)98.10%，而此時(shí)GLRSG對(duì)AFB1的去除能力低于90%。當(dāng)水合硅鋁酸鹽的濃度為0.20%0時(shí)，SRG組對(duì)AFB1的吸附能力達(dá)99.24%，高于GLRSG組95.83%的吸附力，當(dāng)水合硅鋁酸鹽的濃度為0.40%。時(shí)，SRG組與GLRSG組對(duì)AFB1的吸附能力差異不大，分別為98.05%和98.18%，當(dāng)水合硅鋁酸鹽的濃度為0.60。；時(shí)，GLRSG組去除AFB1的能力為98.34%，而水合硅鋁酸鹽的濃度為0.60%。時(shí)SRG組以及水合硅鋁酸鹽的濃度為0.80%。時(shí)，SRG和GLRSG兩組對(duì)AFB1的吸附力未能測出，這可能是由于試劑盒的靈敏度所造成的，其測定區(qū)間為5ng/g-1000ng/g，說明溶液中AFB1的濃度已低于5ng/g，基本上已經(jīng)吸附干凈。4.試驗(yàn)結(jié)論通過試驗(yàn)可以得出以下結(jié)論①乳酸菌對(duì)AFB1吸附能力的大小與乳酸菌的產(chǎn)酸能力沒有明顯的相關(guān)性；②乳酸菌對(duì)AFB1的吸附作用迅速，在lh內(nèi)就能充分發(fā)揮吸附作用；③通過試驗(yàn)篩選出兩株對(duì)AFB1吸附能力較強(qiáng)的乳酸菌菌株，分別為SRG和GLRSG，滅活菌也具有對(duì)AFB1的吸附能力，并且不同的菌株滅活后吸附AFB1能力的變化不同；⑤SRG發(fā)酵液的活菌數(shù)高，對(duì)膽鹽的耐受能力比GLRSG對(duì)膽鹽的耐受能力強(qiáng)，綜合滅活菌對(duì)AFB1的吸附性能與水合硅鋁酸鹽復(fù)配效果，是實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中最優(yōu)良的菌株。對(duì)篩選出來的最優(yōu)良的菌株進(jìn)行鑒定，確定其為乳酸菌家族中的糞腸球菌，對(duì)其進(jìn)行保藏，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種命名為EnterococcusfaecalisSRG，保藏日期為2010年03月02日，保藏編號(hào)為CCTCCM2010046。該菌株的生物學(xué)特性為細(xì)胞球形或卵圓形，O.62.OiimXO.62.5iim，在液體培養(yǎng)基中呈成對(duì)或短鏈；不生芽孢；革蘭氏陽性；有時(shí)以鞭毛運(yùn)動(dòng)；沒有明顯的莢膜；兼性厭氧；化能異養(yǎng)，發(fā)酵代謝；可發(fā)酵的碳水化合物范圍廣泛，主要產(chǎn)L(+)-乳酸，但不產(chǎn)氣，最終pH4.24.6，營養(yǎng)需要復(fù)雜；接觸酶陰性；通常在1045t:能生長，最適37t:，在pH9.6、6.5%NaCl中和40%膽堿中也能生長；很少還原硝酸鹽；通常發(fā)酵乳糖；通常為Lancefield血清D群。培養(yǎng)基可以為MRS培養(yǎng)基，配方為葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L，調(diào)節(jié)pH5.56.7，115t:條件下滅菌20分鐘；其中，金屬離子混合液的配方是乙酸鈉5g/L、檸檬酸銨2g/L、磷酸氫二鉀5g/L、硫酸鎂0.5g/L、硫酸錳0.2g/L、吐溫_801mL/L，pH5.56.7，固體加瓊脂粉1.52.0%。培養(yǎng)條件為pH5.56.7，溫度3042°C。實(shí)施例2糞腸球菌SRG特性的研究1材料與方法1.1試驗(yàn)材料糞腸球菌保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCM2010046;大腸桿菌Op雞金黃色葡萄球菌-C56011:均購自中監(jiān)所；試驗(yàn)儀器電子天平、水浴鍋、微波爐、雙目顯微鏡、干燥器、高速冷凍離心機(jī)、水平離心機(jī)、垂直凈化工作臺(tái)等。1.2試驗(yàn)方法1.2.l革蘭氏染色法蘸取稀釋液于MRS瓊脂平板劃線接種，分別采用需氧、焦性沒食子酸法及燭缸法，在37t:培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24h.每種方法均挑取5個(gè)典型菌落做革蘭氏染色，鏡檢，并做純培養(yǎng)。1.2.2產(chǎn)酸性能的測定將試驗(yàn)菌株在MRS液體培養(yǎng)基中37t:厭氧培養(yǎng)24h，同時(shí)做空白，設(shè)3個(gè)重復(fù)，用無菌注射器取3mL發(fā)酵液于10mL離心管，用酸度計(jì)測其pH值。1.2.3耐酸性試驗(yàn)。取發(fā)酵24h的菌液10mL，3000rpmin離心15min，棄上清，將菌體用生理鹽水洗滌3次，先加入生理鹽水5mL，1Omol/L的鹽酸調(diào)節(jié)糞腸球菌的菌懸液的pH值分別為2.0、3.0、4.O，然后用生理鹽水定容至10mL，于37t:處理2h。取菌懸液，在平皿上作菌落計(jì)數(shù)，從而計(jì)算出糞腸球菌的存活率，以pH5.56.0的菌液為對(duì)照。存活率(％)=待測pH的菌液活菌數(shù)/pH5.56.0的菌液活菌數(shù)X100%。1.2.4體外抑菌試驗(yàn)雙碟的制備取直徑90mm的平底雙碟，注入滅菌的營養(yǎng)瓊脂(1.5%v/v)15mL，水平放置使之凝固，作為底層，另取營養(yǎng)瓊脂(濃度為0.8%，冷至5(TC左右)與37t:24h培養(yǎng)的指示菌液適量(50mL培養(yǎng)基加2mL左右)混勻，取6mL鋪在底層培養(yǎng)基上，水平放置使之凝固，作為菌層。加樣品用無菌鑷子夾取已滅菌的牛津杯，打開皿蓋，放在培養(yǎng)基上。在牛津杯中加滿相同量的糞腸球菌菌液(300iiL)，每個(gè)樣品三個(gè)重復(fù)。將加完樣的雙碟小心放入37t:恒溫箱內(nèi)，培養(yǎng)15h后(以金黃色葡萄球菌和雞大腸桿菌OJ乍指示菌)取出測量抑菌圈直徑。1.2.5膽鹽對(duì)糞腸球菌存活的影響菌液按5%(v/v)接種于膽鹽濃度為O.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%(w/v)的MRS培養(yǎng)基中，以不加膽鹽的MRS培養(yǎng)基為對(duì)照，在37t:條件下培養(yǎng)10min后，取樣進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算糞腸球菌存活率。1.2.6糞腸球菌粘附試驗(yàn)糞腸球菌對(duì)胃腸道粘液黏附力的測定粘液制備打開動(dòng)物腹腔，無菌取空腸回腸，分別用lmL無菌NSS液沖洗腸腔3次，剪開，每部分取12g粘液，-201:保存?zhèn)溆谩＜S腸球菌的粘附取12孔或24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，實(shí)驗(yàn)組各加0.5mL或0.25mL粘液，11每種粘液平行3個(gè)孔，4t:過夜固定。然后每孔加1.0mL或0.5mLNSS液洗滌2次，除去未粘附的粘液，每孔加等量0.5mL或0.25mL標(biāo)記菌懸液。另以0.5mL或0.25mL標(biāo)記菌懸液作陽性對(duì)照，2『C孵育2h。除陽性對(duì)照夕卜，再用1.0mL或0.5mLNSS洗去未粘附細(xì)菌。計(jì)數(shù)將吸出的懸液和每次的洗滌液都裝入小離心管中，以備計(jì)數(shù)。菌體計(jì)數(shù)采用梯度稀釋的方法，計(jì)算出未粘附的總菌量，最后計(jì)算出該菌粘附的百分率。2結(jié)果2.1菌株的形態(tài)學(xué)觀察3種方法經(jīng)37t:培養(yǎng)24h，均生長出乳白色、隆起、濕潤光亮、邊緣整齊的小菌落，但需氧培養(yǎng)的菌落明顯小于厭氧法及CO培養(yǎng)法。革蘭氏染色為陽性，卵圓形球菌，端頭，呈"棗核狀"，菌體單個(gè)，23個(gè)存在，并有67個(gè)菌體短鏈狀。2.2菌株pH值的測定結(jié)果見表8。表8糞腸球菌發(fā)酵液的pH值<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>從表8可以得出，此株糞腸球菌的產(chǎn)酸性能是比較強(qiáng)的。2.3耐酸性試驗(yàn)結(jié)果見表9。表9糞腸球菌耐酸性試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由表9可以得出，所分離的糞腸球菌在pH2.0、3.0、4.0時(shí)的存活率分別為51.0%、87.2%、98.4%，說明該菌具有較強(qiáng)的耐酸性。2.4菌株的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果見表10。表10糞腸球菌原液的抑菌圈直徑單位mm<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由表10可以得出，該菌株對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌圈平均直徑達(dá)到20mm和18mm左右。2.5膽鹽對(duì)糞腸球菌存活的影響結(jié)果見表11。表11膽鹽對(duì)糞腸球菌的影響菌種0.1膽鹽濃度(％)0.20.30.40.5糞腸球菌的存活率(％)10082.122.14.101.15從表ll可以得出，在MRS培養(yǎng)基中，膽鹽對(duì)糞腸球菌的影響比較小，膽鹽濃度為0.3%時(shí)的存活率仍能達(dá)到22.1%。2.6糞腸球菌粘附試驗(yàn)結(jié)果見表12。表12糞腸球菌粘附試驗(yàn)活菌數(shù)(><108cfU/mL)CK未粘附的菌懸未粘附的菌懸未粘附的菌懸液l液2液3糞腸球菌1.000.160.220.23由表12可以看出，該株糞腸球菌的粘附率能達(dá)到79.9%，說明該菌株的粘附性能比較強(qiáng)的。3結(jié)論正常菌群是指正常人和動(dòng)物的體表或體內(nèi)常在的菌群，它們的種類、數(shù)量很多。在正常情況下，與宿主、環(huán)境三者之間形成一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的微生態(tài)系統(tǒng)，與宿主的生長、發(fā)育、物質(zhì)代謝、衰老等有密切關(guān)系。某些益生菌可通過人為地添加，重建動(dòng)物體的部分微生態(tài)環(huán)境，以達(dá)到促進(jìn)消化吸收、提供營養(yǎng)素、調(diào)節(jié)免疫功能抵御病原菌侵入的目的，這些作用的產(chǎn)生取決于益生菌是否能夠粘附于宿主的特定部位，進(jìn)而在該部位定植。本試驗(yàn)表明，該株糞腸球菌既具有較強(qiáng)的定植能力，又能夠?qū)Υ竽c桿菌和金黃色葡萄球菌產(chǎn)生較好的抑制作用，因此它可以作為優(yōu)良糞腸球菌微生態(tài)制劑的開發(fā)菌株。實(shí)施例3制備生物脫霉劑步驟如下(l)發(fā)酵(i)菌種選用糞腸球菌EnterococcusfaecalisSRGCCTCCM2010046;(ii)斜面培養(yǎng)將凍干粉菌種接種于固體斜面培養(yǎng)基上，在37t:培養(yǎng)24h;(iii)—級(jí)種子培養(yǎng)將培養(yǎng)好的斜面，在無菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于80mL種子液體培養(yǎng)基中，在37t:條件下，靜置培養(yǎng)12h，制得一級(jí)種子液；(iv)擴(kuò)大培養(yǎng)以5%(v/v)的接種量，將一級(jí)種子液接于800mL種子液體培養(yǎng)基中，在37t:條件下，靜置培養(yǎng)8h，制得二級(jí)種子液；(v)發(fā)酵罐培養(yǎng)以5%(v/v)的接種量，將二級(jí)種子液接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37t:條件下，靜置培養(yǎng)16h;(vi)收集發(fā)酵產(chǎn)物待步驟(v)之發(fā)酵液黏度達(dá)130000cP時(shí)，收集發(fā)酵液；上述步驟(iii)、(iv)所述種子液體培養(yǎng)基配方為葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L，調(diào)節(jié)pH6.0，115t:條件下滅菌20分鐘；步驟(ii)所述固體斜面培養(yǎng)基為上述種子液體培養(yǎng)基中添加1.5%的進(jìn)口瓊脂粉；步驟(v)中所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L，調(diào)節(jié)pH6.0;其中，13金屬離子混合液的配方是乙酸鈉5g/L、檸檬酸銨2g/L、磷酸氫二鉀5g/L、硫酸鎂0.5g/L、硫酸錳0.2g/L、吐溫-801mL/L，pH6.0。(2)取水合硅鋁酸鹽，與步驟(1)中得到的發(fā)酵液混合，得復(fù)配液，即為生物脫霉劑，混合后，水合硅鋁酸鹽的質(zhì)量濃度為0.08%;(3)將步驟(2)中得到的復(fù)配液加入到飼料中，混合均勻。使用時(shí)，根據(jù)具體情況添加到飼料中當(dāng)需要預(yù)防飼料霉變時(shí)，其添加量為飼料重量的0.050.10%，當(dāng)需要清除霉菌毒素時(shí)，其添加量為飼料重量的0.100.20%。實(shí)施例4生物脫霉劑體外吸附效果在霉變飼料中加入本發(fā)明的實(shí)施例3制備的生物脫霉劑之后，結(jié)果見表13，可以看到，各試驗(yàn)組中的AFB1均被不同程度地吸附，其中添加2.00。；的生物脫霉劑組對(duì)AFB1的吸附率在99.75%以上，飼料中的黃曲霉毒素基本上已經(jīng)被完全吸附，而添加1.50%。的生物脫霉劑組對(duì)AFB1的吸附率高達(dá)98.05%，脫霉效果非常顯著。表13生物脫霉劑體外吸附AFB1試驗(yàn)生物脫霉劑含量(％()AFB1剩余ng/g吸附率(°/。)0.50806.259.691.00355.682.221.5019.05.98.052.0055.00299.75實(shí)施例5生物脫霉劑體內(nèi)脫毒效果(—)全收糞試驗(yàn)檢測霉必吸對(duì)AFB1的脫毒效果為了檢測霉必吸對(duì)黃曲霉毒素B1(AFB1)的脫毒性能，采用全收糞法檢測了動(dòng)物食用霉變飼料后，被霉必吸吸附而隨之排除體外的黃曲霉毒素Bl占食入總量的比例，以此確定霉必吸的脫毒效果。l試驗(yàn)材料與試驗(yàn)動(dòng)物霉變玉米玉米粉于25°C3(TC，水分含量為15%的條件下發(fā)霉35天，6(TC烘干，粉碎。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用體重相近、采食正常、健康的蛋雞作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，供試雞分為3組，每組4只(設(shè)4個(gè)重復(fù))。手術(shù)縫合針、線、強(qiáng)飼器、50mL塑料收糞瓶2試驗(yàn)方法2.l試驗(yàn)進(jìn)程試驗(yàn)分為預(yù)試期、正試期以及體況恢復(fù)期三個(gè)階段，正試期包括禁食排空、強(qiáng)飼和糞尿排泄物收集三個(gè)過程，其進(jìn)程見表14。表14飼喂時(shí)間和飼喂方法<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>2.2排泄物的收集與處理強(qiáng)飼后立即裝好集糞瓶，以重復(fù)組為單位收集48h的排泄物，12h收集一次，排泄物取出后于6(TC烘干，室內(nèi)回潮24h，稱重，作為每個(gè)重復(fù)組雞的平均風(fēng)干排泄物總量，粉碎，過40目篩，混合均勻后裝入取樣袋內(nèi)封存。2.3AFB1的提取與含量測定按照GB樣品脂肪含量《3%的AFBl提取方法進(jìn)行提取。AFBl的含量使用AFBl檢測試劑盒(北京市營養(yǎng)源生物研究所)測定，操作方法依照說明書。3試驗(yàn)結(jié)果表15生物脫霉劑體內(nèi)吸附AFBl試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表16不同組別AFBl排出率的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>如表15、16所示，空白對(duì)照組糞便AFB1的總量占霉變玉米中AFB1總量的38.2%，有大量的AFBl沒有隨糞便排出而殘留在動(dòng)物體內(nèi)。霉變玉米中加入1%。的生物脫霉劑之后，50.44X的AFB1隨糞便排出體外。霉變玉米中加入2%。的生物脫霉劑效果最好，AFBl的排出率達(dá)72.3%，脫霉效果顯著。生物脫霉劑將生物脫酶和物理吸附結(jié)合起來，顯著調(diào)高了霉菌毒素隨糞便的排出率?；谏鲜龅膶?shí)驗(yàn)，本發(fā)明的發(fā)明人建議使用本發(fā)明的生物脫霉劑的使用添加量如下按照1.0%。的比例添加，可以吸附飼料中不容易被肉眼蔡覺的微量霉菌毒素，達(dá)到預(yù)防霉菌毒素中毒的目的；而對(duì)于輕度霉變的飼料，添加1.5%。的生物脫霉劑，可以達(dá)到防霉脫毒的效果，預(yù)防家畜食用霉變飼料后中毒；中度以上能夠用肉眼發(fā)覺霉變嚴(yán)重的飼料，應(yīng)當(dāng)先將霉變飼料分散，降低霉菌毒素的濃度，再添加2.Oo;的生物脫霉劑進(jìn)行脫毒。(二)霉必吸對(duì)維生素吸附性的檢測為了檢測霉必吸對(duì)飼料中維生素類物質(zhì)的影響，考慮本實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況，選擇維生素C作為檢測對(duì)象，測定霉必吸對(duì)Ve的吸附性。l試劑與儀器6%(v/v)冰乙酸、0.5%(g/v)淀粉指示液、0.lmol/L碘標(biāo)準(zhǔn)液儀器設(shè)備為普通實(shí)驗(yàn)室設(shè)備2測定方法稱取試樣0.2g(準(zhǔn)確至0.0002g)，加新煮沸過的冷水lOOmL與冰乙酸溶液10mL使其溶解，加入霉必吸1.0%。組和2.0%。組，并設(shè)立空白對(duì)照組，180rpm搖床放置lh，加淀粉指示劑lmL，立即用0.lmol/L碘標(biāo)準(zhǔn)液滴定，至溶液藍(lán)色在30s內(nèi)不退。試樣中維生素C的含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)按下面公式計(jì)算。權(quán)利要求一株能夠吸附霉菌毒素的糞腸球菌，其特征在于該菌種命名為EnterococcusfaecalisSRG，已與2010年03月02日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)為CCTCCM2010046。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能夠吸附霉菌毒素的糞腸球菌，其特征在于其生物學(xué)特性如下細(xì)胞球形或卵圓形，0.62.0iimXO.62.5iim，在液體培養(yǎng)基中呈成對(duì)或短鏈；不生芽孢；革蘭氏陽性；有時(shí)以鞭毛運(yùn)動(dòng)；沒有明顯的莢膜；兼性厭氧；化能異養(yǎng)，發(fā)酵代謝；可發(fā)酵的碳水化合物范圍廣泛，主要產(chǎn)L(+)-乳酸，但不產(chǎn)氣，最終pH4.24.6，營養(yǎng)需要復(fù)雜；接觸酶陰性；通常在1045t:能生長，最適37。C，在pH9.6、6.5%NaCl中和40%膽堿中也能生長；很少還原硝酸鹽；通常發(fā)酵乳糖；通常為Lancefield血清D群。3.權(quán)利要求1所述的能夠吸附霉菌毒素的糞腸球菌在吸附霉變飼料中含有的霉菌毒素中的應(yīng)用。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用涉及的方法步驟如下(1)發(fā)酵選用糞腸球菌EnterococcusfaecalisSRGCCTCCM2010046，發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基MRS培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為pH5.56.7，溫度3042°C;得發(fā)酵液；(2)取水合硅鋁酸鹽，與步驟(1)中得到的發(fā)酵液混合，得復(fù)配液，混合后，水合硅鋁酸鹽的質(zhì)量濃度為0.050.10%;(3)將步驟(2)中得到的復(fù)配液加入到飼料中，混合均勻，預(yù)防飼料霉變時(shí)，其添加量為飼料重量的0.050.1%，清除霉菌毒素時(shí)，其添加量為飼料重量的0.100.20%。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述發(fā)酵的具體步驟如下(i)菌種選用糞腸球菌EnterococcusfaecalisSRGCCTCCM2010046;(ii)斜面培養(yǎng)將凍干粉菌種接種于固體斜面培養(yǎng)基上，在3042t:培養(yǎng)2028h;(iii)一級(jí)種子培養(yǎng)將培養(yǎng)好的斜面，在無菌條件下用接種環(huán)接13環(huán)于50mLlOOmL種子液體培養(yǎng)基中，在3042t:條件下，靜置培養(yǎng)1014h，制得一級(jí)種子液；(iv)擴(kuò)大培養(yǎng)以5%的接種量，將一級(jí)種子液接于500mLlOOOmL種子液體培養(yǎng)基中，在3042t:條件下，靜置培養(yǎng)512h，制得二級(jí)種子液；(v)發(fā)酵罐培養(yǎng)以5%的接種量，將二級(jí)種子液接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于3042°C條件下，靜置培養(yǎng)1220h;(vi)收集發(fā)酵產(chǎn)物待步驟(v)之發(fā)酵液黏度達(dá)1200015000cP時(shí)，收集發(fā)酵液；上述步驟(iii)、(iv)所述種子液體培養(yǎng)基配方為葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L，調(diào)節(jié)pH5.56.7，115t:條件下滅菌20分鐘；步驟(ii)所述固體斜面培養(yǎng)基為上述種子液體培養(yǎng)基中添加1.52.0%的瓊脂粉；步驟(v)中所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L，調(diào)節(jié)pH5.56.7;其中，金屬離子混合液的配方是乙酸鈉5g/L、檸檬酸銨2g/L、磷酸氫二鉀5g/L、硫酸鎂0.5g/L、硫酸錳0.2g/L、吐溫-801mL/L，pH5.56.7。全文摘要本發(fā)明公開了一株能夠吸附霉菌毒素的糞腸球菌，菌種命名為EnterococcusfaecalisSRG，已與2010年03月02日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)為CCTCCM2010046。本發(fā)明的糞腸球菌能夠吸附霉菌毒素，吸附能力較強(qiáng)，可以單獨(dú)或與水合硅鋁酸鹽復(fù)配作為飼料的脫霉劑應(yīng)用。本發(fā)明的糞腸球菌在脫霉的同時(shí)，還具有其基本的生物保健功能。將其與具有較強(qiáng)霉菌吸附能力的水合硅鋁酸鹽復(fù)配起來，不僅通過物理吸附性作用達(dá)到脫霉的效果，還能通過糞腸球菌的生物活性起到防霉、脫霉、保健的功效。文檔編號(hào)A23K1/00GK101792726SQ20101013170公開日2010年8月4日申請(qǐng)日期2010年3月25日優(yōu)先權(quán)日2010年3月25日發(fā)明者單寶龍,張建梅,谷巍申請(qǐng)人:山東寶來利來生物工程股份有限公司