專利名稱：一株具提高大豆對(duì)除草劑抗性的寡養(yǎng)單胞菌及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株處理大豆種子后可提高大豆對(duì)大 豆敏感除草劑產(chǎn)生抗性的寡養(yǎng)單胞菌及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
我國是大豆的故鄉(xiāng)，全國大豆種植面積達(dá)8000萬畝以上，每年大豆產(chǎn)量達(dá)1600多 萬噸。隨著農(nóng)村土地流轉(zhuǎn)和耕作規(guī)模擴(kuò)大以后，人工除草越來越受到限制，但目前大豆田的 化學(xué)除草劑對(duì)玉米的藥害比較大，而玉米田的除草劑對(duì)大豆的藥害也比較大，導(dǎo)致玉米和 大豆的間作難以實(shí)現(xiàn)。因此，如果對(duì)大豆種子進(jìn)行微生物處理后可以使大豆抵抗對(duì)大豆敏 感的玉米田除草劑，就可以解決大豆和玉米混種問題，同時(shí)，可以解決玉米前茬使用玉米田 除草劑對(duì)后茬種植大豆的藥害問題。
除草劑阿特拉津(Atrazine)又名莠去津，全稱為2_氯-乙胺_6_異丙胺_1，3， 5_三嗪，是一種廣泛使用于玉米田的除草劑。阿特拉津是選擇性內(nèi)吸傳導(dǎo)型苗前、苗后除草 齊U，用于玉米、高粱、甘蔗、果樹、林地等，可防除一年生禾本科雜草和闊葉雜草，對(duì)某些多年 牛雜草也有一定的抑制作用。目前，阿特拉津在世界各地得到了大面積的使用。在美國，阿 特拉津被列為使用最廣泛的除草劑之一。在1980-1990年間，每年噴灑阿特拉津達(dá)8000萬 磅，1986年，瑞典全國施用了 120t的阿特拉津。20世紀(jì)60年代以來，許多國家均致力于尋找高效降解阿特拉津的微生物。到目前 為止，已分離出能徹底降解阿特拉津的單菌株。阿特拉津生物降解機(jī)理的研究也獲得了迅 速發(fā)展。近兩年來，國內(nèi)也開始了阿特拉津生物降解的研究報(bào)道，但缺乏利用微生物的誘導(dǎo) 使敏感農(nóng)作物產(chǎn)生對(duì)阿特拉津的抗性研究。由于阿特拉津具有難降解和在土壤中持留期長的特點(diǎn)，容易影響后茬敏感作物正 常生長，尤其對(duì)豆科作物危害更大。因此，阿特拉津的環(huán)境問題得到了廣泛的關(guān)注。為了消 除阿特拉津在農(nóng)田環(huán)境中的殘留對(duì)后茬豆科作物的影響，本研究分離、篩選可以誘導(dǎo)大豆 產(chǎn)生抗阿特拉津的菌株，通過此種方法使大豆生長不受阿特拉津殘留或阿特拉津的影響， 為豆科作物抗均三氮苯類除草劑的研究提供基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是選擇一株菌株處理大豆種子可以使大豆產(chǎn)生對(duì)其敏感除草劑產(chǎn) 生抗性，將菌株按常規(guī)液體發(fā)酵培養(yǎng)后，該菌體活體或代謝產(chǎn)物可以形成生物農(nóng)藥用于處 理大豆種子，使大豆產(chǎn)生對(duì)阿特拉津的抗性。本發(fā)明篩選到的一株處理大豆種子可以使大豆產(chǎn)生對(duì)除草劑莠去津(阿特拉津) 產(chǎn)生抗性的細(xì)菌菌株是Sneb 42，其分類學(xué)命名為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)Sneb 42，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保 藏日期2010年2月1日；保藏登記入冊(cè)的編號(hào)CGMCC No. 3620。嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)Sneb 42該菌株是段玉璽于2006年5月從中國遼寧省沈 陽市沈河區(qū)沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)地土壤細(xì)菌菌株中篩選出的一個(gè)細(xì)菌菌株。本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)，獲得的這株土壤細(xì)菌及其液體發(fā)酵產(chǎn)物處理大豆種子后可 專一使大豆產(chǎn)生對(duì)大豆敏感除草劑阿特拉津產(chǎn)生抗性。本發(fā)明的細(xì)菌菌株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia) Sneb 42 是通過試管種培養(yǎng)后，再經(jīng)擴(kuò)大發(fā)酵培養(yǎng)來制備，其具體方法如下1.試管種培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為牛肉膏蛋白胨(NA)培養(yǎng)基，即成分牛肉浸膏3g，蛋白胨10g，酵母 浸膏l(xiāng)g，蔗糖10g，瓊脂20g，加水至IOOOmL02.液體發(fā)酵培養(yǎng)其中液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為以重量百分比計(jì)，含有牛肉浸膏0. 2% -0. 4%、蛋白 胨_2%、酵母浸膏0. 1% -0.5%、蔗糖_2%、余下為蒸餾水，pH為7-8。將試管種接種到250mL三角瓶(每瓶裝IOOmL)液體培養(yǎng)基中，25°C 28°C下，搖 床轉(zhuǎn)速以150r · mirT1 200r · mirT1、發(fā)酵45-50小時(shí)，優(yōu)選48h。液體發(fā)酵的菌種可以通過大型發(fā)酵罐進(jìn)行規(guī)模生產(chǎn)，其產(chǎn)品為發(fā)酵液或發(fā)酵液的 制成品。本發(fā)明涉及一種大豆種子處理劑，其包含有效量的本發(fā)明所述的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞 菌(Stenotrophomonas maltophilia) Sneb 42本身或其代謝物作為有效活性成分。本發(fā)明的目的在于提供一種大豆種子處理劑，其特征在于，包含有效量的本申請(qǐng) 的細(xì)菌菌株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia) Sneb 42或其細(xì)菌代謝物 作為活性成分，用于誘導(dǎo)大豆產(chǎn)生對(duì)大豆敏感的除草劑阿特拉津的抗性。本發(fā)明的細(xì)菌菌株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia) Sneb 42 或其代謝物具有誘導(dǎo)大豆產(chǎn)生對(duì)大豆敏感除草劑阿特拉津產(chǎn)生抗性的能力，可用于大豆種 子處理。
具體實(shí)施例方式為了更詳細(xì)地進(jìn)一步闡明而不是為了限制本發(fā)明，給出了下列實(shí)施例。實(shí)施例1 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia) Sneb 42 的獲得取大豆田的土壤lg，加入無菌水100ml，取200 μ 1，加入冷卻至35°C以下的滅菌的 20ml NA液體培養(yǎng)基，25°C下培養(yǎng)待菌落長出后，根據(jù)菌落色澤和邊緣狀態(tài)，挑取嗜麥芽寡 養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌落單獨(dú)保存，進(jìn)行擴(kuò)繁和生理生化測(cè)定，培 養(yǎng)性狀符合嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)特征的保存?zhèn)溆?。?shí)施例2 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia) Sneb 42 的培養(yǎng)首先對(duì)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia) Sneb 42菌株進(jìn)行發(fā) 酵培養(yǎng)，然后對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)后的代謝產(chǎn)物進(jìn)行大豆誘導(dǎo)活性試驗(yàn)，確定其對(duì)大豆的誘導(dǎo)作用。將嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia) Sneb 42的菌體接種到試 管瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為NA培養(yǎng)基，即成分牛肉浸膏3g，蛋白胨10g，酵母浸膏l(xiāng)g， 蔗糖10g，瓊脂20g，加水至lOOOmL。25°C培養(yǎng)10d，獲得試管種。再將試管種接種到250mL三角瓶(每瓶裝IOOmL)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為以重量百分比計(jì)，含有牛肉浸膏0. 2%、蛋白胨1%、酵母浸膏0. 5%、蔗糖1%、余下為蒸餾 7jC, pH為8。在25°C下培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速以180r · mirT1、發(fā)酵48h，形成的發(fā)酵液或發(fā)酵液的 制成品可以直接或間接處理大豆種子。被處理的大豆種子可以種植在噴施莠去津除草劑的 土壤中，大豆出苗時(shí)可以抵抗阿特拉津(莠去津)的藥害。實(shí)施例 3 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia) Sneb 42 的發(fā)酵基本同實(shí)施例一，不同之處是將液體培養(yǎng)的菌種接種到1000L的發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā) 酵，在25°C下培養(yǎng)，pH為8，發(fā)酵48h。實(shí)施例4 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia) Sneb 42 的發(fā)酵基本同實(shí)施例一，不同之處是液體培養(yǎng)基配方，其配方為以重量百分比計(jì)，含有牛肉浸膏0. 3%、蛋白胨1%、酵母浸膏0. 1%、蔗糖2%、余 下為蒸餾水，PH為7。實(shí)施例5 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia) Sneb 42 發(fā)酵產(chǎn) 品的使用將發(fā)酵液稀釋為108cfu/L，按1 50的比例處理包衣大豆種子，晾干后，將處理過 的大豆種子正常播種，按150g/667m2噴施阿特拉津(莠去津)，大豆可以正常出苗生長。
權(quán)利要求
處理大豆種子后具有誘導(dǎo)大豆產(chǎn)生抗阿特拉津抗性的細(xì)菌菌株，其特征在于該菌株為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonas maltophilia Sneb 42，已于2010年2月1日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.3620。
2.具有誘導(dǎo)大豆產(chǎn)生抗阿特拉津抗性的細(xì)菌代謝物，其特征在于，是由權(quán)利要求1所 述的細(xì)菌菌株經(jīng)過液體發(fā)酵后形成的發(fā)酵液制備的，液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為以重量百分 比計(jì)，含有牛肉浸膏0.2%-0.4%、蛋白胨-2%、酵母浸膏0.5%、蔗糖1%-2%、 余下為蒸餾水，PH為7-8。
3.權(quán)利要求1所述的細(xì)菌菌株的液體發(fā)酵方法，其特征在于液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為 以重量百分比計(jì)，含有牛肉浸膏0.2% _0.4%、蛋白胨1%-2%、酵母浸膏0. 1% -0.5%, 蔗糖-2%、余下為蒸餾水，pH為7-8，發(fā)酵溫度為25-28°C，搖床轉(zhuǎn)速150r · mirT1 200r · mirT1、發(fā)酵時(shí)間 45_50h。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的液體發(fā)酵方法，其特征在于所述的發(fā)酵時(shí)間為48h.
5.具有誘導(dǎo)大豆產(chǎn)生抗阿特拉津抗性的細(xì)菌代謝物的制備方法，其特征在于是由權(quán) 利要求1所述的細(xì)菌菌株經(jīng)過液體發(fā)酵后形成的發(fā)酵液制備的，液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為 以重量百分比計(jì)，含有牛肉浸膏0.2% -0.4%、蛋白胨-2%、酵母浸膏0. -0.5%、 蔗糖_2%、余下為蒸餾水，pH為7-8，發(fā)酵溫度為25-28°C，搖床轉(zhuǎn)速150r · mirT1 200r · mirT1、發(fā)酵時(shí)間 45_50h。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述的發(fā)酵時(shí)間為48h.
7.一種用于發(fā)酵權(quán)利要求1所述的細(xì)菌菌株的培養(yǎng)基，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng) 基配方為以重量百分比計(jì)，含有牛肉浸膏0.2% _0.4%、蛋白胨1%_2%、酵母浸膏 0. 1% -0. 5%、蔗糖_2%、余下為蒸餾水。
8.權(quán)利要求7所述的培養(yǎng)基，其特征在于培養(yǎng)基的pH為7-8。
9.一種大豆種子處理劑，其特征在于，包含有效量的權(quán)利要求1所述的細(xì)菌菌株或權(quán) 利要求2所述的細(xì)菌代謝物作為活性成分，用于誘導(dǎo)大豆產(chǎn)生對(duì)大豆敏感的除草劑阿特拉 津的抗性。
10.權(quán)利要求1所述的細(xì)菌菌株或權(quán)利要求2所述的細(xì)菌代謝物在誘導(dǎo)大豆抗阿特拉 津除草劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株處理大豆種子后具誘導(dǎo)大豆產(chǎn)生對(duì)阿特拉津抗性的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonas maltophilia Sneb 42及其制備方法和應(yīng)用，屬于微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及的細(xì)菌菌株Sneb 42，已于2010年2月1日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.3620。通過液體發(fā)酵培養(yǎng)制備，其代謝物處理大豆種子后，大豆種子萌發(fā)出苗時(shí)可以產(chǎn)生對(duì)阿特拉津的抗性。通過該細(xì)菌的代謝產(chǎn)物處理后的大豆可以與玉米等禾本科作物混種，采用統(tǒng)一阿特拉津除草劑除草，解決了玉米與大豆間套作的除草難題，具良好的應(yīng)用開發(fā)前景。
文檔編號(hào)A01P21/00GK101818124SQ201010124089
公開日2010年9月1日 申請(qǐng)日期2010年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月15日
發(fā)明者朱曉峰, 段玉璽, 王媛媛, 羅在全, 陳立杰 申請(qǐng)人:沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)