專利名稱：短小芽孢桿菌h2在預(yù)防和/或殺滅養(yǎng)殖水體弧菌中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種短小芽孢桿菌H2和/或其菌劑的新用途，特別是涉及短小芽孢桿 菌H2菌株和/或菌劑在預(yù)防和/或殺滅養(yǎng)殖水體弧菌中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近十年來，大規(guī)模養(yǎng)殖在我國得到了迅猛的發(fā)展，養(yǎng)殖的品種已由一般品種向名 特優(yōu)品種過渡，養(yǎng)殖方式也由粗放向半精養(yǎng)、精養(yǎng)發(fā)展，但養(yǎng)殖生產(chǎn)模式基本上仍沿襲以往 的靜水、不排污的池塘養(yǎng)殖為主，養(yǎng)殖水體污染日益嚴(yán)重；同時(shí)工業(yè)廢水、生活污水的排放 也使養(yǎng)殖水域環(huán)境質(zhì)量日益下降。這不僅直接危害養(yǎng)殖對象，而且也是疾病頻繁發(fā)生的主 要誘因。隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的日益擴(kuò)大，水產(chǎn)動物的病害成為了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶 頸問題，水產(chǎn)動物傳染性疾病蔓延越來越快，發(fā)病率越來越高，危害越來越嚴(yán)重。而致病性 弧菌是水產(chǎn)動物傳染性疾病中最主要的病原菌。目前在水產(chǎn)動物疾病防治中主要使用廣譜 抗生素，雖然使用抗生素能夠有效地控制疾病的發(fā)生和蔓延，但是它干擾養(yǎng)殖環(huán)境中和水 產(chǎn)動物腸道中有益微生物菌群的正常生長和繁殖，導(dǎo)致水產(chǎn)動物對病原微生物的易感性， 更嚴(yán)重的是病原菌的耐藥性增強(qiáng)。另外抗生素的使用還會導(dǎo)致其在水生動物體內(nèi)的殘留、 富集，最終將危害人類的健康，因此使得水產(chǎn)品質(zhì)量降低，成為了水產(chǎn)品銷售量和出口貿(mào)易 量的限制因素。為此人們提出了許多替代抗生素使用的方法，目前應(yīng)用在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn) 上的主要有實(shí)用疫苗、免疫刺激劑和非特異性免疫增強(qiáng)因子、益生菌制劑等。益生菌通常是 指在飼料中添加活的微生物，以改善宿主的腸道平衡。作為益生菌，其具有許多優(yōu)點(diǎn)，如提 高養(yǎng)殖動物的免疫力和產(chǎn)生抗菌的化合物抑制病原微生物生長等。目前的益生菌產(chǎn)品主 要使用的是芽孢桿菌屬。由于益生菌制劑無毒、無殘留、不產(chǎn)生抗藥性，并且作為病原生物 的抑制劑能夠有效地改善養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境，維持生態(tài)平衡，增強(qiáng)水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的免疫力，近年 來，人們開始嘗試在養(yǎng)殖水體中施用益生菌(Probiotics)來改善養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境，提高養(yǎng)殖 動物的免疫力，抑制病原微生物，從而減少疾病的發(fā)生。在歐美、日本以及印度尼西亞、泰國 等國家的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中.益生菌制劑得到日益廣泛的應(yīng)用，并已創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟(jì)效益， 有望成為未來水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害防治的一個(gè)新方向。益生菌菌劑也可以說是在微生態(tài)理論 的指導(dǎo)下，改善和調(diào)理微生態(tài)，保持微生態(tài)平衡，調(diào)試水產(chǎn)養(yǎng)殖生物環(huán)境，提高其健康水平 或增進(jìn)健康狀態(tài)的益生菌(微生物)及其代謝產(chǎn)物和生長促進(jìn)物質(zhì)的制品。養(yǎng)殖生產(chǎn)上實(shí) 際應(yīng)用的微生態(tài)制劑應(yīng)包括活菌體、死菌體、菌體成份、代謝產(chǎn)物及具有活性的生長促進(jìn)物 質(zhì)等部分。目前國內(nèi)也發(fā)明了一些應(yīng)用在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)上的芽孢桿菌菌劑，并申請了多個(gè) 專利，如“百花山”凈水寶，天辰漁肥等，但這些產(chǎn)品主要應(yīng)用為養(yǎng)殖水體的水質(zhì)調(diào)節(jié)，通過 保持水體的微生態(tài)平衡，加強(qiáng)水體的循環(huán)、自凈作用。但到目前為止，還沒有專門針對用于 控制由致病性弧菌引起的水產(chǎn)動物傳染性疾病的微生物菌劑。短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)H2于2003年9月15日在中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCC No. 1004，其菌種特征為1、菌落特征在LB平板上培養(yǎng)2天的菌落大小為直徑3_4mm，菌落呈圓形，表面濕潤，邊緣整齊， 凸出，白色。2、細(xì)胞形態(tài)特征 適宜于pH5-9范圍內(nèi)常溫培養(yǎng)，其細(xì)胞為短桿狀，革蘭氏染色陽性，產(chǎn)芽孢。細(xì)胞 大小為0. 5X2 μ m。3、生理生化特征菌株H2為好氧菌，菌株H2能利用甘油，L-阿拉伯糖，D-核糖，D-木糖，D-葡萄糖， D-果糖，D-甘露糖，D-甘露糖，甲基-α -D-吡喃葡萄糖苷，甲基-α -D-甘露糖苷，N-乙酰氨 基葡萄糖胺，苦杏仁苷，熊果苷，七葉靈，柳醇，纖維二糖，麥芽糖，D蔗糖，D-海藻糖，菊糖， D-棉子糖，淀粉，肝糖，木糖醇，龍膽二糖，D-乳糖，D-松二糖，D-塔格糖，L-巖藻糖，D-阿 拉伯糖，L-阿拉伯糖，產(chǎn)酸。不從其它碳源產(chǎn)酸。API ZYM結(jié)果顯示，菌株H2具有堿性磷酸鹽酶、酯酶(C4)、類脂酯酶、胰蛋白酶、 胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、葡萄糖甘酶等酶的活性，不具有類脂酶、α-半乳糖甘酶、 β “半乳糖甘酶、N-乙酰_葡萄糖胺酶、α -甘露糖甘酶、β -巖藻糖甘酶等酶的活性短小芽孢桿菌Η2的16S rRNA基因序列如序列表中序列1所示。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種短小芽孢桿菌H2 (Bacillus pumilus H2)菌株和/或菌劑在預(yù) 防和/或殺滅養(yǎng)殖水體弧菌中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種預(yù)防和/或殺滅養(yǎng)殖水體中弧菌的方法，是將短小芽孢桿菌 H2菌劑接入養(yǎng)殖水體。如上所述的方法，其中，所述短小芽孢桿菌H2菌劑是將短小芽孢桿菌H2菌株接入 LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)后獲得的培養(yǎng)物。所述LB培養(yǎng)基由下述物質(zhì)組成蛋白胨8-12質(zhì)量份，酵母提取物和/或酵母浸膏 4-6質(zhì)量份，氯化鈉8-12質(zhì)量份，蒸餾水970-980質(zhì)量份，NaOiUjlpH 7-7. 5 ；優(yōu)選的配方是 蛋白胨10質(zhì)量份，酵母提取物和/或酵母浸膏5質(zhì)量份，氯化鈉10質(zhì)量份，蒸餾水975質(zhì) 量份，用 NaOiHMpH 7. 2。短小芽孢桿菌H2的培養(yǎng)條件為溫度28-32°C，振蕩速度180_210rpm，培養(yǎng)時(shí)間1_3 天；優(yōu)選為30°C，振蕩速度200rpm，培養(yǎng)時(shí)間2天。短小芽孢桿菌H2的接種濃度為104-107CFU/mL，優(yōu)選為105CFU/mL。短小芽孢桿菌H2菌劑在養(yǎng)殖水體中的接入濃度為103_104CFU/mL。將上述短小芽孢桿菌H2菌株的培養(yǎng)物取出即為制成的菌劑。本發(fā)明提供的短小 芽孢桿菌H2菌株和/或菌劑在養(yǎng)殖水體通常的育苗和養(yǎng)殖溫度下即可產(chǎn)生拮抗弧菌的細(xì) 菌素，抑制弧菌的生長和繁殖，能夠起到有效地控制由致病性弧菌引起的水產(chǎn)動物傳染性 疾病的發(fā)生和蔓延的作用，降低了水產(chǎn)動物的死亡率。適用于育苗和養(yǎng)殖水體中致病性弧 菌的預(yù)防和防治。


圖1短小芽孢桿菌H2菌劑上清液對需鈉弧菌(V. natriegens)生長的抑制圖2接種短小芽孢桿菌H2菌劑后對凡納濱對蝦蝦苗存活率的影響
具體實(shí)施例方式菌種擴(kuò)大培養(yǎng)現(xiàn)場實(shí)驗(yàn)視情況而定是否需要進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，若需要擴(kuò)大培養(yǎng) 則使用如下 培養(yǎng)基葡萄糖0.5%，氯化銨0. 5 %，蛋白胨0. 05 %，磷酸鹽0. 03 %，硫酸鎂 0.01%，海水配制(或以蒸餾水配制，按海水素的使用說明加入海水素)。按10%接種量接 種，曝氣培養(yǎng)，夏天室溫、冬天控制擴(kuò)大培養(yǎng)溫度為20°C，1周為一個(gè)培養(yǎng)周期。在擴(kuò)大培養(yǎng)后，可通過直接向養(yǎng)殖池噴灑或與飼料混合后噴灑等方式對菌劑進(jìn)行 投喂，取一定體積的培養(yǎng)物接入養(yǎng)殖水體，使菌劑終濃度為103-104CFU/mL為宜。下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例1、短小芽孢桿菌H2菌劑上清液對需鈉弧菌FS-I (Vibrio natriegensFS-1，購自中國普通微生物菌種保藏中心)生長的抑制一、短小芽孢桿菌H2菌劑上清液的制備將短小芽孢桿菌H2菌株接種到IOOmL的LB培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)24h得到菌劑，將 菌劑4000r/min離心10分鐘，得到菌劑上清液，將該上清液用0. 22 μ m的微孔濾膜過濾。二、菌劑上清液對需鈉弧菌(Vibrio natriegens)FS-I生長的抑制作用一組試驗(yàn)是將需鈉弧菌在28°C LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，然后在ImL新鮮的LB培 養(yǎng)基中加入菌劑過濾上清液lmL，再接種50 μ L的需鈉弧菌FS-I ；另一組接種需鈉弧菌 FS-I (50 μ L)至2mL LB液體培養(yǎng)基中作為對照，放入搖床28°C培養(yǎng)，每組試驗(yàn)三個(gè)平行。使 用600nm處的吸光度0D_來表示需鈉弧菌的生長量，分別在24h，48h，72h和96h對需鈉弧 菌FS-I的OD6tltl值進(jìn)行測定，結(jié)果如圖1。結(jié)果表明，加入短小芽孢桿菌H2菌劑過濾上清液的實(shí)驗(yàn)組對需鈉弧菌FS-I的生 長具有一定抑制作用，需鈉弧菌FS-I的生長量小于對照實(shí)驗(yàn)組。實(shí)施例2接種菌劑后對凡納濱對蝦蝦苗存活率的影響取240支大試管，分成4個(gè)試驗(yàn)組，每組60支，再將每個(gè)試驗(yàn)組分為三個(gè)平行組， 每個(gè)平行組20支。所有試管全部加入5ml無菌生理鹽水，試驗(yàn)組1為空白對照組，只有無 菌生理鹽水；試驗(yàn)組2加入了 ImL短小芽孢桿菌H2菌劑，終濃度為6 X 107CFU/mL ；試驗(yàn)組3 加入了 ImL需鈉弧菌FS-I菌株，終濃度為5. 83X 107CFU/mL ；試驗(yàn)組4加入了 0. 5mL短小芽 孢桿菌H2菌劑和0. 5mL需鈉弧菌FS-I菌株。取240尾對蝦蝦苗(體長約1cm)隨機(jī)分別 放入上述試管中，每試管一只。28°C下避光孵育72h，每隔8h統(tǒng)計(jì)各組蝦苗的存活率。如圖2所示試驗(yàn)組3所有蝦苗全部死亡需要16h，時(shí)間明顯短于試驗(yàn)組1，即空白 對照組的32h ；試驗(yàn)組4所有蝦苗全部死亡需要48h ；試驗(yàn)組2所有蝦苗全部亡則需要72h。 表明短小芽孢桿菌H2菌劑維持了蝦苗在不增加食物和氧氣的條件下生存了 72h，有利于 蝦苗的存活，對蝦苗存在有一定的保護(hù)作用。實(shí)施例3、短小芽孢桿菌H2菌劑的制備及其對南美凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)死亡率的影響
一、短小芽孢桿菌H2菌劑的制備短小芽孢桿菌H2 (CGMCC 1004)菌株采用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方如下蛋白 胨10g，酵母提取物(或酵母浸膏)5g，NaCl 10g，蒸餾水975ml，用NaOH調(diào)pH 7. 2。將上述菌種接種在LB培養(yǎng)基中，接種濃度為105CFU/mL，培養(yǎng)溫度為30°C，搖床振 蕩速度為200rpm，好氣培養(yǎng)2天。二、需鈉弧菌FS-I (Vibrio natriegens FS-1，購自中國普通微生物菌種保藏中 心)的培養(yǎng)將需鈉弧菌FS-I在LB培養(yǎng)基中28°C培養(yǎng)24h，接種濃度為105CFU/mL。三、南美凡納濱對蟲下(Litopenaeus vannamei)養(yǎng)殖南美凡納濱對蝦取自江蘇贛榆育苗場，體長l_2cm，取自育苗場的蝦苗，先暫養(yǎng)7 天，然后移至實(shí)驗(yàn)蝦池中，蝦池的長X寬X高=49 X 49 X 48cm，有效水體為96L，每個(gè)實(shí)驗(yàn) 缸的放養(yǎng)量為100尾，約1000尾/m3水體。對照組和實(shí)驗(yàn)組飼喂相同顆粒飼料(“統(tǒng)一牌” 凡納濱對蝦配合飼料2號)，每天2次，每次0.34g/池(分別在8:00和20:00)。主要營養(yǎng) 成分為水分12%、粗蛋白42%、粗脂肪4%、粗灰分16%、粗纖維5%、鈣3.5%、總磷1%、 賴氨酸2%等。四、蝦池實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選定16個(gè)蝦池，分為4組，每組4個(gè)蝦池每組的1號蝦池既不接種菌劑，也不接種需鈉弧菌，為空白對照；每組的2號蝦池接種短小芽孢桿菌H2菌劑，終濃度為103CFU/mL，在不換水的情況 下，維持2周，每隔7天接種一次菌劑，在2周后，接種需鈉弧菌FS-1，終濃度為104CFU/mL ；每組的3號蝦池接種短小芽孢桿菌H2菌劑，終濃度為104CFU/mL，在不換水的情況 下，維持2周，每隔7天接種一次菌劑，在2周后，接種需鈉弧菌FS-1，終濃度為104CFU/mL ；每組的4號蝦池只接種需鈉弧菌FS-I，終濃度為104CFU/mL。分別考察以上16個(gè)蝦池中對蝦的抗病效果，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下表1。表1加入兩種濃度的短小芽孢桿菌H2對凡納濱對蝦生長的影響 序列表
<160>1<210>1<211>1484<212>DNA <213> 短小芽孢桿菌 H2 (Bacillus pumilus H2)<400>1gacgggtgcg tgcgtctata ctgcgagtcg agcggacaga agggagcttg ctcccggatg 60ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg gataactccg 120ggaaaccgga gctaataccg gatagttcct tgaaccgcat ggttcaagga tgaaagacgg 180tttcggcgtg tcacttagca gagtcaagga ccagcgttcg gtcagtacat tacggccata 240gttgtgtggg gtaatggctc accaaggcga cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg 300gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc 360cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt 420aaagctctgt tgwtagggaa gaacaagtgc gagagtaact gctcgcacct tgacggtacc 480taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc 540gttgtccgga attattgggc gtaaagggct cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa 600gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggaa acttgagtgc agaagaggag 660agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa 720ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt 780agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagggg gtttccgccc 840cttagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa 900actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca 960acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaac cctagagata gggctttccc1020ttcggggaca gagtgacagg tggtgcatgc ttgtcgtcag cccgtggtcg tgagatgtag 1080ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg atcttggttg ccagcattta gttggtcact 1140ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc 1200
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短小芽孢桿菌H2(CGMCC No.1004)和/或其菌劑在預(yù)防和/或殺滅養(yǎng)殖水體弧菌中的應(yīng)用。
2.一種預(yù)防和/或殺滅養(yǎng)殖水體中弧菌的方法，是將短小芽孢桿菌H2和/或其菌劑接 入養(yǎng)殖水體。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述短小芽孢桿菌H2菌劑是將短小芽孢桿 菌H2接入LB培養(yǎng)基培養(yǎng)后獲得的培養(yǎng)物。
4 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述LB培養(yǎng)基由下述物質(zhì)組成蛋白胨 8-12質(zhì)量份，酵母提取物和/或酵母浸膏4-6質(zhì)量份，氯化鈉8-12質(zhì)量份，蒸餾水970-980 質(zhì)量份，用NaOH調(diào)pH 7-7. 5。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述LB培養(yǎng)基由下述物質(zhì)組成蛋白胨10 質(zhì)量份，酵母提取物和/或酵母浸膏5質(zhì)量份，氯化鈉10質(zhì)量份，蒸餾水 >975質(zhì)量份，用NaOH 調(diào) pH 7. 2。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述短小芽孢桿菌H2的培養(yǎng)條件為溫度 28-32°C，振蕩速度180-210rpm，培養(yǎng)時(shí)間1-3天。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述短小芽孢桿菌H2菌劑的培養(yǎng)條件為溫 度30°C，振蕩速度200rpm，培養(yǎng)時(shí)間2天。
8 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述短小芽孢桿菌H2在LB培養(yǎng)基中的接種 濃度為 104-107CFU/mL。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述短小芽孢桿菌H2在LB培養(yǎng)基中的接種 濃度為 105CFU/mL。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述短小芽孢桿菌H2菌劑在養(yǎng)殖水體中的 接入濃度為每HiL養(yǎng)殖水體103-104CFU。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種短小芽孢桿菌H2和/或其菌劑在預(yù)防和/或殺滅養(yǎng)殖水體弧菌中的應(yīng)用。還公開了一種預(yù)防和/或殺滅養(yǎng)殖水體中弧菌的方法，是將短小芽孢桿菌H2(Bacillus pumilus H2)菌劑接入養(yǎng)殖水體，所述短小芽孢桿菌H2菌劑是將短小芽孢桿菌H2菌株接入LB培養(yǎng)基制成。該菌劑可以在通常的育苗和養(yǎng)殖溫度下產(chǎn)生拮抗弧菌的細(xì)菌素，抑制弧菌的生長和繁殖，起到有效地控制由致病性弧菌引起的水產(chǎn)動物傳染性疾病的發(fā)生和蔓延的作用，降低水產(chǎn)動物死亡率。與相應(yīng)的養(yǎng)殖池適配，適用于育苗和養(yǎng)殖水體中致病性弧菌的預(yù)防和防治。
文檔編號A01N63/00GK101869118SQ20091008262
公開日2010年10月27日 申請日期2009年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月21日
發(fā)明者傅松哲, 劉雙江, 劉志培, 劉纓 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所