專利名稱：一種組織培養(yǎng)快繁細(xì)葉小羽蘚配子體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是涉及一種組織培養(yǎng)快繁細(xì)葉小羽蘚配子體的方法，屬于生物工程 技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
細(xì)葉小羽蘚(77"/ /oc/a^ww m/crap/^/wm (Hedw.)Broth.)隸屬羽蘚科 (7TmWaceae)的小羽蘚屬(//"p/oc/a&Mm)苔蘚植物。植物體體形中等，黃 綠色或綠色，老時(shí)呈黃褐色，常交織成片；莖匍旬，長(zhǎng)可達(dá)5cm以上，規(guī)則 羽狀分枝，中軸分化；鱗毛披針形至線形，密生莖上，而枝上稀少或缺失；莖 葉干燥時(shí)疏松貼生，由闊卵形基部漸上成細(xì)長(zhǎng)尖，長(zhǎng)可達(dá)1.2mm;莖葉葉邊平 展，或部分背卷，具齒，中肋一般貫頂或終止于葉尖下；枝葉闊卵形，具短披 針形尖，中肋不及頂，或略突出于葉尖；蒴柄細(xì)長(zhǎng)，可達(dá)2cm以上，紅棕色， 平滑，孢蒴弓形彎曲，長(zhǎng)約2mm。丘林地區(qū)以腐木著生為多，其次為土生及 石生。
很多研究結(jié)果表明細(xì)葉小羽蘚(//. m/crap/^/M附)的匍甸羽狀分枝結(jié)構(gòu)對(duì) 大氣環(huán)境污染的變化十分敏感，其對(duì)Cu、 Pb、 Zn、 Cr、 Cd五種重金屬的富集 能力(應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2006， 17 (8): 1490-1494)幾乎是常見(jiàn)幾種雜草如小 飛蓬、龍葵、加拿大一枝黃花等植物莖葉體的3~10倍(上海交通大學(xué)學(xué)報(bào) 農(nóng)業(yè)科學(xué)版，2002， 20 (1): 22~29)，利用它作為指示大氣重金屬污染具有明 顯優(yōu)勢(shì)。因此，建立細(xì)葉小羽蘚快繁系統(tǒng)，對(duì)研究大氣重金屬元素在苔蘚植物 體內(nèi)的遷移、分布和富集機(jī)制具有重要意義。但現(xiàn)有技術(shù)中還沒(méi)有在試管內(nèi)大 量擴(kuò)繁羽蘚屬植物配子體的相關(guān)培養(yǎng)技術(shù)報(bào)道，更沒(méi)有將細(xì)葉小羽蘚組織培養(yǎng) 成配子體的相關(guān)技術(shù)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種組織培養(yǎng)快繁細(xì)葉小羽蘚配子體的方法，以填補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的空白，實(shí)現(xiàn)人工大量快速擴(kuò)繁細(xì)葉小羽蘚，為研究苔蘚植物 對(duì)大氣重金屬污染的生理響應(yīng)和重金屬元素在苔蘚植物體內(nèi)的遷移、分布和富 集機(jī)制提供便捷。
為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明釆用的技術(shù)方案如下
本發(fā)明提供的組織培養(yǎng)快繁細(xì)葉小羽蘚配子體的方法，包括如下順序步
a) 切取細(xì)葉小羽蘚配子體新生羽狀分枝先端，進(jìn)行表面滅菌，然后接種 到改良Knop' s培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)10天，培養(yǎng)條件為溫度25士2。C,光 照強(qiáng)度20001x，光照時(shí)間10小時(shí)/天；所述改良Knop' s培養(yǎng)基配方為改良 Knop' s基本培養(yǎng)基+ 0 10g/l蔗糖；
b) 將步驟a)得到的無(wú)菌外植體轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)新生配子體產(chǎn)生的培養(yǎng)基上， 進(jìn)行培養(yǎng)50天，培養(yǎng)條件為溫度(20~35) 土2。C,光照強(qiáng)度30001x,光照 時(shí)間12小時(shí)/天；所述誘導(dǎo)新生配子體產(chǎn)生的培養(yǎng)基配方為改良Knop' s基 本培養(yǎng)基+ 0.1 ~ 2.0mg/l 6-節(jié)氨基嘌呤+ 0.01 ~ 0.2mg/l萘乙酸+ 10g/l蔗糖；
c) 將步驟b)誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的新生配子體切割剪碎，接種到配子體增殖擴(kuò) 繁的培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)50天，培養(yǎng)條件為溫度(20~35) 士2。C，光照強(qiáng) 度30001x，光照時(shí)間12小時(shí)/天；所述配子體增殖擴(kuò)繁的培養(yǎng)基配方為改良 Knop' s基本培養(yǎng)基+ 0 ~ 0.5mg/l 6-節(jié)氨基喋呤+ 0.05mg/l萘乙酸+ 10g/l蔗
糖；
所述改良Knop' s基本培養(yǎng)基的配方為KN03 250mg/l、 MgS04 . 7H20 250mg/l、 KH2PO4250mg/l、 Ca(N03)2 . 4H20 1000mg/l、酒石酸氨0.115mg/l、 NaFe-EDTA36.7mg/l、 MnS04 4H20 11.15mg/l、 H3B03 3.1mg/l、 KI0.415mgA、 ZnS04 7H20 4.3mg/l、 CuS04 5H20 0.0125mg/l、 NaMo04 2H20 0.125mg/l、 CoCl2 6H20 0.0125mg/l。
步驟a)中切取的細(xì)葉小羽蘚配子體新生羽狀分枝先端的長(zhǎng)度優(yōu)選0.3mm。
步驟a)中對(duì)細(xì)葉小羽蘚配子體新生羽狀分枝先端表面的滅菌條件優(yōu)選如 下先用75%的酒精溶液滅菌20秒，再用0.1%的升汞溶液滅菌2分鐘。
步驟b)中的誘導(dǎo)新生配子體產(chǎn)生的培養(yǎng)基配方優(yōu)選為改良Knop' s基 本培養(yǎng)基+ 0.5mg/l 6-節(jié)基氨基嘌呤+ 0.05mg/l萘乙酸+ 10g/l蔗糖。
步驟b)中的培養(yǎng)條件優(yōu)選為溫度25士2。C，光照強(qiáng)度3000k,光照時(shí)間
512小時(shí)/天。
步驟c)中的配子體增殖擴(kuò)繁的培養(yǎng)基配方優(yōu)選為改良Knop' s基本培養(yǎng) 基+ 0.2mg/l 6-芐基氨基嘌呤+ 0.05mg/l萘乙酸+ 10g/l蔗糖。
步驟c)中的培養(yǎng)條件優(yōu)選為溫度25士2。C,光照強(qiáng)度30001x，光照時(shí)間 12小時(shí)/天。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下首次建立了組織培養(yǎng) 快繁細(xì)葉小羽蘚配子體的方法，填補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)的空白；并且，使用本發(fā)明的 快速擴(kuò)繁方法，極利于高度集約化和高密度工產(chǎn)化生產(chǎn)，也利于自動(dòng)化控制生 產(chǎn)，在短時(shí)間內(nèi)可實(shí)現(xiàn)人工大量擴(kuò)繁細(xì)葉小羽蘚，為研究苔蘚植物對(duì)大氣重金 屬污染的生理響應(yīng)和重金屬元素在苔蘚植物體內(nèi)的遷移、分布和富集機(jī)制提供 了便捷途徑，具有明顯的科研利用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供的組織培養(yǎng)快繁細(xì)葉小羽蘚配子體的方法，包括如下順序步
a) 切取細(xì)葉小羽蘚配子體新生羽狀分枝先端，進(jìn)行表面滅菌，然后接種 到改良Knop' s培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)10天，培養(yǎng)條件為溫度25土2。C，光 照強(qiáng)度20001x，光照時(shí)間10小時(shí)/天；所述改良Knop' s培養(yǎng)基配方為改良 Knop' s基本培養(yǎng)基+ 0 10g/l蔗糖；
b) 將步驟a)得到的無(wú)菌外植體轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)新生配子體產(chǎn)生的培養(yǎng)基上， 進(jìn)行培養(yǎng)50天，培養(yǎng)條件為溫度(20~35) ±2°C,光照強(qiáng)度30001x,光照 時(shí)間12小時(shí)沃；所述誘導(dǎo)新生配子體產(chǎn)生的培養(yǎng)基配方為改良Knop' s基 本培養(yǎng)基+ 0.1 ~ 2.0mg/l 6-芐氨基嘌呤+ 0.01 ~ 0.2mg/l萘乙酸+ 10g/l蔗糖；
c) 將步驟b)誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的新生配子體切割剪碎，接種到配子體增殖擴(kuò) 繁的培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)50天，培養(yǎng)條件為溫度(20~35) ±2°C，光照強(qiáng) 度3000k,光照時(shí)間12小時(shí)/天；所述配子體增殖擴(kuò)繁的培養(yǎng)基配方為改良 Knop' s基本培養(yǎng)基+ 0 ~ 0.5mg/l 6-節(jié)氨基P票呤+ 0.05mg/l萘乙酸+ 10g/1蔗
糖；
所述改良Knop' s基本培養(yǎng)基的配方為KN03 250mg/l、 MgS04 . 7H20 250mg/l、 KH2PO4250mg/l、 Ca(N03)2 4H20 1000mg/l、酒石酸氨0.115mg/lNaFe-EDTA36.7mg/1、 MnS04 4H20 11.15mg/l、 H3B03 3.1mg/l、 K10.415mg/1、 ZnS04 7H20 4.3mg/l、 CuS04 . 5H20 0.0125mg/l、 NaMo04 2H20 0.125mg/l、 CoCl2 6H2O0.0125mg/l。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)、完整的說(shuō)明 實(shí)施例1
切取長(zhǎng)度為0.3mm的細(xì)葉小羽蘚配子體新生羽狀分枝先端，按以下滅菌 條件(先用75%的酒精溶液滅菌20秒，再用0.1%的升汞溶液滅菌2分鐘)進(jìn) 行表面滅菌，然后接種到以下兩種配方組成的改良Knop' s培養(yǎng)基上，分別進(jìn) 行培養(yǎng)10天，培養(yǎng)條件為溫度25土2。C,光照強(qiáng)度2000k,光照時(shí)間10小 時(shí)沃。
兩種改良Knop' s培養(yǎng)基的配方組成如下
a) 改良Knop' s基本培養(yǎng)基+ Og/l蔗糖；
b) 改良Knop' s基本培養(yǎng)基+ 10g/l蔗糖。 培養(yǎng)結(jié)果分別如下
a) 獲得的無(wú)菌分枝先端伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，分技平均長(zhǎng)度為5.4mm;
b) 獲得的無(wú)菌分枝先端伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，分枝平均長(zhǎng)度為5.6rnrn。 由上述培養(yǎng)結(jié)果可以得知改良Knop' s培養(yǎng)基的配方組成中的蔗糖對(duì)無(wú)
菌配子體的生長(zhǎng)狀態(tài)基本沒(méi)有影響。 實(shí)施例2
將實(shí)例1得到的無(wú)菌外植體轉(zhuǎn)接到以下四種配方組成的誘導(dǎo)新生配子體 產(chǎn)生的培養(yǎng)基上，分別進(jìn)行培養(yǎng)50天，培養(yǎng)條件為溫度25°C，光照強(qiáng)度 30001x，光照時(shí)間12小時(shí)/天。
四種誘導(dǎo)新生配子體產(chǎn)生的培養(yǎng)基的配方組成如下
a) 改良Knop' s基本培養(yǎng)基+ 0.1mg/1 6-芐基氨基嘌呤+ 0.01mg/l萘乙酸 + 108/1蔗糖；
b) 改良Knop' s基本培養(yǎng)基+ 0.5mg/1 6-芐基氨基嘌呤+ 0.05mg/l萘乙酸 + 10§/1蔗糖；
c) 改良Knop' 8基本培養(yǎng)基+1.0111§/16-節(jié)基氨基嘌呤+ 0.111^/1萘乙酸+ 10g/l蔗糖；
d) 改良Knop' 3基本培養(yǎng)基+ 2.0111§/16-糠基氨基嘌呤+ 0.211^/1萘乙酸+10g/l蔗糖。
培養(yǎng)結(jié)果分別如下
a) 無(wú)菌分枝先端伸長(zhǎng)生長(zhǎng)速度較緩慢，新生分枝較少，無(wú)菌分技平均長(zhǎng) 度為2.6cm，每個(gè)分技上產(chǎn)生的長(zhǎng)度超過(guò)0.5cm的新生分枝數(shù)平均為3個(gè)；
b) 無(wú)菌分技先端伸長(zhǎng)生長(zhǎng)速度較快，新生分枝較多，無(wú)菌分枝平均長(zhǎng)度 為4.2cm,每個(gè)分枝上產(chǎn)生的長(zhǎng)度超過(guò)0.5cm的新生分技數(shù)平均為8個(gè)；
c) 無(wú)菌分技先端膨脹變粗且伸長(zhǎng)生長(zhǎng)速度很緩慢，新生分枝多且短，無(wú) 菌分枝平均長(zhǎng)度為l.lcm，每個(gè)分枝上沒(méi)有長(zhǎng)度超過(guò)0.5cm的新生分技；
d) 無(wú)菌分技先端明顯變粗，顏色變得濃綠，生長(zhǎng)速度極其緩慢，分枝上 有很多新生粒狀芽點(diǎn)，無(wú)菌分枝平均長(zhǎng)度為0.8cm。
由上述培養(yǎng)結(jié)果可以得知6-節(jié)基氨基嘌呤和萘乙酸兩種激素的添加濃 度的組合不同，對(duì)配子體的生長(zhǎng)和新分枝的誘導(dǎo)形成有很大影響，誘導(dǎo)新生配 子體產(chǎn)生的培養(yǎng)基的最優(yōu)配方組成是改良Knop' s基本培養(yǎng)基+ 0.5mg/l 6-芐基氨基嘌呤+ 0.05mg/l萘乙酸+ 10g/l蔗糖。
實(shí)施例3
將實(shí)例1得到的無(wú)菌外植體轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)新生配子體產(chǎn)生的培養(yǎng)基上，按以 下四種培養(yǎng)條件分別進(jìn)行培養(yǎng)50天，所述誘導(dǎo)新生配子體產(chǎn)生的培養(yǎng)基的配 方組成為改良Knop' s基本培養(yǎng)基+ 0.5mg/16-芐基氨基嘌呤+ 0.0Smg/l萘乙 酸+ 10g/l蔗糖。
四種培養(yǎng)條件如下
a) 溫度20土2。C,光照強(qiáng)度30001x，光照時(shí)間12小時(shí)/天；
b) 溫度25土2。C,光照強(qiáng)度30001x，光照時(shí)間12小時(shí)/天；
c) 溫度30土2。C,光照強(qiáng)度30001x，光照時(shí)間12小時(shí)/天；
d) 溫度35士2。C，光照強(qiáng)度30001x,光照時(shí)間12小時(shí)/天。 培養(yǎng)結(jié)果分別如下
a) 無(wú)菌配子體分枝先端均伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，顏色鮮綠，平均長(zhǎng)度為4.1cm,每個(gè) 分枝上長(zhǎng)度超過(guò)lcm的新生分枝數(shù)平均為4個(gè)；
b) 無(wú)菌配子體分技先端均伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，顏色鮮綠，平均長(zhǎng)度為6.7cm，每個(gè) 分枝上長(zhǎng)度超過(guò)lcm的新生分枝數(shù)平均為9個(gè)；
c) 無(wú)菌配子體分枝先端均伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，顏色淡綠，平均長(zhǎng)度為5.2cm,每個(gè)分枝上長(zhǎng)度超過(guò)lcm的新生分枝數(shù)平均為5個(gè)；
d)無(wú)菌配子體分枝先端均伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，顏色黃綠，平均長(zhǎng)度為3.2cm,每個(gè) 分技上沒(méi)有長(zhǎng)度超過(guò)lcm的新生分枝。
由上述培養(yǎng)結(jié)果可以得知培養(yǎng)溫度對(duì)于無(wú)菌配子體分技先端伸長(zhǎng)生長(zhǎng)狀 態(tài)和新生分枝形成有顯著影響，25士2。C是最適宜的培養(yǎng)溫度，溫度過(guò)高或過(guò) 低都不利于配子體的生長(zhǎng)和新生分枝的形成，因此，誘導(dǎo)新生配子體產(chǎn)生的最 優(yōu)培養(yǎng)條件是溫度25士2。C,光照強(qiáng)度30001x，光照時(shí)間12小時(shí)/天。
實(shí)施例4
將實(shí)施例3中在b)培養(yǎng)條件誘導(dǎo)得到的新生配子體切割剪碎，接種到以 下四種配方組成的配子體增殖擴(kuò)繁的培養(yǎng)基上，分別進(jìn)行培養(yǎng)50天，培養(yǎng)條 件為溫度25士2。C，光照強(qiáng)度30001x,光照時(shí)間12小時(shí)/天。
四種配子體增殖擴(kuò)繁的培養(yǎng)基配方組成如下
a) 改良Knop' s基本培養(yǎng)基+ 0.05mg/l萘乙酸+ 10g/l蔗糖；
b) 改良Knop' s基本培養(yǎng)基+ 0.1mg/1 6-芐基氨基嘌呤+ 0.05mg/l萘乙酸 + 10g/l蔗糖；
c) 改良Knop' s基本培養(yǎng)基+ 0.2mg/l 6-芐基氨基嘌呤+ 0.05mg/l萘乙酸 + 108/1蔗糖；
d) 改良Knop' s基本培養(yǎng)基+ 0.5mg/l 6-節(jié)基氨基P票呤+ 0.05mg/l萘乙酸 + 108/1蔗糖。
培養(yǎng)結(jié)果分別如下
a) 細(xì)碎分技上新生分枝較少，無(wú)菌分枝平均長(zhǎng)度為2.2cm，每個(gè)細(xì)碎分枝 上產(chǎn)生的新生分枝數(shù)平均為1.6個(gè)；
b) 細(xì)碎分枝上新生分技較少，無(wú)菌分技平均長(zhǎng)度為1.8cm，每個(gè)細(xì)碎分枝 上產(chǎn)生的新生分技數(shù)平均為2.4個(gè)；
c) 細(xì)碎分技上新生分枝較多，無(wú)菌分技平均長(zhǎng)度為1.7cm,每個(gè)細(xì)碎分枝 上產(chǎn)生的新生分枝數(shù)平均為3.8個(gè)；
d) 細(xì)碎分枝上新生分枝較少，無(wú)菌分枝平均長(zhǎng)度為l.lcm，每個(gè)細(xì)碎分枝 上產(chǎn)生的新生分枝數(shù)平均為4.1個(gè)。
由上述培養(yǎng)結(jié)果可以得知6-節(jié)基氨基嘌呤和萘乙酸兩種激素的添加濃 度的組合不同，對(duì)配子體的生長(zhǎng)和增殖有很大影響，配子體增殖擴(kuò)繁培養(yǎng)基的
9最優(yōu)配方組成是改良Knop' s基本培養(yǎng)基+ 0.2mg/1 6-節(jié)基氨基嘌呤+ 0.05mg/l萘乙酸+ 10g/l蔗糖。 實(shí)施例5
將實(shí)施例3中在b)培養(yǎng)條件誘導(dǎo)得到的新生配子體切割剪碎，接種到配 子體增殖擴(kuò)繁的培養(yǎng)基上，按以下四種培養(yǎng)條件分別進(jìn)行培養(yǎng)50天，所述配 子體增殖擴(kuò)繁的培養(yǎng)基配方為改良Knop' s基本培養(yǎng)基+ 0.2mg/l 6-節(jié)基氨 基嘌呤+ 0.05mg/l萘乙酸+ 10g/l蔗糖。
四種培養(yǎng)條件如下
a) 溫度20土2。C，光照強(qiáng)度30001x,光照時(shí)間12小時(shí)/天；
b) 溫度25士2。C，光照強(qiáng)度30001x，光照時(shí)間12小時(shí)/天；
c) 溫度30土2。C，光照強(qiáng)度30001x,光照時(shí)間12小時(shí)/天；
d) 溫度35土2。C，光照強(qiáng)度30001x,光照時(shí)間12小時(shí)/天。 培養(yǎng)結(jié)果分別如下
a) 新生分枝顏色鮮綠，無(wú)菌分技平均長(zhǎng)度為Ucm，每個(gè)細(xì)碎分技上產(chǎn)生 的新生分枝數(shù)平均為2.8個(gè)；
b) 新生分枝顏色鮮綠，無(wú)菌分技平均長(zhǎng)度為1.7cm,每個(gè)細(xì)碎分枝上產(chǎn)生 的新生分枝數(shù)平均為3.8個(gè)；
c) 新生分枝顏色淡綠，無(wú)菌分枝平均長(zhǎng)度為1.6cm,每個(gè)細(xì)碎分枝上產(chǎn)生 的新生分枝數(shù)平均為3.1個(gè)；
d) 新生分枝顏色黃綠，無(wú)菌分技平均長(zhǎng)度為1.2cm，每個(gè)細(xì)碎分技上產(chǎn)生 的新生分枝數(shù)平均為2.9個(gè)。
由上述培養(yǎng)結(jié)果可以得知培養(yǎng)溫度對(duì)于細(xì)葉小羽蘚配子體生長(zhǎng)和新生分 枝增殖有顯著影響，25士2。C是最適宜的培養(yǎng)溫度，溫度過(guò)高或過(guò)低都不利于 配子體的生長(zhǎng)和新生分技的增殖，因此，配子體增殖擴(kuò)繁的最優(yōu)培養(yǎng)條件是 溫度25土2。C,光照強(qiáng)度30001x，光照時(shí)間12小時(shí)/天。
權(quán)利要求
1.一種組織培養(yǎng)快繁細(xì)葉小羽蘚配子體的方法，其特征在于，所述方法包括以下順序步驟a)切取細(xì)葉小羽蘚配子體新生羽狀分枝先端，進(jìn)行表面滅菌，然后接種到改良Knop′s培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)10天，培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，光照強(qiáng)度2000lx，光照時(shí)間10小時(shí)/天；所述改良Knop′s培養(yǎng)基配方為改良Knop′s基本培養(yǎng)基+0～10g/l蔗糖；b)將步驟a)得到的無(wú)菌外植體轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)新生配子體產(chǎn)生的培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)50天，培養(yǎng)條件為溫度(20～35)±2℃，光照強(qiáng)度3000lx，光照時(shí)間12小時(shí)/天；所述誘導(dǎo)新生配子體產(chǎn)生的培養(yǎng)基配方為改良Knop′s基本培養(yǎng)基+0.1～2.0mg/l 6-芐氨基嘌呤+0.01～0.2mg/l萘乙酸+10g/l蔗糖；c)將步驟b)誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的新生配子體切割剪碎，接種到配子體增殖擴(kuò)繁的培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)50天，培養(yǎng)條件為溫度(20～35)±2℃，光照強(qiáng)度3000lx，光照時(shí)間12小時(shí)/天；所述配子體增殖擴(kuò)繁的培養(yǎng)基配方為改良Knop′s基本培養(yǎng)基+0～0.5mg/l 6-芐氨基嘌呤+0.05mg/l萘乙酸+10g/l蔗糖；所述改良Knop′s基本培養(yǎng)基的配方為KNO3 250mg/l、MgSO4·7H2O250mg/l、KH2PO4 250mg/l、Ca(NO3)2·4H2O 1000mg/l、酒石酸氨0.115mg/l、NaFe-EDTA 36.7mg/l、MnSO4·4H2O 11.15mg/l、H3BO3 3.1mg/l、KI0.415mg/l、ZnSO4·7H2O 4.3mg/l、CuSO4·5H2O 0.0125mg/l、NaMoO4·2H2O 0.125mg/l、CoCl2·6H2O 0.0125mg/l。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織培養(yǎng)快繁細(xì)葉小羽蘚配子體的方法，其特 征在于，步驟a)中切取的細(xì)葉小羽蘚配子體新生羽狀分枝先端的長(zhǎng)度為 0.3rnrn。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織培養(yǎng)快繁細(xì)葉小羽蘚配子體的方法，其特 征在于，步驟a)中對(duì)細(xì)葉小羽蘚配子體新生羽狀分枝先端表面的滅菌條件如 下先用75%的酒精溶液滅菌20秒，再用0.1%的升汞溶液滅菌2分鐘。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織培養(yǎng)快繁細(xì)葉小羽蘚配子體的方法，其特 征在于，步驟b)中的誘導(dǎo)新生配子體產(chǎn)生的培養(yǎng)基配方為改良Knop' s基本培養(yǎng)基+ 0.5mg/l 6-芐基氨基嘌呤+ 0.05mg/l萘乙酸+ 10g/l蔗糖。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織培養(yǎng)快繁細(xì)葉小羽蘚配子體的方法，其特 征在于，步驟b)中的培養(yǎng)條件為溫度25士2t:,光照強(qiáng)度30001x,光照時(shí)間 12小時(shí)/天。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織培養(yǎng)快繁細(xì)葉小羽蘚配子體的方法，其特 征在于，步驟c)中的配子體增殖擴(kuò)繁的培養(yǎng)基配方為改良Knop' s基本培養(yǎng) 基+ 0.2mg/l 6-芐基氨基嘌呤+ 0.05mg/l萘乙酸+ 10g/l蔗糖。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織培養(yǎng)快繁細(xì)葉小羽蘚配子體的方法，其特 征在于，步驟c)中的培養(yǎng)條件為溫度25土2。C,光照強(qiáng)度30001x,光照時(shí)間 12小時(shí)/天。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種組織培養(yǎng)快繁細(xì)葉小羽蘚配子體的方法，所述方法包括以下順序步驟切取細(xì)葉小羽蘚配子體新生羽狀分枝先端，進(jìn)行表面滅菌后接種到改良Knop′s培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)10天，以篩選獲得無(wú)菌外植體；將得到的無(wú)菌外植體轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)新生配子體產(chǎn)生的培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)50天；將誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的新生配子體切割剪碎，接種到配子體增殖擴(kuò)繁的培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)50天即可。本發(fā)明首次建立了組織培養(yǎng)快繁細(xì)葉小羽蘚配子體的方法，填補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)的空白。本發(fā)明方法極利于高度集約化和高密度工產(chǎn)化生產(chǎn)，可為研究苔蘚植物對(duì)大氣重金屬污染的生理響應(yīng)和重金屬元素在苔蘚植物體內(nèi)的遷移、分布和富集機(jī)制提供便捷。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101606486SQ20091005435
公開(kāi)日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2009年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月3日
發(fā)明者婁玉霞, 同 曹, 曾元元, 郭水良 申請(qǐng)人:上海師范大學(xué)