專利名稱：一種高效誘導(dǎo)赤松(Pinus densiflora)組培苗不定根發(fā)生的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是指一種高效誘導(dǎo)赤松組培苗不定根發(fā)生的方法。
二背景技術(shù)：
松屬(Pz'"w)植物大約有116個(gè)種以及變種和雜種，在世界上分布、種植極為廣泛，尤 其在溫帶地區(qū)，松屬植物不僅種類多，而且往往形成浩瀚的林海，因此被譽(yù)為"北半球森林之 母"。松屬植物不僅在世界木材、松脂及造紙等方面有突出貢獻(xiàn)，而且在生態(tài)系統(tǒng)中具有非常 重要的地位。
赤松(尸Z咖s&"w;/7ora)為松屬的一個(gè)種，分布于我國(guó)華東及北部沿海地區(qū)以及日本、朝 鮮、蘇聯(lián)。具有抗風(fēng)力強(qiáng)、抗干旱耐脊薄等特點(diǎn)，為沿海造林和干旱山坡造林的先鋒樹種， 亦栽培作觀賞樹種。木材可供建筑、木纖維工業(yè)原料等用。該樹種是森林毀滅性病害——松 材線蟲病最容易感染的樹種之一。由于受松材線蟲危害，在日本廣為栽植的赤松大量枯死， 幾近滅絕，對(duì)林業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重破壞。我國(guó)栽植的赤松同樣受到松材線蟲病的 嚴(yán)重威脅。在過去的20多年里，日本通過抗病單株選擇已培育出一批抗松材線蟲病赤松優(yōu)良 家系，建立了抗病種子園。然而，抗病種子產(chǎn)量非常有限，難以滿足大規(guī)模林業(yè)生產(chǎn)的需要。 常規(guī)無性繁殖如扦插、嫁接等較為困難，獲得的種苗數(shù)量有限，無法在生產(chǎn)上大面積推廣。
植物組織培養(yǎng)作為一種可替代的無性繁殖方法為快速繁殖優(yōu)良種苗提供了新的途徑。鑒 于松樹在林業(yè)生產(chǎn)及生態(tài)系統(tǒng)中的重要的地位，各國(guó)學(xué)者對(duì)松屬的60多個(gè)種或變種、雜種的 組織培養(yǎng)進(jìn)行了廣泛研究。諸多研究結(jié)果表明，盡管大多數(shù)松屬樹種的芽繁殖可以通過胚性 外植體來完成，但由此產(chǎn)生的小芽即使在有生長(zhǎng)素存在時(shí)也很難生根(黃健秋等，1994)， 松屬樹種組培苗不定根發(fā)生已成為其組織培養(yǎng)的瓶頸之一，并極大地限制了該技術(shù)在生產(chǎn)中 的應(yīng)用。
有關(guān)赤松組織培養(yǎng)器官發(fā)生的文獻(xiàn)報(bào)道較少。Isikawa (1987)在赤松下胚軸和幼苗根尖 器官分化研究中觀察到胚軸上有不定根的形成；Choi等(1993)對(duì)赤松組培苗不定根發(fā)生進(jìn) 行了初步研究，在其所采用的LP + IBA0.5mg/L + NAA0.3mg/LS根培養(yǎng)基中，少量組培苗 形成不定根，且組培苗基部產(chǎn)生大量愈傷組織，嚴(yán)重影響了不定根質(zhì)量。本申請(qǐng)人于2004年 從日本引進(jìn)了 27個(gè)抗松材線蟲病赤松優(yōu)良家系的成熟種子，通過組織培養(yǎng)增殖方法獲得了大 量可供生根的組培苗，為無性快速繁殖現(xiàn)有抗病材料奠定了基礎(chǔ)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，與大多數(shù)松 屬樹種一樣，赤松組培苗不定根發(fā)生十分困難，而只有在生根問題解決以后，離體再生的小 植株才會(huì)成為人工造林的有用材料。為此，急需尋找一種高效誘導(dǎo)赤松組培苗不定根發(fā)生的 方法。
三
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要針對(duì)赤松組織培養(yǎng)中不定根發(fā)生率較低的現(xiàn)狀，尋找一種高效誘導(dǎo)赤松組培 苗不定根發(fā)生的方法，旨在為實(shí)現(xiàn)赤松抗松材線蟲病優(yōu)良基因型的快速繁殖提供有效幫助。技術(shù)方案 一種高效誘導(dǎo)赤松組培苗不定根發(fā)生的方法，其特征在于該方法包括以下步
驟
(1) 挑選生長(zhǎng)幼嫩、針葉夾角小、高1.(M.5 cm的赤松組培苗接種于含有萘乙酸(NAA)、 吲哚丁酸(IBA)和蔗糖的1/2 1/4WPM培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定根原基；
(2) 完成不定根原基誘導(dǎo)后，將外植體轉(zhuǎn)入含有活性炭(AC)和蔗糖的1/2WPM培養(yǎng) 基中促進(jìn)不定根的表達(dá)與伸長(zhǎng)。
(3) 將己生根的再生植株移栽于培養(yǎng)土中，噴水保濕。
其中，步驟(I)中所述誘導(dǎo)不定根原基的培養(yǎng)基中含有NAA0.1 0.2mg/L、 IBA1.0 2.0 mg/L及蔗糖0.5~1.5 %，誘導(dǎo)處理時(shí)間為25-30天。
步驟(2)中所述促進(jìn)不定根表達(dá)與伸長(zhǎng)的培養(yǎng)基中添加有AC0.5 1.0g/L和蔗糖2.0e/0。
上述過程所采用的培養(yǎng)條件為溫度24~26 °C ，光照2000 Lux,每日光照16 h。
有益效果本發(fā)明以生長(zhǎng)幼嫩、高度控制在一定范圍內(nèi)的赤松組培苗為外植體，采用兩 步生根法，于生長(zhǎng)素誘導(dǎo)處理25-30天后及時(shí)轉(zhuǎn)移至無生長(zhǎng)素但添加活性炭的培養(yǎng)基中，極 大地提高了生根率，并改善了不定根的質(zhì)量。采用本發(fā)明，不定根發(fā)生率最高達(dá)91.7%，且 根莖之間愈傷組織較少，維管連接緊密，3個(gè)月后移栽成活率達(dá)79%以上。
四

圖1為大量生根的赤松組培苗
圖2為根莖之間連接緊密的赤松組培再生植株
圖3為溫室里生長(zhǎng)良好的赤松組培再生植株
五具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。 以抗松材線蟲病赤松不同家系成熟種子(從日本引進(jìn))在無菌條件下萌發(fā)的幼苗子葉節(jié) 為外植體，接種于GD+6-BA3 5 mg/L+NAA0.1~0.3 mg/L培養(yǎng)基中誘導(dǎo)產(chǎn)生初代芽，伸長(zhǎng)的 芽接種于GD+6-BA1.5-2.5 mg/L+NAA0.25 mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，經(jīng)過多次增殖培養(yǎng) 獲得大量叢生芽。在進(jìn)行不定根誘導(dǎo)前4~5周將叢生芽接種于添加活性炭的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，備用。
實(shí)施例1
試驗(yàn)材料為抗松材線蟲病赤松1#-A無性系
選取生長(zhǎng)幼嫩、針葉夾角小、高1.0~1.5 cm的叢生芽分別單個(gè)切下，接種于1/4WPM十 NAA 0.1 mg/L+IBA1.0 mg/L+蔗糖0.5%培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定根原基，30天后，將外植體轉(zhuǎn)入 1/2WPM+AC0.5g/L+蔗糖2.0。/。培養(yǎng)基中促進(jìn)不定根表達(dá)與伸長(zhǎng)，30天后，統(tǒng)計(jì)不定根發(fā)生 率，記錄平均根數(shù)并觀察根莖之間愈傷組織發(fā)生情況；將再生植株根部瓊脂洗凈，移栽于培 養(yǎng)土中，噴水保濕，3個(gè)月后統(tǒng)計(jì)移栽成活率。具體數(shù)據(jù)見表l。
上述過程的培養(yǎng)條件溫度24~26 。C,光照2000Lux，每日光照16h。實(shí)施例2
試驗(yàn)材料為抗松材線蟲病赤松3#-5無性系
除誘導(dǎo)不定根原基的培養(yǎng)基更換為l/2WPM+NAA0.2mg/L + IBA1.0mg/L+蔗糖1.0% 外，其余均與實(shí)施例1同。
實(shí)施例3
試驗(yàn)材料為抗松材線蟲病赤松5#-3無性系
除誘導(dǎo)不定根原基的培養(yǎng)基更換為1/2WPM+NAA0.1 mg/L+IBA2.0 mg/L+蔗糖0.5%外， 其余均與實(shí)施例1同。 實(shí)施例4
試驗(yàn)材料為抗松材線蟲病赤松6#-4無性系
除誘導(dǎo)不定根原基的培養(yǎng)基更換為1/4WPM+NAA0.1 mg/L+IBA1.0mg/L+蔗糖1.0%外， 其余均與實(shí)施例1同。 實(shí)施例5
試驗(yàn)材料為抗松材線蟲病赤松7#-13無性系
除誘導(dǎo)不定根原基的培養(yǎng)基更換為l/4WPM + NAA0.2mg/L + IBA1.0mg/L+蔗糖1.5%， 并且于25天后將外植體轉(zhuǎn)入1/2WPM+AC1.0 g/L+蔗糖2.0%培養(yǎng)基中外，其余均與實(shí)施例1 同。
表1為實(shí)施例1至5中赤松組培苗不定根發(fā)生及移栽成活情況。
表1赤松組培苗不定根發(fā)生及移栽成活情況
實(shí)施不定根發(fā)根數(shù)愈傷成活率
不定根原基誘導(dǎo)培養(yǎng)基
例生率(％)(條)組織(%)
11/4WPM+NAA0.1 mg/L+IBA1.0 mg/L+蔗糖0.5%91.72~3極少79.4
21/2WPM+NAA0.2 mg/L+IBA1.0 mg/L+蔗糖1.0%87.52~3極少92.9
3/2WPM+NAA0.mg/L+IBA2.0 mg/L+蔗糖0.5%85.73~4極少90.0
41/4WPM+NAA0.1 mg/L+IBA1.0mg/L+蔗糖1.0%85.73~4極少100
51/4WPM+NAA0.2 mg/L+IBA1.0 mg/L+蔗糖1.5%83.33~4極少83.3
表1結(jié)果表明，采用本發(fā)明使赤松各無性系組培苗不定根發(fā)生率達(dá)80%以上，最高達(dá) 91.7%，每植株平均發(fā)根2 4條，且組培苗基部的愈傷組織極少，根莖之間連接緊密(圖l、 圖2)。移栽至溫室后，再生植株生長(zhǎng)良好，3個(gè)月后移栽成活率均在79%以上(圖3)。本發(fā) 明較好地解決了赤松組培苗不定根發(fā)生困難的問題，為工廠化生產(chǎn)抗病赤松組培再生植株奠 定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為其他松屬樹種組培苗不定根發(fā)生研究提供了重要的參考依據(jù)。
權(quán)利要求
1、一種高效誘導(dǎo)赤松組培苗不定根發(fā)生的方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)挑選生長(zhǎng)幼嫩、針葉夾角小、高1.0～1.5cm的赤松組培苗接種于含有萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)和蔗糖的1/2～1/4WPM培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定根原基；(2)完成不定根原基誘導(dǎo)后，將材料轉(zhuǎn)入含有活性炭(AC)和蔗糖的1/2WPM培養(yǎng)基中促進(jìn)不定根的表達(dá)與伸長(zhǎng)。(3)將已生根的再生植株移栽于培養(yǎng)土中，噴水保濕。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述方法，其特征在于步驟(1)中所述誘導(dǎo)不定根原基的培養(yǎng)基中 含有NAA0.1 0.2mg/L、 IBA 1.0~2.0 mg/L、蔗糖0.5~1.5 0/0。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于步驟(1)中不定根原基誘導(dǎo)處理時(shí)間為25-30天。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于步驟(2)中所述促進(jìn)不定根表達(dá)與伸長(zhǎng)的培 養(yǎng)基中含有AC0.5 1.0g/L、蔗糖2.0%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效誘導(dǎo)赤松組培苗不定根發(fā)生的方法。該方法以生長(zhǎng)幼嫩的赤松組培苗為外植體，采用“兩步法”，即先在1/2～1/4WPM+NAA0.1～0.2mg/L+IBA1.0～2.0mg/L+蔗糖0.5～1.5％培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定根原基發(fā)生，進(jìn)而將外植體轉(zhuǎn)入1/2WPM+AC0.5～1.0g/L+蔗糖2.0％培養(yǎng)基中促進(jìn)不定根表達(dá)與伸長(zhǎng)，從而完成不定根發(fā)生過程。采用本發(fā)明，赤松組培苗不定根發(fā)生率高，且根系發(fā)育良好，移栽成活率高，為大量生產(chǎn)抗松材線蟲病赤松組培再生植株奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)其他松樹種組培苗的培養(yǎng)也具有重要參考價(jià)值。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101589690SQ200910032680
公開日2009年12月2日 申請(qǐng)日期2009年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月30日
發(fā)明者葉建仁, 吳小芹, 張紅巖, 朱麗華, 莉 秦 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)