專利名稱：：四氫嘧啶在冷凍保存細(xì)胞、組織、器官中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及四氫嘧啶在冷凍保存細(xì)胞、組織、器官中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：在生物實(shí)驗(yàn)及疾病治療中經(jīng)常需要對微生物及動物細(xì)胞、組織、器官進(jìn)行冷凍保存，尤其是器官移植過程中，對器官的凍存有利于保證供體器官的質(zhì)量。但低溫凍存時細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水會形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細(xì)胞死亡。目前常用的凍存保護(hù)劑為二甲基亞砜，能夠降低細(xì)胞冰點(diǎn)，減少冰晶的形成，減輕自由基對細(xì)胞損害，改變生物膜對電解質(zhì)、藥物、毒物和代謝產(chǎn)物的通透性，但二甲基亞砜在常溫下對細(xì)胞有較強(qiáng)的毒性作用。與蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)發(fā)生作用B導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。因此，凍存過程中應(yīng)盡可能地減少二甲基亞砜的用量來降低其對細(xì)胞的毒性。器官移植是20世紀(jì)人類醫(yī)學(xué)科學(xué)的重大進(jìn)展，目前，全世界在腎臟、肝臟、心臟、胰腺和骨髓移植的領(lǐng)域的移植總數(shù)已超過70萬例(次)，存活最長的器官移植受者已近半個世紀(jì)。器官移植是治療終末期器官衰竭唯一有效的根治手段。任何臨床器官移植首先要有高質(zhì)量的供體，這是器官移植成功的先決條件和根本保障。目前常用的器官保存液有UW液、IGL保存液、Celsior液、HTK液、SMO保存液、Collins液、HC-A液、WMO-l溶液、HCA-II保存液、LYPS液、STH-l、STH-2液、、Euro-Collins液。其主要原理是減少由于低溫保存導(dǎo)致的細(xì)胞水腫；防止細(xì)胞的酸化作用；防止灌洗液保存過程中細(xì)胞間隙的膨脹；防止再灌注過程中氧自由基的損傷；提供再生高能磷酸化合物的底物。因此多含有一定的非滲透性物質(zhì)、自由基清除劑、細(xì)胞膜穩(wěn)定劑及其他線粒體保護(hù)劑、提高器官供養(yǎng)的物質(zhì)。1，4,5，6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸，俗稱四氫嘧啶(Ectoine),是1985年發(fā)現(xiàn)的一種新型氨基酸，是許多耐鹽微生物為維持滲透壓平衡而在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的一種相容性溶質(zhì)，具有高度水溶性。四氫嘧啶能夠穩(wěn)定天然蛋白質(zhì)的水合層，保護(hù)酶、DNA等生物大分子和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，幫助細(xì)胞抵抗冷凍、干旱、高溫、高鹽、輻射等各種逆境，去目前開發(fā)的商業(yè)用途集中于化妝品，專利文獻(xiàn)W00219978公開了其在口腔護(hù)理中的應(yīng)用，專利文獻(xiàn)DE102004016129公開了其在皮膚護(hù)理及疾病預(yù)防中的應(yīng)用。目前尚未發(fā)現(xiàn)四氫嘧啶用于細(xì)胞、組織、器官凍存保護(hù)的相關(guān)研究和報道。
發(fā)明內(nèi)容針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了四氫嘧啶的一種新用途。本發(fā)明實(shí)質(zhì)上是四氫嘧啶在冷凍保存細(xì)胞、組織、器官中的應(yīng)用。四氫嘧啶的有效濃度為0.lg/L-100g/L，優(yōu)選濃度為0.5g/L-20g/L。四氫嘧啶在冷凍保存細(xì)胞、組織、器官時可以單獨(dú)使用，也可以與一些常規(guī)的用于細(xì)胞、組織、器官冷凍保存的化學(xué)試劑聯(lián)合使用。這些化學(xué)試劑包括以下幾類1、二甲基亞砜、甘油、血清白蛋白四氫嘧啶與其中的任一種或任幾種的組合聯(lián)合使用，可以提高細(xì)胞和組織的凍存的保護(hù)效果。2、聚乙二醇、乳糖酸、木棉糖、羥乙基淀粉、磷酸鹽緩沖液、組氨酸緩沖液、還原型谷胱甘肽、培氟卡波、曲美他嗪、色氨酸、a-酮戊二酸及川寫嗪、硫酸鎂、磷酸二氫鉀四氫嘧啶與其中的任一種或任幾種的組合聯(lián)合使用，可以提高器官凍存的保護(hù)效果。所述細(xì)胞、組織、器官包括動物(包括人)細(xì)胞、組織、器官，也可以是微生物細(xì)胞。本申請的發(fā)明人通過試驗(yàn)證明四氫嘧啶可以幫助細(xì)胞抵抗冷凍條件，提高細(xì)胞、組織、器官凍存的保護(hù)效果。與二甲基亞砜聯(lián)合使用可以減少其用量降低其對細(xì)胞的毒性，提高凍存效果。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明實(shí)施例l:四氫嘧淀對豬肝細(xì)胞低溫凍存的影響健康1-7日齡中國實(shí)驗(yàn)型小型豬，采用改良Seglen體外二步膠原酶灌注法分離肝細(xì)胞，雙層消毒紗布過濾，然后50g，3min離心3次，獲取肝細(xì)胞，于Olympus倒置相差顯微鏡下用血細(xì)胞計數(shù)板計算肝細(xì)胞數(shù)量，4g/L臺盼藍(lán)拒染法計存活率,超過85%的用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)液為L-15培養(yǎng)液,加有10ml/LFBS、氫化可的松0.1Pg/L、胰島素100Pg/L、青霉素100kU/L及鏈霉素100mg/L，對照組加入50mL/LDMS0，實(shí)驗(yàn)組加入50mL/LDMSO及100mL/L四氫嘧啶。然后分裝入凍存管，在室溫下放置15min,置于4'C20min，以-l'C/rain降至-20'C，保存30min，再以-1'C/min降至-80'C長期保存.30d與60d后取出凍存后的肝細(xì)胞，快速置于37。C水浴1-2min,然后緩慢稀釋，共加入培養(yǎng)液約30mL，4°C,30g，離心3min，棄上清液,重新混懸于培養(yǎng)液中，計算細(xì)胞存活率(見表l)，并計算貼壁率。于Olympus倒置相差顯微鏡下觀察肝細(xì)胞形態(tài)。表1:凍存復(fù)蘇后肝細(xì)胞存活率和貼壁率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>*與對照組相比P<0.01在倒置顯微鏡下觀察對照組和復(fù)蘇后接種培養(yǎng)的肝細(xì)胞生長情況發(fā)現(xiàn)，對照肝細(xì)胞形態(tài)較差，未見雙核細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組組肝細(xì)胞生長旺盛，貼壁率高，細(xì)胞膜完整，胞質(zhì)內(nèi)顆粒豐富，可見較多雙核細(xì)胞，核仁清楚。實(shí)施例2:四氫嘧啶對人肝細(xì)胞低溫凍存的影響人肝細(xì)胞的分離按照文獻(xiàn)方法進(jìn)行(王宇明，陳國致，董家鴻，等.分離肝細(xì)胞的體外灌流法及其應(yīng)用。中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，1994，11(增刊)45-46))。分離的細(xì)胞經(jīng)臺盼藍(lán)染色、計數(shù)。將肝細(xì)胞調(diào)至濃度為lX107-2X107ml分裝入凍存管各0.7ml備用，對照組加入50mL/LDMS0，實(shí)驗(yàn)組加入50mL/LDMS0及150mL/L四氫嘧啶。先將凍存管在0。C下凍存30min,然后-30'C下凍存lh，再在-8(TC下凍存4h最后移入液氮罐中，保存l個月后復(fù)蘇。計算存活率和24h貼壁率(結(jié)果見表2)，后在倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)肝細(xì)胞的生長情況及形態(tài)變化。收集的上清液用全自動生化分析儀檢測其白蛋白含量(結(jié)果見表4)，復(fù)蘇后的人肝細(xì)胞培養(yǎng)3d后去上清液用PBS緩沖液沖洗，然后加入含4mmol/ml氯化銨、無血清的DMEM培養(yǎng)液,于加氯化銨后2、6、12、24h分別留取標(biāo)本，在生化分析儀上檢測上清液中尿素含量(結(jié).果見表3)。表2:復(fù)蘇后肝細(xì)胞的存活率和24h貼壁率(90<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表4:復(fù)蘇后肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液白蛋白含量(g/1)白蛋白含量對照組3.967實(shí)驗(yàn)組4.859**與對照組相比P〈0.01復(fù)蘇后倒置相差顯微鏡下形態(tài)學(xué)變化，實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞完整性恢復(fù)快，肝細(xì)胞生長旺盛，細(xì)胞膜完整，胞漿內(nèi)有豐富顆粒，核仁清楚。實(shí)施例3:四氫嘧啶對大鼠卵巢自體移植的影響選用未交配過的雌性SD大鼠，經(jīng)陰道涂片查脫落細(xì)胞證實(shí)有規(guī)律的動情周期。隨機(jī)分為2組，每組各10只，對照組為DMSO凍存后卵巢自體移植組，切除雙側(cè)卵巢后冰凍保存1周，然后再行自體皮下移植；實(shí)驗(yàn)組為四氫嘧啶凍存后卵巢自體移植組，切除雙側(cè)卵巢后冰凍保存l周，然后再行自體皮下移植。于術(shù)后第2天起每天行陰道涂片，觀察陰道脫落細(xì)胞的變化。出現(xiàn)動情周期變化者，根據(jù)脫落細(xì)胞的類型進(jìn)行分期；未出現(xiàn)動情周期者，光鏡下計數(shù)角化細(xì)胞所占的比例，>50%者視為有雌激素作用；4個月后處死動物，觀察移植物的大小、血運(yùn)及周圍血管網(wǎng)形成情況。對照組無一只出現(xiàn)有規(guī)律的動情周期變化，但8只角化細(xì)胞比例超過50%,2只是持續(xù)無角化狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)組6只有規(guī)律的動情周期變化，3只光鏡下每視野的角化細(xì)胞比例超過50%，上述9只大鼠認(rèn)為有雌激素作用。另外對照組有l(wèi)只大鼠出現(xiàn)卵巢萎縮，表面灰白色，血管網(wǎng)較少，實(shí)驗(yàn)組移植物明顯增大，周圍血管網(wǎng)豐富，表面呈粉紅色。權(quán)利要求1.四氫嘧啶在冷凍保存細(xì)胞、組織、器官中的應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于四氫嘧啶的有效濃度為0.lg/L-100g/L。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于四氫嘧啶在冷凍保存細(xì)胞、組織、器官時單獨(dú)使用。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于四氫嘧啶在冷凍保存細(xì)胞、組織、器官時與二甲基亞砜、甘油、血清白蛋白中的一種或任幾種聯(lián)合使用。5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于四氫嘧啶在冷凍保存細(xì)胞、組織、器官時與聚乙二醇、乳糖酸、木棉糖、羥乙基淀粉中的一種或任幾種聯(lián)合使用。6.根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于四氫嘧啶在冷凍保存細(xì)胞、組織、器官時與磷酸鹽緩沖液或/和組氨酸緩沖液聯(lián)合使用。7.根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于四氫嘧啶在冷凍保存細(xì)胞、組織、器官時與還原性谷胱甘肽聯(lián)合使用。8.根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于四氫嘧啶在冷凍保存細(xì)胞、組織、器官時與培氟卡波聯(lián)合使用。9.根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于四氫嘧啶在冷凍保存細(xì)胞、組織、器官時與曲美他嗪、色氨酸和a-酮戊二酸及川芎嗪中的一種或任幾種聯(lián)合使用。10.根據(jù)權(quán)利要求'1所述的應(yīng)用，其特征在于四氫嘧啶在冷凍保存細(xì)胞、組織、器官時與硫酸鎂或/和磷酸二氫鉀聯(lián)合使用。全文摘要本發(fā)明公開了四氫嘧啶的一種新用途，即四氫嘧啶在冷凍保存細(xì)胞、組織、器官中的應(yīng)用，其有效濃度為0.1g/L-100g/L，優(yōu)選濃度為0.5g/L-20g/L。使用時可單獨(dú)使用，也可與一些常規(guī)的用于細(xì)胞、組織、器官冷凍保存的化學(xué)試劑聯(lián)合使用。本申請的發(fā)明人通過試驗(yàn)證明四氫嘧啶可以幫助細(xì)胞抵抗冷凍條件，提高細(xì)胞、組織、器官凍存的保護(hù)效果。與二甲基亞砜聯(lián)合使用可以減少其用量降低其對細(xì)胞的毒性，提高凍存效果。文檔編號A01N1/02GK101491237SQ20091001463公開日2009年7月29日申請日期2009年3月3日優(yōu)先權(quán)日2009年3月3日發(fā)明者厲保秋申請人:山東大學(xué)