專利名稱：：組蛋白乙酰化酶基因OsELP3作為調(diào)控水稻開花期的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于植物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及一個(gè)調(diào)控水稻開花時(shí)期的組蛋白乙?；富騠l^:/^(ElongationProtein3)的分離克隆、功能驗(yàn)證和應(yīng)用。所述的基因與植物的開花時(shí)期有關(guān)。
背景技術(shù)：
：高等植物從種子萌發(fā)到再結(jié)出新種子這一完整的生命周期可分為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)兩個(gè)階段，其中由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)換的過程稱為成花誘導(dǎo)。這一過程受到植物自身遺傳因子和外界環(huán)境兩方面因素的影響。不同的高等植物其成花誘導(dǎo)過程有一定的相似性和規(guī)律性植物經(jīng)過一定時(shí)期的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)達(dá)到花熟狀態(tài)，其內(nèi)部的成花物質(zhì)就感受到外界環(huán)境，如光照、溫度、濕度等的剌激，誘導(dǎo)下游開花基因的表達(dá)，從而促使頂端分生組織分化成花。因此，開花是植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變，在植物的整個(gè)發(fā)育過程中起到了非常重要的作用。近年來(lái)隨著模式植物擬南芥基因組研究的深入，其開花作用機(jī)理的研究取得了顯著進(jìn)展，控制擬南芥成花誘導(dǎo)過程的主要通路已經(jīng)基本探明?？傮w來(lái)講，擬南芥的開花誘導(dǎo)受四種途徑的控制光周期途徑、春化途徑、GA(赤霉素)途徑和自主途徑(YanovskyMJ，KaySA.Livingbythecalendar:howplantsknowwhentoflower.AtoievMo/Ce//5Zo/，2003，4(4):265—276.)。光周期現(xiàn)象指生長(zhǎng)在地球上不同地區(qū)的植物在長(zhǎng)期適應(yīng)環(huán)境過程中對(duì)日照長(zhǎng)度的周期性變化表現(xiàn)出反應(yīng)的現(xiàn)象。根據(jù)對(duì)不同日照長(zhǎng)度的反應(yīng)可把植物分為長(zhǎng)日植物、短日植物和日中性植物。擬南芥就是一種典型的長(zhǎng)日植物，即日照長(zhǎng)度只有長(zhǎng)于某一臨界時(shí)長(zhǎng)時(shí)才能誘導(dǎo)植物開花。在近些年的研究中，逐步發(fā)現(xiàn)了一批光周期開花途徑中的關(guān)鍵基因，如constans(co)(Putterilletal.,TheCONSTANSgeneofArabidopsispromotesfloweringandencodesaproteinshowingsimilaritiestozincfingertranscriptionfactors,Ce//,1995,80:847-857.)，gigantea(gi)(Fowleretal.，GIGANTEA:acircadianclock-controlledgenethatregulatesphotoperiodicfloweringinArabidopsisandencodesaproteinwithseveralpossiblemembrane-spanningdomains.￡A/BO1999,18(17):4679-88.)，F(xiàn)T(Kardailskyetal.,ActivationtaggingofthefloralinducerFT.&/e"c,1999，286(5446):1962-5.)等，隨著這些基因的發(fā)現(xiàn)及功能的深入研究，擬南芥中的開花調(diào)控途徑也日趨完善。相對(duì)于擬南芥而言，單子葉植物(禾本科植物)水稻是一種短日植物。由于其生命周期長(zhǎng)等原因，相關(guān)研究還顯得有些滯后。但是在水稻中發(fā)現(xiàn)了與擬南芥中同源的開花基因以及與其相似的調(diào)控途徑。<%G/，(Hayamaetal.，Adaptationofphotoperiodiccontrolpathwaysproducesshort-dayfloweringinrice.TVaftwe,2003,422:719—722.)//ii/(Yanoetal.，Hdl，amajorphotoperiodsensitivityquantitativetraitlocusinrice，iscloselyrelatedtotheArabidopsisfloweringtimegeneCONSTANS.尸/aWCe〃，2000，12:2473—2484.)和7/必a(Kojima，etal.,Hd3a，ariceorthologoftheArabidopsisFTgene,promotestransitiontofloweringdownstreamofHdlundershort-dayconditions.P/aWCe〃P/^fo/，2002,43:1096—1105.)分別對(duì)應(yīng)于擬南芥中的G/,CO和尸r。這些基因的功能及在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的位置也逐步被確認(rèn)。所有這些都為以后水稻中開花基因的研究工作奠定了基礎(chǔ)。表觀遺傳現(xiàn)象的遺傳基礎(chǔ)在于染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化對(duì)基因表達(dá)的影響。一般來(lái)講，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變依賴于兩類酶活性，一類是ATP水解酶活性，它可以對(duì)染色質(zhì)進(jìn)行重塑(VignaliMetal.，ATP-DependentChromatin-RemodelingComplexes.Mo/a"c;Ce〃歷o/，2000,20(6):1899-1910.);另一類是一系列能對(duì)組蛋白尾部特定殘基進(jìn)行共價(jià)修飾的酶類(MeyerP,C7zraOT加力ieOTOt/e戰(zhàn)"g.C"rCjp/".歷o/.2001,4:457462)。組蛋白氨基末端的乙?；腿ヒ阴；腔蚧罨鸵种七^程中的主要調(diào)控機(jī)制。組蛋白乙?；揎椖転橄嚓P(guān)調(diào)控蛋白提供其在組蛋白上的附著位點(diǎn)，改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)和活性。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)通常作為多亞基輔激活物復(fù)合體的一部分，催化組蛋白乙?；苓x擇性地使某些染色質(zhì)區(qū)域的結(jié)構(gòu)從緊密變得松散，開放某些基因的轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)其表達(dá)水平。隨著成花通路的探明，植物的開花機(jī)理漸趨清晰。但是在染色質(zhì)修飾水平上，植物的開花時(shí)期是如何控制的，現(xiàn)在仍然不是很清楚。本發(fā)明找到了一個(gè)能在組蛋白修飾水平上調(diào)控植物開花時(shí)期的基因，進(jìn)一步完善了植物成花機(jī)理及表觀遺傳現(xiàn)象的內(nèi)容。經(jīng)檢索，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中利用乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域(HATDomain)比對(duì)搜索水稻蛋白序列發(fā)現(xiàn)一個(gè)組蛋白乙酰化酶a^ifJ(ElongationProtein3)，其全長(zhǎng)cDNA登陸號(hào)為AK122179，基因ID號(hào)為4336205。(見表一)關(guān)于此基因在水稻中的功能還不清楚。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于通過克隆一種組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，進(jìn)行功能驗(yàn)證，通過遺傳轉(zhuǎn)化水稻本身，使該基因能夠調(diào)控水稻植株的開花時(shí)期的應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)-本發(fā)明從水稻中分離得到一個(gè)能夠調(diào)控水稻開花時(shí)期的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶基因<%￡￡戶丄它的編碼基因如序列表SEQIDNO:l所示。序列全長(zhǎng)為1722個(gè)堿基，編碼573個(gè)氨基酸。經(jīng)驗(yàn)證，所述的基因tt^LPJ與水稻開花時(shí)期有關(guān)。將該基因的完整翻譯區(qū)(Codingsequence)與玉米泛素啟動(dòng)子(Ubiquitin)結(jié)合后直接轉(zhuǎn)入水稻，轉(zhuǎn)基因植株花期明顯比野生型對(duì)照植株提前；轉(zhuǎn)入RNAi抑制片段的植株花期明顯比野生型對(duì)照植株延遲。通過分析發(fā)現(xiàn)fls^Z/y基因通過組蛋白修飾手段參與了服a、祝厶^G/等一些開花基因的表達(dá)調(diào)控。如圖1所示，本發(fā)明構(gòu)建了一種超表達(dá)載體pU1301和一種抑制表達(dá)載體pDS1301，獲得轉(zhuǎn)化載體pU1301-ELP3和pDS1301-ELP3。利用該轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化水稻品種"中花11"(一個(gè)報(bào)道的粳稻亞種材料，來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所)，得到轉(zhuǎn)基因水稻植株。具體操作步驟如下(1)從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得到該基因的DNA序列，根據(jù)該序列設(shè)計(jì)引物對(duì)，擴(kuò)增CDS區(qū)域；(2)構(gòu)建超表達(dá)載體pU1301和抑制表達(dá)載體pDS1301，獲得轉(zhuǎn)化載體pU1301-ELP3和pDS130卜ELP3;(3)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法將所述的基因t^五Zi^導(dǎo)入水稻受體，獲得轉(zhuǎn)化植株；(4)借助RT-PCR和NorthernBlot方法分析鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株；并觀察轉(zhuǎn)基因植株表型；(5)將陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株發(fā)芽后進(jìn)行長(zhǎng)短日照處理并觀察處理后表型，統(tǒng)計(jì)開花天數(shù)并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；(6)利用RealtimePCR和KT-PCR方法分析水稻內(nèi)源<%￡Zi^基因表達(dá)模式；(7)利用RealtimePCR分析步驟(5)的轉(zhuǎn)基因植株中目標(biāo)基因的表達(dá)；(8)借助WesternBlot分析轉(zhuǎn)基因植株組蛋白修飾情況。序列表SEQIDNO:1顯示的是本發(fā)明分離克隆的Os虹W基因編碼區(qū)；同時(shí)顯示了該基因編碼的氨基酸序列。圖l:是載體圖。圖1A:是超表達(dá)載體PU1301;圖IB:是抑制表達(dá)載體pDS1301。圖2:是Q^丄P3基因在TO代轉(zhuǎn)基因和野生型植株中的表達(dá)檢測(cè)。圖2A是Qs五丄P3基因在超表達(dá)和野生型植株中的表達(dá)檢測(cè)；圖2B:是OsfiZLi^基因在抑制表達(dá)和野生型植株中的表達(dá)檢測(cè)。圖3:(9^Z/y轉(zhuǎn)基因植株在長(zhǎng)短日照下的表型圖。圖3A(包含圖3A-l和圖3A-2):是長(zhǎng)日照下超表達(dá)材料開花提早，抑制表達(dá)材料開花延遲；圖3B:是短日照下，超表達(dá)材料開花提早'抑制表達(dá)材料花期不變的植株形態(tài)；圖3C(包含圖3C-1和圖3C-2):是轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性和陰性及野生型材料在長(zhǎng)短日照下的抽穗期統(tǒng)計(jì)分析，星號(hào)表示轉(zhuǎn)基因家系相對(duì)野生型差異顯著(*P〈0.05)或極顯著(**P<0.01)。圖4:Os^:尸J基因的表達(dá)模式。圖4A:是Os五丄i53在水稻各組織部位中呈現(xiàn)組成型表達(dá)模式；圖4B:是<%￡￡/^基因在長(zhǎng)日照下呈現(xiàn)均一表達(dá)模式，而在短日照下呈現(xiàn)節(jié)律表達(dá)模式圖5:是各開花基因在(^&ZP3轉(zhuǎn)基因材料和野生型中的表達(dá)情況。圖5A(包含圖5A-1和圖5A-2):是圖5B(包含圖5B-1和圖5B-2):是圖5C(包含圖5C-1和圖5C-2):是QsG/圖6:是WesternBlot檢測(cè)ELP3的組蛋白修飾功能。具體實(shí)施例方式實(shí)施例lOs五丄P3基因的克隆及序列分析對(duì)發(fā)明所需要的基因，通過RT-PCR方法(參見J.薩姆布魯克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)，科學(xué)出版社，2002版)進(jìn)行擴(kuò)增得到其全長(zhǎng)編碼序列，具體步驟是根據(jù)公共數(shù)據(jù)庫(kù)(http:〃www.ncbi.nih.gov/,http:〃cdna01.dna,affrc.go.jp/cDNA/)中公布的水稻OsfLP3基因的全長(zhǎng)cDNA序列(詳見表O設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物通過T/A克隆連接到pGEMT-vector(Promega)進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。用來(lái)克隆全長(zhǎng)基R的引物為FLELP-F和FLELP-R,引物的具體序列見表4(參見說(shuō)明書末尾)同樣的方法得到RNAi抑制片段。用來(lái)克隆RNAi抑制片段的引物為ELPRNAi-F和ELPRNAi-R，引物序列見表4。表l來(lái)源基因信息基因名稱ID號(hào)全長(zhǎng)cDNA染色體定位(Genename)(GeneID)(FLcDNA)(Locus)Qs虹尸54336205AK122179Os04g0484900實(shí)施例2雙元Ti質(zhì)粒載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的建立具休步驟如下1)將帶有O"iW全長(zhǎng)cDNA的TA克隆，用和5aw別酶切，回收目標(biāo)條帶，與和酶切的表達(dá)載體質(zhì)粒pU130](見附圖1A,參照Huangetal.,Down-regulationofa/"/orwafe"iegw/"/or2-relatedgene,QsSi^TY,inducesDNAfragmentationandcelldeathinrice.尸/a"http://Vyw'o/,2007,144:1508-1519.)連接，即為構(gòu)建到超量表達(dá)載體。將帶有Q^丄尸J全L々干涉片段的T/A克隆用印"I和酶切，回收目標(biāo)條帶，與和酶切的表達(dá)載體質(zhì)粒pDS1301(見附圖1B，參見:Chuetal.，Promotermutationsofanessentialgeneforpollendevelopmentresultindiseaseresistanceinrice.Ge"esZ)ev,2006，20:1250-1255.)連接(所使用的內(nèi)切酶均購(gòu)自TAKARA公司，用法及用量按照該公司的產(chǎn)品說(shuō)明書；連接酶為hwitrogen公司產(chǎn)品，用法及用量按照該公司產(chǎn)品說(shuō)明書)；2)連接產(chǎn)物通過電轉(zhuǎn)化的方法(電轉(zhuǎn)化儀為eppendorf公司產(chǎn)品，所用電壓為1800v，操作方法見儀器說(shuō)明書)導(dǎo)入"iW朋(購(gòu)自Promega公司)，在含有250ppm卡那霉素(Roche公司產(chǎn)品)的LA(LA配方參見J.薩姆布魯克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)，科學(xué)出版社，2002版)抗性培養(yǎng)基上涂皿培養(yǎng)；3)將LA抗性培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的單菌落在超凈工作臺(tái)接種于滅菌的10ml離心管，管內(nèi)預(yù)先加入3ml含250ppm卡那霉素的LB抗性培養(yǎng)基，然后在37'C搖床上培養(yǎng)16-18小時(shí)。按照(《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，J.薩姆布魯克和D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002)所述抽提質(zhì)粒，用^pnl和Sawffl酶切并電泳檢測(cè)，根據(jù)插入片段的大小獲得陽(yáng)性的超表達(dá)雙元Ti質(zhì)粒載體pU1301-ELP3、pDS1301-ELP3-l;4)將帶有Osfi丄i53全長(zhǎng)干涉片段的TA克隆用印el和酶切，冋收目標(biāo)條帶，與和Sacl酶切的質(zhì)粒pDS1301-ELP3-l連接，依據(jù)2)、3)步得到抑制表達(dá)載體pDS1301-ELP3-2;5)把新構(gòu)建的表達(dá)載體pU1301-ELP3和pDS1301-ELP3-2通過電轉(zhuǎn)化的方法(參考文獻(xiàn)和使用的電壓參數(shù)如上所述)導(dǎo)入農(nóng)桿菌(購(gòu)TCAMBIA公司)菌株中。轉(zhuǎn)化后的菌株分別命名為TU-ELP3和TR-ELP3。實(shí)施例3雙元Ti質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的陽(yáng)性檢測(cè)1)將TU-ELP3和TR-ELP3向水稻受體品種"中花ll"(來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化方法參照Hiei等人報(bào)道的方法(Hieietal，Efficienttransformationofrice(C^yzora"voL.)mediatedbyJgro6acfen、7KandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA.P/a"/,1994,6:271-282.)進(jìn)行。所獲得的TO代轉(zhuǎn)基因植株命名為EU-n和ER-n，其中11=1，2，3...代表轉(zhuǎn)基因的不同家系。2)TO代轉(zhuǎn)化植株葉片抽提總DNA，DNA抽提方法為CTAB法(Murrayetal,RapidisolationofhighmolecularweightplantDNA.M/c/e/c爿c/血化s,1980，8:432卜4325.)。然后用常用的PCR方法對(duì)TO代轉(zhuǎn)化植株用潮霉素引物進(jìn)行陽(yáng)性檢測(cè)。潮霉素引物為Hn-F和Hn-R(由上海生工生物工程技術(shù)有限公司提供)序列見表4。PCR反應(yīng)總體積為20u1，具體配法是模板lOOng，10xPCRbuffer2y1，lOmMdNTP1.6u1，2.5mMMg2+1.5ul，正向引物、反向引物各0.4wl，TAQ酶0.2ul加水到20n1(所用到的PCRbuffer、dNTP、Mg2+、rTAQ酶等均購(gòu)自TAKARA公司)。PCR反應(yīng)條件如下94°C4分鐘，②94'C1分鐘，③56'Cl分鐘，72°C2.5分鐘，⑤從②一④循環(huán)32次，72°C10分鐘，⑦4'C保存。PCR產(chǎn)物在1X的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。因?yàn)槌泵顾鼗驗(yàn)檗D(zhuǎn)化載體所特有，這樣能擴(kuò)增出潮霉素基因特異帶的轉(zhuǎn)基因植株即為陽(yáng)性植株。對(duì)TO代陽(yáng)性植株收種子(Tl代)，為Tl代的大田種植和性狀調(diào)査做準(zhǔn)備在本實(shí)施例中，遺傳轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)基因植株獲得)的主要步驟、培養(yǎng)基以及使用的試劑如下轉(zhuǎn)化的主要步驟和試劑如下-(1)培養(yǎng)基中試劑和溶液縮寫本發(fā)明中培養(yǎng)基所用到的植物激素的縮寫表示如下6-BA(6-芐基腺嘌呤)；CN(羧芐青霉素)；KT(Kinetin,激動(dòng)素)；NAA(萘乙酸)；IM(U引哚乙酸)；2，4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(水解酪蛋白)；Hn(HygromycinB，潮霉素)；DMS0(DimethylSulfoxide,二甲基亞砜)；N6max(恥基本培養(yǎng)基的大量成分溶液)；N6mix(N6基本培養(yǎng)基的微量成分溶液)；MSmax(MS基本培養(yǎng)基的大量成分溶液)；MSmix(MS基本培養(yǎng)基的微量成分溶液)(2)主要溶液配方1)N6基本培養(yǎng)基大量元素母液[10倍濃縮液]的配制硝酸鉀(認(rèn)03)28.3g磷酸二氫鉀(KH2P04)4.0g硫酸銨((NH4)2S(X)4,63g硫酸鎂(MgS047H20)1.85g氯化鈣(CaCl22H20)1.66g將上述試劑逐一用蒸餾水溶解，然后在室溫下用蒸餾水定容至1000ml,備用。2)N6基本培養(yǎng)基微量示素母液[100倍濃縮液(100X)]的配制碘化鉀(KI)0.08g硼酸(H3B03)0.16g硫酸錳(MnS04.4H20)0.44g硫酸鋅(ZnS047H20)0.15g室溫下用蒸餾水溶解并用蒸餾水定容至IOOOml,備用。3)鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(配制成100X液)的配制準(zhǔn)備800ml雙蒸水并加熱至70。C，加入乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA2H20)3.73克，充分溶解后在70'C水浴中保持2小時(shí)，用蒸餾水定容至1000ral，4'C保存?zhèn)溆谩?)維生素貯存液(100X)配制煙酸(Nicotinicacid)0.1g維生素Bl(ThiamineHC1)0.1g維生素B6(PyridoxineHC1)0.1g甘氨酸(Glycine)0.2g肌醇(Inositol)10g加蒸餾水定容至IOOOml，4'C保存?zhèn)溆谩?)MS基本培養(yǎng)基的大量元素母液(IOX)的配制硝酸銨16.5g硝酸鉀19.0g磷酸二氫鉀1.7g硫酸鎂3.7g氯化鈣4.4g室溫下用蒸餾水溶解并用蒸餾水定容至1000ml，備用。6)MS基本培養(yǎng)基的微量元素母液(100X)的配制碘化鉀0.083g硼酸0.62g硫酸錳0.86g鉬酸鈉(Na2Mo042H20)0.025g硫酸銅(CuS045H20)0.0025g室溫下用蒸餾水溶解并用蒸餾水定容至IOOOml，備用。7)2，4-D貯存液(l邁g/ml)的配制秤取2,4-DlOOtng，用lmlIN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后用蒸餾水定容至100ml，于室溫下保存、備用。8)6-BA貯存液(lmg/ml)的配制秤取6-BAlOOmg，用lmlIN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml用蒸餾水溶解完全后定容至100ml，室溫保存，備用。9)萘乙酸(NAA)忙存液(lmg/ml)的配制秤取NAA100mg，用lmllN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ral蒸餾水溶解完全后并用蒸餾水定容至100ml，4'C保存?zhèn)溆谩?0)吲哚乙酸(IAA)貯存液(lmg/ml)的配制秤取IMlOOmg，用lmlIN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后并用蒸餾水定容至100ml。11)葡萄糖貯存液(0.5g/ml)的配制秤取葡萄糖125g,然后用蒸餾水溶解定容至250ml，滅齒后4'C保存?zhèn)溆谩?2)AS貯存液的配制秤取AS0.392g,DMSOlOml，分裝至L5ml離心管內(nèi)，4'C保存?zhèn)溆谩?3)IN氫氧化鉀jt存液秤取氫氧化鉀5.6g，并用蒸餾水溶解并定容至100ml，室溫保存?zhèn)溆谩?3)用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基組分及用量1)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6max母液(從已配好的10X濃縮液中)取100mlN6min母液(從已配好的100X濃縮液中)取10mlFe2+EDTA貯存液(從己配好的100X濃縮液中)取10ml維生素貯存液(從已配好的100X濃縮液中)取10ml2，4-D貯存液(從已配好的貯存液中)取2.5ml脯氨酸(Proline)0.3g/LCH0.6g/L蔗糖(Sucrose)30g/LPhytagel3g/l加蒸餾水至900ml，用1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值至5.9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口，在121"C下滅菌12分鐘。2)愈傷組織繼代培養(yǎng)基N6max母液(從已配好的10X濃縮液中)取100mlN6min母液(從已配好的100X濃縮液中)取10mlFe2+EDTA貯存液(從已配好的100X濃縮液中)取10ml維生素貯存液(從已配好的100X濃縮液中)取10ml2，4-D貯存液(從已配好的貯存液中)取2.0ml脯氨酸0.5g/lCH0.6g/l蔗糖30g/lPhytagel3g/l加蒸餾水至900ml，用lN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值至5.9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口在121'C下滅菌12分鐘。3)預(yù)培養(yǎng)基N6max母液(從己配好的10X濃縮液中)取12.5mlN6min母液(從已配好的100X濃縮液中)取1.25mlFe2+EDTA貯存液(從已配好的100X濃縮液中)取2.5ml維生素貯存液(從已配好的100X濃縮液中)取2.5ml2，4-D貯存液(從已配好的貯存液)取0.75mlCH0.15g/L蔗糖5g/L瓊脂粉(Agarose)1.75g/L加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口，在121。C下滅菌12分鐘。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250WAS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。4)共培養(yǎng)基恥max母液(從已配好的10X濃縮液中)取12.5mlN6min母液(從已配好的100X濃縮液中)取1.25mlFe2+EDTA貯存液(從已配好的100X濃縮液中)取2.5ml維生素貯存液(從已配好的100X濃縮液中)取2.5ml2,4-D貯存液(從已配好的貯存液中)取0.75mlCH0.2g/L蔗糖5g/L瓊脂粉1.75g/L加蒸餾水至250ml，用1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值至5.6，封口，在121'C下滅菌12分鐘。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和25(miAS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/每皿)。5)懸浮培養(yǎng)基N6max母液(從已配好的10X濃縮液中)取5mlN6min母液(從已配好的100X濃縮液中)取0.5mlFe2+EDTA貯存液(從已配好的100X濃縮液中)取0.5ml維生素貯存液(從已配好的100X濃縮液中)取lml2,4-DJC:存液(從己配好的貯存液中)取0.2ffllCH0.08g/L蔗糖2g/L加蒸餾水至100ml，用1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值至5.4，分裝到兩個(gè)100ml的三角瓶中，封口，在12rC下滅菌12分鐘。使用前加入lml葡萄糖貯存液和10(miAS貯存液。6)選擇培養(yǎng)基N6max母液(從已配好的10X濃縮液中)取25mlN6min母液(從已配好的100X濃縮液中)取2.5mlFe2+EDTA貯存液(從已配好的100X濃縮液中)取2.5ml維生素貯存液(從已配好的100X濃縮液中)取2.5ml2，4-D貯存液(從己配好的貯存液中)取0.625mlCH0.15g/L蔗糖7.5g/L瓊脂粉1.75g/L加蒸餾水至250ml，用1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值至6.0，封口，在121'C下滅菌12分鐘。使用前溶解培養(yǎng)基，加入250WHn和400ppmCN，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。7)預(yù)分化培養(yǎng)基N6max母液(從已配好的10X濃縮液中)取25mlN6min母液(從已配好的100X濃縮液中)取2.5mlFe2+EDTA忙存液(從已配好的100X濃縮液中)取2.5ml維生素貯存液(從已配好的100X濃縮液中)取2.5ml6-BA貯存液(從已配好的貯存液中)取0.5mlKT貯存液(從己配好的貯存液中)取0.5mlNAA忙存液(從已配好'的貯存液中)取5(^1IAA貯存液(從已配好的貯存液中)取50WCH0.15g/L蔗糖7.5g/L瓊脂粉1.75g/L加蒸餾水至250ml，用1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值至5.9，封口，在121'C下滅菌12分鐘。使用前溶解培養(yǎng)基，加入25CmiHn和200ppmCN，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。8)分化培養(yǎng)基N6max母液(從已配好的10X濃縮液中)取100ml恥min母液(從已配好的100X濃縮液中)取10mlFe2+EDTA]t存液(從已配好100X濃縮液中)取10ml維生素貯存液(從已配好的100X濃縮液中)取10ml6-BAlt存液(從已配好的貯存液中)取2mlKT貯存液(從已配好的貯存液中)取2mlNAA貯存液(從已配好的貯存液中)取0.2mlIM貯存液(從己配好的貯存液中)取0.2mlCHlg/L蔗糖30g/LPhytagel3g/L加蒸餾水至900ml，用lN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值至6.0。煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口，在121'C下滅菌12分鐘。9)生根培養(yǎng)基MSmax母液(從已配好的10X濃縮液中)取50mlMSmin母液(從已配好的100X濃縮液中)取5mlFe2+EDTA忙存液(從己配好的100X濃縮液中)取5ml維生素貯存液(從已配好的100XJt存液中)取蔗糖Phytagel30g/L3g/L加蒸餾水至900ml，用lN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值至5.8。煮沸并定容至1000ml,分裝到生根管中(25ml/管)，封口，在121'C下滅菌12分鐘。(4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化步驟3.1愈傷組織誘導(dǎo)(1)將成熟的水稻種子("中花11",中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供的一個(gè)公開使用的水稻品種)去殼，然后依次用70%的乙醇處理1分鐘，0.15%氯化汞(HgCl2)種子表面消毒15分鐘；(2)用無(wú)菌水沖洗種子4-5次；(3)將滅過菌的水稻種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成如上所述)；(4)將接種后的培養(yǎng)基置于25土rC的黑暗處培養(yǎng)4周，得到水稻愈傷組織。3.2愈傷組織繼代培養(yǎng)挑選亮黃色、緊密且相對(duì)干燥的胚性愈傷組織，接種于如前所述的愈傷組織繼代培養(yǎng)基上，在26土rC，黑暗條件下培養(yǎng)2周，得到水稻繼代的愈傷組織。3.3愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)挑選緊密且相對(duì)干燥的胚性愈傷組織，接種于前面所述的預(yù)培養(yǎng)基上，在26士rc，黑暗條件下培養(yǎng)4天。3.4農(nóng)桿菌培養(yǎng)(1)農(nóng)桿菌EHA105接種在帶有對(duì)應(yīng)抗性選擇的培養(yǎng)基LA上預(yù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28'C培養(yǎng)48小時(shí)；(2)再將步驟(1)的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至前面描述的懸浮培養(yǎng)基上，在28'C搖床上培養(yǎng)2-3小時(shí)。3.5農(nóng)桿菌侵染(1)將預(yù)培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)移至滅過菌的玻璃瓶?jī)?nèi)；(2)調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至OD,0.8-1.0;(3)將愈傷組織在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；(4)轉(zhuǎn)移愈傷組織至滅好菌的濾紙上吸干；然后將其接種到如前所述的共培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度19-20。C，培養(yǎng)72小時(shí)(3天)。3.6愈傷組織洗滌和選擇培養(yǎng)(抗性篩選)(1)用無(wú)菌水洗滌水稻愈傷組織至看不見農(nóng)桿菌；(2)將愈傷組織浸泡在含400mg/L羧芐青霉素(CN)的無(wú)菌水中30分鐘；(3)將該愈傷組織轉(zhuǎn)移至滅菌好的濾紙上，使該愈傷組織不帶水；(4)轉(zhuǎn)移愈傷組織至選擇培養(yǎng)基上選擇2-3次，每次2周(第一次潮霉素濃度為400毫克/升，第二次及以后潮霉素為250毫克/升)。3.7預(yù)分化和分化(1)將以上得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移至如前所述的預(yù)分化培養(yǎng)基上，在黑暗處培養(yǎng)5-7天；培養(yǎng)溫度26°C。(2)轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷組織至如前所述的分化培養(yǎng)基上，置光照下，光照強(qiáng)度2000lx培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為26°C，培養(yǎng)5周左右得到發(fā)少量根的轉(zhuǎn)基因小植株。3.8誘導(dǎo)生根(1)剪掉上述轉(zhuǎn)基因小植株的根；(2)將其轉(zhuǎn)移至如前所述的生根培養(yǎng)基中，在光照強(qiáng)度2000lx下培養(yǎng)2-3周，培養(yǎng)溫度為26'C,經(jīng)過18天左右得到生根的轉(zhuǎn)基因水稻小植株。3.9移栽洗掉小植株根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室培養(yǎng)，同時(shí)在移栽的最初的幾天保持水分濕潤(rùn)。本發(fā)明總共獲得獨(dú)立轉(zhuǎn)基因水稻植株超表達(dá)材料23株，RNAi材料34株。實(shí)施例4Tl代性狀調(diào)査和表達(dá)分析1)將本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因ELP3-n的陽(yáng)性家系以及野生型種植在自然長(zhǎng)日照(LD)條件下。對(duì)各家系的開花時(shí)間進(jìn)行性狀調(diào)查。調(diào)査結(jié)果顯示在自然長(zhǎng)日照條件下，Os虹/y的轉(zhuǎn)基因家系的開花時(shí)期相對(duì)野生型，超表達(dá)材料開花提前而RNAi材料開花延遲(參見表2，圖3A,C)。表2長(zhǎng)日照條件下轉(zhuǎn)基因和野生型植株開花時(shí)間統(tǒng)計(jì)表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>說(shuō)明(1)家系EU2，10和20均為本發(fā)明的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，其中EU2為表達(dá)量無(wú)升高的陰性對(duì)照；家系ER8，15和16均為本發(fā)明的RNAi轉(zhuǎn)基因植株，其中ER16為表達(dá)量無(wú)下降的陰性對(duì)照(2)毎個(gè)家系選一定數(shù)量轉(zhuǎn)基因植株，用單因素方差分析的方法來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因家系和野生型開花時(shí)間的差異。<5%表示差異顯著；？<1%表示差異極顯著)。為了檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株中目標(biāo)基因的表達(dá)量，申請(qǐng)人采用RT-PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了表達(dá)分析。實(shí)驗(yàn)所用的總RNA來(lái)自分蘗期的葉片，RNA抽提用試劑是Invitrogen公司的Trizol抽提試劑盒(具體操作步驟見試劑盒說(shuō)明書)；RT-PCR中反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈的步驟如下①配混合液1:總RNAg，DNAsel2u，10xDNAseIbufferlul，力QDEPC(焦碳酸二乙酯，RNA酶的強(qiáng)烈抑制劑)處理水(0.01%DEPC)到10u1,混勻后將混合液1在37。C放置20分鐘以除去DNA，②20分鐘后將混合液1置于7(TC水浴中溫浴10分鐘以去除DNAseI活性，然后置于冰上5分鐘，③向混合液1中加入1"1500ug/ml的oligo(dT)，④將冷卻的混合液1立即置于7(TC水浴中溫浴10分鐘，以徹底使RNA變性，然后置于冰上5分鐘，配混合液2:混合液110nl，5xfirststrandbuffer4ul，0.1MDTT2ul，10mMdNTPmixture1.5ul，DEPC處理水0.5tU,反轉(zhuǎn)錄酶2ul，混勻后將混合液2置于42'C水浴鍋內(nèi)溫浴1.5小時(shí)，⑥反應(yīng)結(jié)束后將混合液2置于9(TC干浴3分鐘，⑦-2(TC保存反應(yīng)最終產(chǎn)物，反應(yīng)中用到的試劑全部購(gòu)自Invitrogen公司；RT-PCR用到的體系為20U1，具體配法為cDNA第一鏈模板1u1,10xPCRbuffer2u1，lOmMdNTP1.6wl，2.5mMMg2+1.5ul，左、右引物各0.4ul，TAQ酶0.2ul，加水到20yl(所用到的PCRbuffer、dNTP、Mg2+、rTAQ酶等均購(gòu)自TAKARA公司)。PCR反應(yīng)條件如下①94。C2分鐘，②94'C1分鐘，③58'Cl分鐘，72'C2分鐘，⑤從②一④循環(huán)30次，72°C7分鐘，⑦4。C保存。PCR產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。RT-PCR用到的Os虹尸3基因的引物為PELP-F和PELP-R,Aft'"基因引物為Actin-F和Actin-R。弓I物序列見表4。結(jié)果顯示在這些花期提早的轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量都得到很大的提高，而在花期延遲的轉(zhuǎn)基因植株中OsS:P3的表達(dá)都得到極大的抑制，表明花期的變異表型是由目標(biāo)基因的超量表達(dá)和抑制表達(dá)引起的，表達(dá)分析結(jié)果如圖2所示。2)將轉(zhuǎn)基因植株的Tl代種子在含1/2000潮霉素的生根培養(yǎng)基中發(fā)芽，同時(shí)將野生型ZH11在無(wú)潮霉素的生根培養(yǎng)基中發(fā)芽，一周后，將長(zhǎng)出的幼苗選五銖移入盛土的面包盒中放入人工氣候箱(VersatileEnvironmentalTestChamberMLR-351H,SANYO)中培養(yǎng)，程序設(shè)定為光照9小時(shí)，溫度30。C;無(wú)光照15小時(shí)，溫度25'C，濕度恒定在70%。對(duì)植株進(jìn)行短日照處理并對(duì)各家系的開花時(shí)間進(jìn)行調(diào)査統(tǒng)計(jì)。調(diào)查結(jié)果顯示短日照條件會(huì)將Oaa,JRMi材料的延遲開花性狀恢復(fù)為正常，而超表達(dá)材料的開花時(shí)期相對(duì)于野生型依舊提前(參見表3，圖3B，C)。表3短日照條件下轉(zhuǎn)基因和野生型植株開花時(shí)間統(tǒng)計(jì)表ELP3轉(zhuǎn)基因材料植株數(shù)平均抽穗期標(biāo)準(zhǔn)偏差P值EU10569.2**1.483240.000309EU15568,8**0.836661.29E-05EU257410.740439WT573.80.83666ER16574.40.5477230.216547ER8572.80.836660.095452ER15574.80.836660.095452說(shuō)明(1)家系EU2，10和20均為本發(fā)明的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，其中EU2為表達(dá)量無(wú)升高的陰性對(duì)照；家系ER8，15和16均為本發(fā)明的RNAi轉(zhuǎn)基因植株，其中ER16為表達(dá)量無(wú)下降的陰性對(duì)照(2)每個(gè)家系選5株轉(zhuǎn)基因植株，用單因素方差分析的方法來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因家系和野生型開花時(shí)間的差異(<5%表示差異顯著(*);<1%表示差異極顯著(**))。實(shí)施例5檢測(cè)水稻內(nèi)源基因Os五Zjy的表達(dá)模式以水稻品種"中花ll"為材料，分別取樣于愈傷、根、芽、幼葉、劍葉、全苗和幼穗。按實(shí)施例4中的方法提取總RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物進(jìn)行半定量PCR檢測(cè)基因在植物各部位的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，tts漢尸J基因?yàn)榻M成型表達(dá)，在各部位中的表達(dá)量基本無(wú)差異(參見圖4A)。因轉(zhuǎn)基因材料開花時(shí)期發(fā)生變異，所以申請(qǐng)人研究了本基因在長(zhǎng)日照和短日照條件下在一天中的表達(dá)節(jié)律。方法如下按實(shí)施例4中的方法對(duì)野生型和轉(zhuǎn)基因材料Tl代種子發(fā)芽，一周后，將長(zhǎng)出的幼苗分為兩份移入盛土的面包盒中放入人工氣候箱(VersatileEnvironmentalTestChamberMLR-351H，SANYO)中培養(yǎng)，程序設(shè)定為光照15小時(shí)，溫度30'C;無(wú)光照9小時(shí)，溫度25'C，濕度恒定在70L長(zhǎng)日照條件培養(yǎng)三周后將一份材料移入短日照條件，程序設(shè)定同實(shí)施例4。另一份仍放在長(zhǎng)日照條件下。再處理兩周后取樣。每份材料同時(shí)取，隔4小時(shí)取一次樣，共取48小時(shí)。將樣品提取總RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物進(jìn)行定量PCR，其反應(yīng)的體系為25jil，其中含有反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、0.25pM的左右引物和12.5jal的SYBRGreen混合物(Takara)。反應(yīng)在7500real-time定量PCR儀(Takara)上進(jìn)行，反應(yīng)程序按照Takara公司提供的操作手冊(cè)進(jìn)行，水稻ac""7基因(Xueetal.，NaturalvariationinG/z<i7isanimportantregulatorofheadingdateandyieldpotentialinrice.AtoGewe，2008，40:761-7)作為反應(yīng)中的內(nèi)參。反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣設(shè)置三個(gè)重復(fù)，以表達(dá)量進(jìn)行平衡化處理。結(jié)果表明，本發(fā)明克隆的基因在長(zhǎng)日照下表達(dá)恒定；而在短日照下呈現(xiàn)明顯的節(jié)律現(xiàn)象隨著光的誘導(dǎo)表達(dá)量上升，在光消失后3小時(shí)達(dá)到頂峰，隨后下降，到光產(chǎn)生后半小時(shí)達(dá)到最低(結(jié)果如圖4B所示)。定量PCR用到的fls漢"弓I物見表4.實(shí)施例6轉(zhuǎn)基因植株中與開花時(shí)期相關(guān)基因的表達(dá)分析取實(shí)施例5中的RT產(chǎn)物，依據(jù)實(shí)施例所述的5方法檢測(cè)水稻中的開花基因說(shuō)(勤、WW和GsC/(Xueetal.,NaturalvariationinGfei7isanimportantregulatorofheadingdateandyieldpotentialinrice.7V(3fGe"W,2008，40:761-7)在長(zhǎng)、短日照下Oy^EXPJ超量和抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株和野生型中的表達(dá)量。PCR所用到的各基因的引物如表4所示。結(jié)果表明，ft/A在短日照下的轉(zhuǎn)基因OsE丄尸3超表達(dá)材料中表達(dá)量高于野生型中的表達(dá)量，而在RNAi材料中表達(dá)量低于野生型中的表達(dá)量。^^在長(zhǎng)日照白天下的aw丄尸j超表達(dá)材料中表達(dá)量低于野生型中的表達(dá)量，而在RNAi材料中表達(dá)量高于野生型中的表達(dá)量；在夜晚及短日照下沒有特別大的差別。在長(zhǎng)短日照下，相對(duì)于野生型，在超表達(dá)材料中表達(dá)量低而在KNAi材料中表達(dá)量高。由此可知，a^丄尸3可能就是通過抑制^//和OstfJ基因的表達(dá)，從而促使WJa表達(dá)升高來(lái)影響水稻開花時(shí)間。結(jié)果見圖5。實(shí)施例7基因的蛋白功能檢測(cè)為了確定ELP3蛋白在組蛋白修飾上的作用，申請(qǐng)人通過提取aw丄P5轉(zhuǎn)基因和野生型的組蛋白，做WesternBlot實(shí)驗(yàn)并利用組蛋白修飾類的商業(yè)化抗體對(duì)ELP3蛋白功能做了一系列研究(方法參照Huangetal.,Down-regulationofaS'7e"f/"，附Wo"/fegwtoor2-relatedgene,OsS777，inducesDNAfragmentationandcelldeathinrice.P/a"http://%w'o/，2007,144:1508-1519.)。具體操作為分別取播種后40天左右的野生型和轉(zhuǎn)基因的葉片4-5片，液氮研磨后放入3倍體積的組蛋白抽提緩沖液(lOmMTris-HCl,pH7.5;2mMEDTA;0.25MHC1;5mM2-mercaptoethanol;0.2mMPMSF)中充分混勻，經(jīng)12000g，4'C離心10分鐘后，吸取上清于另一新離心管，按體積加入三氯乙酸至終濃度為25%，17000g，4'C離心30分鐘，棄上清，沉淀用丙酮洗滌三次，晾干后溶解于上樣緩沖液(62.5mMTris-HC1,pH6.8;2%SDS;25%glycerol;0.01%BroraophenolBlue;10%fi-mercaptoethanol)中，經(jīng)濃度為15%的SDS-PAGE電泳可檢測(cè)抽提效果，電泳采用Bio-Rad公司的Mini-PR0TEAN3電泳槽系統(tǒng)，按照其說(shuō)明書進(jìn)行操作。將提取好的組蛋白進(jìn)行western檢測(cè)，westernblot轉(zhuǎn)膜使用Bio-Rad公司的MiniTrans-BlotCell轉(zhuǎn)印槽系統(tǒng)，按照其說(shuō)明書，將組蛋白轉(zhuǎn)至Amersham公司的Hybond-PPVDF膜上，用配好的含2%(質(zhì)量體積比)小牛血清蛋白(BSA)的PBS緩沖液(NaCl137mmol/L，KC12.7mmol/L，Na2HP044.3mmol/L，KH2P041.4mmol/L，pH7.5)對(duì)膜封閉兩小時(shí)以上，然后以1:10000加入不同的抗體室溫孵育兩小時(shí)左右。所用抗體為Upstate公司購(gòu)買的抗H3K9ace(07-352)以及Abcara公司購(gòu)買的抗H3(abl791)抗體(括號(hào)內(nèi)為貨號(hào))。倒掉一抗后，用PBS緩沖液洗膜三次，每次15分鐘，再加入按體積比為1:10000稀釋的服P標(biāo)記的羊抗兔二抗(購(gòu)自SouthernBiotech公司)，室溫孵育1-2小時(shí)，然后用PBS洗膜三次，每次15分鐘，使用S叩erSingnalPico(購(gòu)自Pierce公司)試劑盒按說(shuō)明書操作方法進(jìn)行X光片顯影，經(jīng)掃描儀掃描X光片后分析結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ELP3蛋白具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的功能，是一種組蛋白乙?；?，主要作用在H3K9位點(diǎn)上。表4本發(fā)明的實(shí)施例所用到的引物對(duì)序列基因引物名稱引物序列o風(fēng)wFLELP-FGGGGGTACCCCAAAACCCTTTCCACCGATGFLELP-RGGGGGATCCCTGCTGGAHTACAAGCATCCATELPRNAi-FGGGACTAGTGGTACCTGGGTGGAACTTTCATGTCAELPRNAi-RGGGGAGCTCGGATCCCGACCACCTTAAAACCAGCAPELP陽(yáng)FAGGCTTGAAGTGCCGAGATGTPELP-RGACCAGACATTTGACCATGTAARea正LP-FGCTCTTCTTCCAGCCAACGARealELP-RGGAAGTAGCTCTCGCCCATCTHn-FAGAAGAAGATGTTGGCGACCTHn-RGTCCTGCGGGTAAATAGCTGActin-FTATGGTCAAGGCTGGGTTCGActin-RCCATGCTCGATGGGGTACTTRealActin-FTGTATGCCAGTGGTCGTACCARealActin-RCCAGCAAGGTCGAGACGAA湖flHd3a誦FGCTCACTATCATCATCCAGCATGHd3a-RCCTTGCTCAGCTATTTAATTGCATAA股/腿-FTCAGCAACAGCATATCTTTCTCATCA腿-RTCTGGAATTTGGCATATCTATCACCGI-FTGGAGAAAGGTTGTGGATGCGI-RGATAGACGGCACTTCAGCAGAT說(shuō)明以上引物均為上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成?！?10〉華中農(nóng)業(yè)大學(xué)〈120〉組蛋白乙?；富騠l^U^作為調(diào)控水稻開花期的應(yīng)用<130〉〈141>2008-12-18<160>2<170>Patentlnversion3.1<210〉1<211〉1722〈212>DNA<213>水稻(0ryzasativa)<220><221>gene<222>(1)..(1722)〈223〉〈220〉〈221〉CDS〈222〉(1)..(1722)〈223〉<400>1atggccaccgccgtagccgccgccggcggtggcggcggcggcgagcag48MetAlaThrAlaValAlaAlaAlaGlyGlyGlyGlyGlyGlyGluGin151015ccgcgcagg鄉(xiāng)aagccggcgccggggagagggggagtggtgetcccc96ProArgArgArgLysProAlaProGlyArgGlyGlyValValLeuPro202530gcggggctgtcggaggaggaggcgegggtgegggccategcggagertc144AlaGlyLeuSerGluGluGluAlaArgValArgAlalieAlaGlulie354045gtgtcggcgatgggggagetctcgeggcgaggggaggacgtggacctg192ValSerAlaMetGlyGluLeuSerArgArgGlyGluAspValAspLeu505560纖gcgetcaagtcggccgcgtgceggaggtacgggctggcgegggcg240AsnAlaLeuLysSerAlaAlaCysArgArgTyrGlyLeuAlaArgAla65707580ccgaagctggtggagatgategcggcggtgccggaggccgaccgcgcc288ProLysLeuValGluMetlieAlaAlaValProGluAlaAspArgAla859095gcgctgetccca鄉(xiāng)ctgcgcgccaagcccgtgcgcacggcgtcgggc336AlaLeuLeuProArgLeuArgAlaLysProValArgThrAlaSerGly100105110attgccgtggtcgccgtgatgtcgaagccgcaceggtgcccccacate384lieAlaValValAlaValMetSerLysProHisArgCysProHislie115120125gccaccacgggg肌catetgcgtgtactgccccggetggccccgactec432AlaThrThrGlyAsnlieCysValTyrCysProGlyGlyProAspSer130135140gacttcgagtacageacccagtectacaccggctacgagcccaccage480AspPheGluTyrSerThrGinSerTyrThrGlyTyrGluProThrSer145150155160atgcgcgccattcgagcaaggtacaatccatatgtgcaggccagaage528MetArgAlalieArgAlaArgTyrAsnProTyrValGinAlaArgSer165170175aggatagatcagetcaaaaggetaggccatagtgtagacaaggtcgaa576ArglieAspGinLeuLysArgLeuGlyHisSerValAspLysValGlu180185190ttcatattgatgggtggaactttcatgteattaccagetgattategg624PhelieLeuMetGlyGlyThrPheMetSerLeuProAlaAspTyrArg195200205gattatttcattagaaatcttcatgatgccttatcgggacacacttct672AspTyrPhelieArgAsnLeuHisAspAlaLeuSerGlyHisThrSer210215220getaatgttgasgagjgetgtttgttatteagaacatggtgcagtcaaa720AlaAsnValGluGluAlaValCysTyrSerGluHisGlyAlaValLys225230235240tgtattggcatgacaattgagacgagacctgattattgct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mePCR分析步驟(5)的轉(zhuǎn)基因植株中目標(biāo)基因的表達(dá)；(8)借助WesternBlot分析轉(zhuǎn)基因植株組蛋白修飾情況。全文摘要本發(fā)明屬于植物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及一種水稻組蛋白乙?；富蚣捌渚幋a蛋白功能與應(yīng)用。本發(fā)明公開一種水稻組蛋白乙酰化酶基因OsELP3，該基因與植物的花期有關(guān)。在長(zhǎng)日照下，超表達(dá)此基因可導(dǎo)致水稻開花提早，而抑制該基因表達(dá)可導(dǎo)致水稻開花延遲。短日照處理后，抑制材料的突變表型恢復(fù)為野生型。分析發(fā)現(xiàn)OsELP3基因會(huì)影響Hd3a、Hd1和OsGI三個(gè)開花基因的表達(dá)水平，且其自身表達(dá)在短日照下呈現(xiàn)節(jié)律變化。WesternBlot實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)此基因具有組蛋白乙酰化功能，位點(diǎn)作用于H3K9上。文檔編號(hào)A01H5/00GK101434963SQ200810236959公開日2009年5月20日申請(qǐng)日期2008年12月23日優(yōu)先權(quán)日2008年12月23日發(fā)明者周道繡,晨李申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)