專利名稱：：一種新型生物固氮酶制劑(hse制劑)的制作方法一種新型生物固氮酶制劑(HSE制劑)新型生物固氮酶制劑(HSE制劑)是通過(guò)分離于土壤的有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的微生物發(fā)酵制成的一種生物酶制劑。HSE制劑對(duì)氧、氨等穩(wěn)定能催化空氣中的氮?dú)夂退磻?yīng)生成氨水。HSE制劑是一種極具挑戰(zhàn)意義的生物試劑，無(wú)論在實(shí)際應(yīng)用還是理論研究都有非常的價(jià)值。一、所屬領(lǐng)域本發(fā)明屬于一種常溫常壓下，將空氣中的氮?dú)夤潭ㄏ聛?lái)的生物固氮酶制劑(HSE制劑)。二
背景技術(shù)：
：生物固氮是生命科學(xué)中的重大基礎(chǔ)研究課題之一，國(guó)內(nèi)外生物固氮研究已進(jìn)入一個(gè)新階段，其特點(diǎn)是學(xué)科交叉，將基礎(chǔ)研究和應(yīng)用前景相結(jié)合。為了對(duì)這一重大課題有所突破和模擬生物固氮應(yīng)用，當(dāng)前生物固氮研究正在分子和原子水平上展開(kāi)1]。人們已探明傳統(tǒng)意義上的固氮酶對(duì)氧、氨等特別不穩(wěn)定極易失活，生物固氮機(jī)理進(jìn)一步的闡明和應(yīng)用是人類夢(mèng)寐以求的事情。1909年德國(guó)化學(xué)家HaberFritz發(fā)明了以Fe304為主要催化劑，在高溫高壓條件下，使氮?dú)夂蜌錃夥磻?yīng)，合成氨的方法。Fe304-Al203-K20Cat.N2+3H2~34n232-2NH3z2500。C300atm3近百年來(lái)，這一被稱為20世紀(jì)最大的發(fā)明，為造福人類做出了偉大的貢獻(xiàn)，但其不僅是一個(gè)高投入，低產(chǎn)出的過(guò)程，而且也給人類賴以生存的環(huán)境帶來(lái)了相當(dāng)?shù)呢?fù)面影響。盡管如此，人類還是不得而為之。因此，更加溫和的條件下，將化學(xué)性質(zhì)非常不活潑的氮?dú)夥肿愚D(zhuǎn)變成氨的反應(yīng)研究是關(guān)系到環(huán)境和能源的重要工作。氮元素是核酸，氨基酸，蛋白質(zhì)等的重要組成部分，是維持生命活動(dòng)必要的元素，同時(shí)是營(yíng)造現(xiàn)代文明生活必要的塑料，纖維，醫(yī)藥品，化工原料等不可缺少的重要元素之一，然而，大氣中豐富的氮?dú)馐呛泻艽蟮模?N^N"三鍵結(jié)合能量(946KJ/MEL)，顯示出其非常難于反應(yīng)的特性，因而，在常溫常壓條件下，使其轉(zhuǎn)變?yōu)榈幕衔锊⒉皇且患菀椎氖虑?。另一方面，固氮菌所產(chǎn)生的固氮酶在常溫常壓下，就能將空氣中的氮固定下來(lái)，從整個(gè)地球規(guī)模來(lái)看每年固氮的總量工業(yè)方法的固氮只占到總量的不到20%，剩余的80%大部分是微生物所為"。作為人類重要的能源煤碳、石油等越來(lái)越少的現(xiàn)實(shí)，已為世界所關(guān)注，而且世界人口的快速增長(zhǎng)，對(duì)肥料的需求量也越來(lái)越多。對(duì)反應(yīng)性非常低的氮?dú)?，如果能借助或者摸仿生物固氮酶，在常溫常壓下使其發(fā)生反應(yīng)，將是一項(xiàng)具有重要意義的課題，因此、化學(xué)模擬生物固氮已經(jīng)成為人類夢(mèng)寐以求的事情。人們?yōu)榱死霉痰⑸锖徒沂?認(rèn)識(shí))固氮酶的催化機(jī)理，對(duì)固氮微生物源進(jìn)行了廣泛的研究。從厭氧微生物到好氧微生物，從共生微生物到自由微生物，已發(fā)現(xiàn)了30余類2)(表l-l)表l-l固氮微生物種屬表2)屬代表性種絕對(duì)厭氧性菌一般厭氧性菌M^av，*，Mraseo-aW,微耗氧性菌好氧性菌/w^/ca承/jB^/Zwm/n/y承光合成細(xì)菌(厭氧性菌)光合成細(xì)菌(一般厭氧性菌)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>在根瘤中固氮酶存在于類菌體中。而根瘤的特殊結(jié)構(gòu)和生理環(huán)境，不但保護(hù)了固氮酶而且還提供了合適的固氮條件,其中豆血紅蛋白起著重要的輸氧作用。固氮酶對(duì)冷敏感，一般在0。C左右易失活。其中鐵蛋白對(duì)冷最敏感，但不同固氮生物之間存在差異。然而，所有的固氮酶在-2001:下都是穩(wěn)定的，故純化的固氮酶均可保存在液氮中19)。在自然條件下，N2和質(zhì)子是固氮酶的底物。固氮酶每還原一分子N2就要釋放一分子H2。當(dāng)沒(méi)有任何其它底物時(shí),固氮酶的全部電子都用于氫離子的還原而釋放氫。固氮酶的放氫也需要腺苷三磷酸(ATP)，這則區(qū)別于氫酶22)。除上述天然底物外，固氮酶是生物中分離出來(lái)的唯一能還原三鍵化合物的酶。其底物多數(shù)是具有三鍵或潛在三鍵的分子，如H-S-C三N、CH2-N^C-S，NOC=N，CHfCH-N-C，以及最近剛得到證明的氧硫化碳(COS)和C02也是固氮酶的底物，然而其類似物CS2則是抑制劑，在底物中弓l起人們廣泛應(yīng)用的是乙炔，因乙炔還原被人們用來(lái)作為測(cè)定固氮酶活性的簡(jiǎn)便而靈敏的方法。固氮酶的腺苷三磷酸和還原劑24)。固氮生物能將空氣中的氮還原成氨，是因其體內(nèi)存在生物催化劑固氮酶。生物固氮也是一個(gè)耗能的反應(yīng),為了還原上述底物，則需要有ATP和還原劑(電子)。在完整固氮有機(jī)體中一般ATP與MgZ+是以l:l的復(fù)合物形式存在，大量實(shí)驗(yàn)表明固氮酶每提供一個(gè)電子給N2需要水解2個(gè)分子的ATP(生成產(chǎn)物ADP和無(wú)機(jī)磷)，即ATP/et匕為2。因此,固氮酶催化N2還原的反應(yīng)式可寫(xiě)作N2+8FT+8e-+腹gATP—2NH3+H2+16MgAD+16Pi。方程式中ATP:腺苷三磷酸，是由呼吸、厭氧呼吸、發(fā)酵、或光合作用所提供的；ADP:腺苷二磷酸；Pi:無(wú)機(jī)磷酸鹽。固氮酶催化作用機(jī)理。固氮酶作用機(jī)理包括電子的傳遞、底物的絡(luò)合和還原兩部分。通過(guò)固氮酶系統(tǒng)的電子流，由鐵蛋白進(jìn)入，而以被還原了的底物形式由鉬鐵蛋白放出。從固氮酶兩組分蛋白結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果推測(cè)，固氮酶系統(tǒng)內(nèi)電子傳遞的順序是Fe蛋白—MoFe蛋白的P;;簇對(duì)—FeMo2co—底物MgATP的水解是與電子傳遞的第一步偶聯(lián)，而當(dāng)?shù)孜锱cFeMo2co絡(luò)合時(shí),電子和質(zhì)子傳遞給底動(dòng)力學(xué)研究也表明，鐵蛋白一次傳遞一個(gè)電子給鉬鐵蛋白,這種一個(gè)電子傳遞過(guò)程又包含著鐵蛋白和鉬鐵蛋白之間偶聯(lián)和解偶聯(lián)的循環(huán)過(guò)程,而解偶聯(lián)也是決定酶促反應(yīng)速率的限制步驟26)。目前，世界h從事化學(xué)模擬生物固氮的研究大體上講有三個(gè)方面，一是模擬固氮酶的構(gòu)造，通過(guò)化學(xué)方法合成類似的催化劑"；二是尋找新的固氮微生物或誘變出新的具有特別固氮能力的微生物；三是做基因修飾或克隆出超常規(guī)的固氮微生物或者植物。到目前為止，真正大規(guī)模能應(yīng)用于產(chǎn)業(yè)中的還未浮出水面。不論那方面的研究，對(duì)固氮酶構(gòu)造的深層認(rèn)識(shí)是非常必要的。我們國(guó)家也早在1978年就有研究者分離和提純出了鐵鉬蛋白質(zhì)結(jié)晶，為人類進(jìn)一步認(rèn)識(shí)固氮酶做出了很大的貢獻(xiàn)。
發(fā)明內(nèi)容名稱一種新型生物固氮酶制劑(HSE制劑)。HSE制劑能在常溫常壓下，將空氣中的氮?dú)夤潭ㄏ聛?lái)生成氨水。新型生物固氮酶制劑(HSE制劑)是通過(guò)分離于土壤的微生物發(fā)酵制成的一種生物酶制劑。功能HSE制劑對(duì)氧、氨等穩(wěn)定能很容易地將空氣中的氮?dú)夤潭ㄞD(zhuǎn)化為氨水，氨水平衡濃度可高達(dá)6mM以上；最適條件下，120小時(shí)內(nèi)含酶菌體濕重0.1克約能生產(chǎn)0.23mM的氨。在生物技術(shù)、基礎(chǔ)科學(xué)研究上有廣泛的應(yīng)用和研究前景。適用范圍空氣中的氮?dú)饣蚣兊獨(dú)夂退磻?yīng)產(chǎn)氨的功能。內(nèi)容如下1999年(當(dāng)時(shí)在日本留學(xué))，我從土壤中分離出了一株新型固氮微生物(泡"o6actersu/Y7am97Y力-^;)。主要利用該微生物發(fā)酵生產(chǎn)的生物制劑(HSE制劑)具有催化空氣中的氮?dú)夂退磻?yīng)生成氨水的功能。具體方法是，通過(guò)量取由HSE制劑離心分離得到的濕重沉淀物0.1g作為同氮酶劑，然后加10ml蒸餾水，在空氣中反應(yīng)一定時(shí)間后進(jìn)行離心分離，上清液則為生產(chǎn)的氨水，沉淀則為下一次用的酶制劑---，如此，循環(huán)往復(fù)進(jìn)行氨水生產(chǎn)(附圖l，附圖2-4)。發(fā)現(xiàn)該生物制劑有產(chǎn)氨水的特別能力，且每次離心分離生產(chǎn)得到的氨水濃度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增大'4)15)16)。氨水濃度測(cè)試通過(guò)液相色譜(HPLC)完成(附圖1)。通過(guò)和已知固氮能力較強(qiáng)的Z加to6a"erKz'/7^朋Jj7標(biāo)準(zhǔn)株的固氮酶的比較研究，發(fā)現(xiàn)在相同條件下，這一新型生物固氮酶制劑是標(biāo)準(zhǔn)株固氮酶固氮能力的至少5倍，而且可重復(fù)使用，不易失活，其每次合成氨的濃度幾乎沒(méi)有什么變化(附圖2)。標(biāo)準(zhǔn)株固氮酶則很快失活，失去生產(chǎn)氨水能力。通過(guò)0.lg濕重沉淀酶劑(HSE制柳在各種濃度的(NH丄S04溶液中反應(yīng)，并對(duì)反應(yīng)后氨水的濃度進(jìn)行測(cè)試，得知氨對(duì)這一新型固氮酶的固氮能力影響不明顯，對(duì)氨穩(wěn)定。發(fā)現(xiàn)HSE制劑在水中氨的平衡濃度可高達(dá)6mM以上(附圖3)。相反，標(biāo)準(zhǔn)株化otofe"erw'"ci朋6W所產(chǎn)生的固氮酶在很短的時(shí)間內(nèi)即失活，不能被重復(fù)利用(附圖2,4)16)。在一個(gè)月時(shí)間里，O.l克濕重制劑，通過(guò)重復(fù)利用、失活修復(fù)能不斷地放出了氨水(附圖4)。7為了進(jìn)一步證實(shí)HSE制劑的固氮酶活性，也進(jìn)行了151^2的同位素生產(chǎn)氨水試驗(yàn)。證實(shí)了HSE制劑的固氮性能。四、HSE制劑構(gòu)成材料本ASE制劑是由酶蛋白、微生物、水、少量無(wú)機(jī)鹽等構(gòu)成；主要酶Fe蛋白和MoFe蛋白等構(gòu)成的固氮酶。構(gòu)成法微生物和鉬酸鹽，磷酸鹽，鐵鹽，鎂鹽，蔗糖等發(fā)酵而成的生物制劑。五具體實(shí)施例方式將HSE制劑直接撒入含有空氣或氮?dú)獾乃校琀SE制劑作為催化劑就可以將氮?dú)夤潭?、轉(zhuǎn)化成氨水。在溫度3(TC、pH7，有足夠的底物氮?dú)夂退磻?yīng)的條件下，120小時(shí)內(nèi)菌體濕重0.1克約能生產(chǎn)0.23raM的氨。具體實(shí)施圖示例證，附圖1-4.如下附圖1是O.l克濕重菌體分別在10ml水中生產(chǎn)氨水及其分析方法；附圖2是0.1克濕重菌體的新型固氮微生物^^'to6a"er^//Y7ams7Y力i.7和標(biāo)準(zhǔn)株^"ote"erw'/7e7朋o^'生產(chǎn)的固氮酶在不同溫度下的固氮能力的比較結(jié)果；附圖3是不同濃度的(朋4)2304溶液對(duì)新型固氮微生物泡/tote"er犯/Y7aras打力-W7生產(chǎn)的固氮酶固氮能力的影響結(jié)果；附圖4是0.1克濕重菌體的新型固氮微生物^//7aras7Y力-";7和標(biāo)準(zhǔn)株力zoto6acterw'"eJa"必i在一個(gè)月內(nèi)持續(xù)生產(chǎn)氨水的結(jié)果。參考資料1)西林仁昭"21世全擔(dān)》次世代o窒素固定法^開(kāi)発"化學(xué)t工業(yè)，第53巻第2號(hào)131-135(2000)Howard,丄B.Biochemistry.1994,63:2798-2808.2)JohnPostgante"NitrogenFixation"TheInstituteofBiology，sStudiesinBiologyno.92(1978)3)EditedbyAchimMullerandWilliamE.Newton"NitrogenFixation"(Thechemical-biochemical-GeneticInterface)PlenumPress.NewYorkandLondon(1983)李佳格，徐繼.生物固氮作用機(jī)理.ChineseBulletinofBotany.l997，14:1-13.4)EditedbyJchatt.GeneralL.MdaCamaraPinaandR.L.Richards"NewTrendsinthechemistryofNitrogenFixation"Academicpress(AsubsidiaryofHarcourtBraceJovanovich.Publisher)丄ondon.NewYork.Toronto.Sydney.SanFrancisco.(1980)5)W.D.P.stewart，A.Haystead,H.AV.Pearson"NitrogenaseActivityinHeterocgstsofBlue-GreenAlgae"NATUREVOL.224-226(1969).6)JongsunKim，D.woo，andD.C.Rees."X-raycrystalstructureoftheNitrogenaseMolybdemum-IronProteinfromClostridiumpasteurianumat3.0-AResolution"Biochemistry327104-7115(1993)7)JongsumKimandD.C.Rees"CrystallographicStructureandfunctionalimplicationofthenitrogenasemolybdenum-IronproteinfromAzotobactervinelandii"NATURE,vol360553(1992).8)MM.Georgiadis,H.Komiya.P.Chakrabarti,D.Woo，丄J.KornasD.C.Ress."CrystallographicStructureoftheNitrogenaseIronproteinfromAzotobactervinelandii"ScienceVoL.2571653(1992).9)MichaelK.chan，JongsunKim，D.C.Rees"TheNitrogenaseFeMo-cofactorandP-Clusterpair:2.2AresolutionStructures"ScienceVol260792(1993).10)KarlFisher,MichaelJ.Dilworth，Chul陽(yáng)HwanKim，andWilliamE.Newton"AzotobacterVinelandiiNitrogenasecontainingAlteredMoFeProteinWithsubstitutionsintheFeMo-CofectorEnvironment:EffectsonthecatalyzedReductionofAcetyleneandEthyere"Biochemisty392970-2779(2000).11)C.GSchipke，D.B.Goodin，D.E.McRee，andC.D.Stout"OxidizedandReducedAzotobacterVinelandiiFerredoxinIat1.4AResolutionconformationalchangeofsurfaceresidueswithoutsignificantchangeinthe[3Fe-4s]+/0Cluster"Biochemistry388228-8239(1999).12)JeannineM.chan，JasonChristiansen,DennisR.Dear，andLanceC.Seefeldt"SpectroscopicEvidenceforchangesintheRedoxStateoftheNinrogenaseP-ClusterduringTurnover"Biochemistry385779-5785(1999).13)今堀和友，上代淑人，西泰美，早石修，村地孝"日本生化學(xué)會(huì)編"生化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座，酵研究法(上下)化學(xué)同人(1985)14)WeiHao"NitrogenFixationandAmmoniaProductionbyNi加genase"ThesisofGraduateSchoolofToyamaUniversity(Japan)卜47(2000);BulletinofFacultyofEngineeringToyamaUniversity5381(2002)15)郝煒'坂野公紀(jì)'井上正美"窒素固定菌o7>*二7生産能c，l、t"平成12年度日本化學(xué)研究発表會(huì)第49回(2000).16)WeiHao"SyntheseandReactivitiesofsomeSpecificSNCompoundsandApplicationS-alkoxy-入6-SulfanenitrilesasAlkylatingReagents"DoctoralDissertationofGraduateSchoolofToyamaUniversity(Japan)1-111(2004).17)邊少敏.棕色固氮菌變株DJ中鉬鐵蛋白和HBP59蛋白的研究一純化、特性及晶體生長(zhǎng).中國(guó)科學(xué)院研究生院博士研究生學(xué)位論文.2005:1-4.18)Shah，V.K，etal.ProcNatlAcad.Sci.USA.1999,74:3249-3253.19)Evans,H.J.etc.BiologicalNitrogenFixation.ChapmanandHall.NewYork.1997:1-42.20)JohnPostgate.NitrogenFixation.TheinstituteofBiology'sStudiesinBiology.1978(92):45-50.21)李佳格，徐繼.生物固氮作用機(jī)理.ChineseBulletinofBotany.l997，14:卜13.22)PapasaniV.Subbaiah,PeterHorvathetal.RegulationoftheActivityandFattyAcidSpecificityofLecithin-CholesterolAcyltransferasebySphingomyelinandItsMetabolites,CeramideandCeramidePhosphate.Biochemistry.2006,45:5029-5038.23)尤崇杓.生物固氮.北京科學(xué)出版社.1987:71-80.24)Seefeldt，L.C.etal.Biochemistry.1995,34:5382-5389.25)Burgess,B.K.Molybdenum.Enzyme.Wiley-Interscience.1985:161-219.26)Ress,D.C.et.al.BiologicalChemistiy.1999,269:2876-28083.權(quán)利要求1.一種新型生物固氮酶制劑(HSE制劑)是利用分離于土壤的有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的微生物(HaitobactersufflavusTih-w37)、磷酸鹽、鐵鹽、鉬酸鹽等發(fā)酵產(chǎn)出的生物固氮酶制劑。其固氮方法是在一定溫度、pH值下，將HSE制劑直接撒入溶有空氣或氮?dú)獾乃?，就可以將難于固定的氮?dú)廪D(zhuǎn)化成氨水。其特征是利用微生物在培養(yǎng)基中發(fā)酵制成的HSE制劑，具有催化氮?dú)夂退磻?yīng)生成氨的功能。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新型生物固氮酶制劑(HSE制劑)，其特征是利用微生物(泡itote"ar卯/Harasr勸等在培養(yǎng)基中發(fā)酵制成的HSE制劑，在溫度(MOt:，pH值是4.5-8.5條件下，催化氮?dú)夂退磻?yīng)生成氨的生物方法。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種新型生物固氮酶制劑(HSE制劑)，其特征是HSE制劑在合適條件下發(fā)揮固氮活性時(shí)，所生成的產(chǎn)物是本公司的資源。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新型生物固氮酶制劑(HSE制劑)，其特征在于HSE制劑是微生物(泡i'totecter幼f/7awys77力-fr幼、磷酸鹽、鐵鹽、鉬酸鹽等發(fā)酵產(chǎn)出的由微生物、酶等組成的生物材料。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新型生物固氮酶制劑(HSE制劑)，其特征在于HSE帶J劑和作為固氮生物酶劑使用是對(duì)等關(guān)系，HSE制劑其它用途的開(kāi)發(fā)利用是本公司資源。全文摘要本發(fā)明涉及利用一種分離于土壤的有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的微生物(HaitobactersufflavusTih-w37)等發(fā)酵產(chǎn)出的一種新型生物固氮酶制劑(HSE制劑)能固定空氣中的氮?dú)饣虻獨(dú)鉃榘钡纳镌噭Ｆ浞椒ㄊ窃谝欢囟?、pH值下，將HSE制劑直接撒入溶有空氣或氮?dú)獾乃?，就可以將難于固定的氮?dú)廪D(zhuǎn)化成氨水，氨水平衡濃度可高達(dá)6mM以上；最適條件下，120小時(shí)內(nèi)菌體濕重0.1克約能生產(chǎn)0.23mM的氨。其特征是利用微生物在培養(yǎng)基中發(fā)酵制成的HSE制劑，對(duì)氧、氨等穩(wěn)定具有催化氮?dú)夂退磻?yīng)生成氨的功能。文檔編號(hào)C05F11/08GK101407436SQ200810033748公開(kāi)日2009年4月15日申請(qǐng)日期2008年2月21日優(yōu)先權(quán)日2008年2月21日發(fā)明者煒郝,郝陽(yáng)帆申請(qǐng)人:上海居知園生物技術(shù)有限公司