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一種彩色馬蹄蓮種質資源離體保存方法

文檔序號:386386閱讀:494來源:國知局
專利名稱:一種彩色馬蹄蓮種質資源離體保存方法
技術領域
本發(fā)明涉及植物種質資源保存及組織培養(yǎng)技術領域,尤其涉及一種彩色馬 蹄蓮種質資源離體保存的方法。
背景技術
彩色馬蹄蓮(Z朋^o^c力^ A^Wofe)系天南星科(Isceae)馬蹄蓮屬 (Za/7"&sc力j^)多年生單子葉草本球根花卉,其形態(tài)高雅、色彩艷麗,在歐洲 國家一直是切花中的佼佼者,盆花栽培也是一大消費渠道。近幾年來也逐漸受 到我國消費者的喜愛,種植面積正不斷擴大。生產上彩色馬蹄蓮多為一年生栽 培,通過球莖進行無性繁殖。彩色馬蹄蓮種質資源的繁殖和保存也主要依靠球 莖為繁殖材料每年進行田間種植,這需要消耗人量的人力、物力和財力,而且 彩色馬蹄蓮球莖本身很容易感染細菌性軟腐病,通過多年的無性繁殖后很容易 造成細菌、病毒等病蟲害蔓延,造成資源損失,給種質資源的利用和保存帶來 難題。
當前,植物種質資源的保存方法主要有田間生長保存,離體低溫保存、超 低溫保存,組織培養(yǎng)保存等方法。其中,常規(guī)田間種植保存中,存在因季節(jié)變 換、病蟲害等自然災害的侵襲而造成工作量大和種質資源容易丟失;而超低溫 保存需要嚴格的保存條件,風險較大。植物離體保存因不受外界環(huán)境條件的影 響,具有田間生長保存無法比擬的優(yōu)點。對植物進行離體保存技術已多有報導, 如專利申請?zhí)枮镃N200710019345和CN200710019346分別報導了通過減少培養(yǎng)基 中大量元素和添加脫落酸進行菊花離體保存的方法,發(fā)明名稱為"茅蒼術組培 繁殖的種質保存方法",發(fā)明名稱為"一種營養(yǎng)繁殖花卉石蒜的超低溫保存方
法",等分別通過常溫抑制生長,普通組織培養(yǎng)方式或超低溫方式對植物進行 了離體保存。但簡單的運用以上保存方法并不適用于彩色馬蹄蓮,首先,彩色 馬蹄蓮球莖本身很容易攜帶歐文氏菌(可導致細菌性軟腐病),尤其通常以帶 芽眼的切塊為外植體,在快繁過程中隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加,此內生菌也大量繁 殖蔓延,導致組培快繁無法繼續(xù);其次,該歐文氏菌系內生菌,若以常規(guī)的升 汞表面消毒則達不到理想的防治效果,這對彩色馬蹄蓮的長期離體保存也是一 個瓶莖問題;再次,在常規(guī)組培保存中必需對彩色馬蹄蓮種質資源進行頻繁的 繼代培養(yǎng)(約每月繼代一次)才能較好地保持其種性;此外,彩色馬蹄蓮球莖 除攜帶歐文氏菌外,也往往攜帶有大量病毒,這在組培與離體保存中也是必須 考慮的問題。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是,針對以往彩色馬蹄蓮常規(guī)組培離體保存中, 一方面以種球 帶芽眼切塊為外植體和常規(guī)的表面消毒,對球莖本身所攜帶的內生菌種一歐文 氏菌,難以達到好的滅菌、脫菌的效果,另一方面在常規(guī)保存培養(yǎng)條件下需頻 繁繼代培養(yǎng)所帶來的大工作量等缺陷;提出一種成本低廉,操作簡便,滅菌效 果較好,保存期長達一年以上不需要頻繁繼代培養(yǎng)而仍能保持優(yōu)良種性的彩色 馬蹄蓮種質資源離體保存方法。
本發(fā)明目的通過以下技術方案來實現(xiàn)
一種彩色馬蹄蓮種質資源離體保存方法,按如下步驟進行
(1)培養(yǎng)基的配制各階段培養(yǎng)基組分和各組分在每升培養(yǎng)基內所含重量為 A)基本培養(yǎng)基其中,誘導、增殖培養(yǎng)基以蔗糖30g/L ,瓊脂7g/L的MS 為基本培養(yǎng)基;生根培養(yǎng)基以蔗糖30g/L ,瓊脂7g/L的1/2MS為基本培養(yǎng)基; 試管球莖膨大培養(yǎng)基以蔗糖40 50g/L ,瓊脂6g/L的MS為基本培養(yǎng)基;種質
保存培養(yǎng)基以蔗糖20g/L ,瓊脂8g/L的1/2MS為基本培養(yǎng)基;pH均為5. 6
5.8;
B) 誘導培養(yǎng)基Ml: MS+6-BA1. 0-2. Omg/L+IBAO. 3-0. 5mg/L+青霉素50mg/L;
C) 增殖培養(yǎng)基M2: MS+6-BAO, 5-1. Omg/L+IBAO. 1-0. 5mg/L+青霉素100mg/L;
D) 生根培養(yǎng)基M3: 1/2MS+6-BAO. 2-0. 4mg/L+NAA0. 5mg/L+Aclg/L;
E) 球莖膨大培養(yǎng)基M4: MS+6-BA1. 0-3. Omg/L+NAAO. 5mg/L+Aclg/L;
F) 種質保存培養(yǎng)基M5: 1/2MS+6-BA0. 1-0. 3mg/L+NAA0. 1-0. 4mg/L +甘露醇 15. 0-20. Og/L+青霉素100mg/L;
(2) 外植體消毒、接種及誘導培養(yǎng)選取彩色馬蹄蓮健康、飽滿母球,用自 來水刷洗掉母球上泥土及最外層褐色表皮,沖洗約20分鐘后,用解剖刀切取母 球上lcm3的塊莖芽眼,經自來水沖洗干凈后,于超凈操作臺上用75%酒精浸泡 0.5分鐘,無菌水沖洗3次,0. P/oHgCl2水溶液常規(guī)滅菌12min,無菌水沖洗3 5次,剝取0. 5mm以下莖尖分生組織,接種于誘導培養(yǎng)基M1中,于22_26QC,光 強2000-3000Lx,光照12h/d條件下培養(yǎng)一個月;或選取彩色馬蹄蓮組培生產過 程中無內生菌污染且生長健康的植株,剝取0.5mm以下莖尖分生組織為誘導、 增殖對象;
(3) 增殖培養(yǎng)將步驟(2)已成活且無污染的叢生芽轉接到增殖培養(yǎng)基M2 中,于22-26°C,光強2000-3000Lx,光照12h/d條件下培養(yǎng)一個月;繼代周期為 一個月,將塊狀芽叢剪成小塊進行擴繁;
(4) 生根培養(yǎng)挑選步驟(3)中健壯叢狀小植株剪成單株轉接到生根培養(yǎng) 基M3中,于22-26。C,光強2000-3000Lx,光照12h/d條件下培養(yǎng)一個月,長成 4-6條白色長根的小苗;
(5) 球莖膨大培養(yǎng)挑選步驟(4)中根與莖葉皆健壯植株轉接到球莖膨大
培養(yǎng)基M4中進行試管養(yǎng)球,在22-25°C,光照12-16h/d,光強2000-3000Lx下 培養(yǎng)約一個月時間;
(6) 種質保存培養(yǎng)挑選歩驟(5)小子球飽滿的植株轉接到種質保存培養(yǎng) 基M5中,在10-15",光照10h/d,光強IOOO Lx環(huán)境下保存,保存期長達15 個月以上;
(7) 恢復培養(yǎng)將步驟(6)保存培養(yǎng)一年以上已進入半休眠狀態(tài)的小子球 植株,先轉移到同步驟(2)培養(yǎng)條件下恢復培養(yǎng)一個月,再轉接到新鮮的誘導 培養(yǎng)基M1中進行二代或二代以上的組培繁殖;
(8) 遺傳穩(wěn)定性檢測與利用觀察并挑選步驟(7)組培繁殖的小子球生長、 增殖狀況正常,長勢旺盛,增殖率為3. 8-4. 2,經可溶性蛋白和過氧化物酶(POD) 檢測未發(fā)生遺傳變異的植株;該植株或按步驟(3)至(6)進行種質資源離體 再保存;或按步驟(3)至(5)用于種苗擴繁生產。
所述的1/2MS基本培養(yǎng)基為大量元素減半的Murashige-Skoog (MS)培養(yǎng)基。
本發(fā)明的有益效果是
一、 本發(fā)明采用0.5mm以下彩色馬蹄蓮莖尖分生組織為外植體,并在誘導、 增殖及保存培養(yǎng)基中分別添加了 50mg/L與100mg/L的青霉素以獲得培養(yǎng)材料, 有效地克服了內生菌造成的污染問題,同時,通過莖尖脫毒種球內的病毒也得 到了較好的控制;而通常以帶芽眼切塊為外植體且在培養(yǎng)基中不添加青霉素的 培養(yǎng)方式中,經過4-5代增殖培養(yǎng)后會開始出現(xiàn)內生菌的污染現(xiàn)象,以此種材料 為保存對象,很可能造成保存的失敗。
二、 本發(fā)明通過在保存培養(yǎng)基中添加了 10.0 20.0g/L甘露醇,將大量無 機鹽成分減半,并輔以較低溫度、低光照的生長環(huán)境(10-15°C,光照10h/d,
光強1000 Lx),抑制了保存材料的生長,達到長期保存目的,比在普通MS培 養(yǎng)基中保存期延長6-8個月,不需頻繁繼代,可在有限的空間內保存更多的種質 資源,并減輕了工作量。
三、本發(fā)明保存的小球莖苗經恢復培養(yǎng)與繁殖后,既可用于再保存,也可 直接用于組培快速繁殖,后代生長正常,增殖第2代的增殖系數(shù)平均為3. 8-4. 2, 與正常球莖苗相當,亦無遺傳變異發(fā)生;這種保存方法相對于超低溫保存安全、 設備簡單、易操作,成本可降低50%以上。
具體實施例方式
通過以下實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明,但本發(fā)明的內容并不僅限 于此。
青霉素與甘露醇均為上?;瘜W試劑廠生產化學純; 實施例l:(彩色馬蹄蓮種質資源離體保存方法l) (1)培養(yǎng)基的配制 基本培養(yǎng)基
1) 誘導、增殖培養(yǎng)基以庶糖30g/L ,瓊脂7g/L的MS為基本培養(yǎng)基;
2) 生根培養(yǎng)基以蔗糖30g/L ,瓊脂7g/L的1/2MS為基本培養(yǎng)基;
3) 試管球莖膨大培養(yǎng)基以蔗糖40 50g/L ,瓊脂6g/L的MS為基本培養(yǎng)基;
4) 種質保存培養(yǎng)基以蔗糖20g/L ,瓊脂8g/L的1/2MS; 以上基本培養(yǎng)基pH均為5. 6 5. 8;
其中,1/2MS基本培養(yǎng)基為大量元素減半的Murashige-Skoog (MS)培養(yǎng)基; (2)外植體消毒、接種及誘導培養(yǎng)選取健康、飽滿彩色馬蹄蓮母球,用自 來水刷洗掉母球上泥土及最外層褐色表皮,經流水下沖洗約20分鐘后,用解剖刀切取母球上lcm3的塊莖芽眼,經自來水沖洗干凈后,于超凈操作臺上用75% 酒精浸泡0.5分鐘,無菌水沖洗3次,0. 1。/。的HgCl2水溶液常規(guī)滅菌12min,無 菌水沖洗3 5次,剝取0. 5mm以下莖尖分生組織,接種于莖尖誘導培養(yǎng)基Ml: MS+6-BA2. Omg/L+IBAO. 4mg/L+青霉素50mg/L中,于26°C,光強2500Lx,光照12h/d 條件下培養(yǎng);
(3) 增殖培養(yǎng) 一個月后將步驟(2)中已成活且無污染的叢生芽轉移到增 殖培養(yǎng)基M2: MS+6-BA1. Omg/L+IBAO. 45mg/L+青霉素100mg/L中,于22QC,光強 3000Lx,光照12h/d條件下培養(yǎng)一個月進行擴繁;繼代周期為一個月,將塊狀 芽叢剪成小塊進行擴繁;
(4) 生根培養(yǎng)挑選歩驟(3)中健壯小植株剪成單株轉接到M3: 1/2MS+6-BA0.2mg/L+NAA0. 5mg/L+Aclg/L培養(yǎng)基中,于22°C,光強2000Lx,光照 12h/d條件下培養(yǎng)一個月,可長成4-6條白色壯而長根的小苗;
(5) 球莖膨大培養(yǎng)挑選步驟(4)中根與莖葉皆健壯植株轉接到球莖膨大 培養(yǎng)基M4: MS+6-BA3.0mg/L+NAA0. 5mg/L+Aclg/L中進行試管養(yǎng)球,光照期間培 養(yǎng)溫度為25'C,黑暗期間為15i:,光照時間為12h/d,光強3000Lx,約一個月 時間即可;
(6) 種質保存培養(yǎng)挑選步驟(5)中小子球飽滿的植株保存于培養(yǎng)基M5: 1/2MS+6-BA0. lmg/L+NAA0. lmg/L +甘露醇20. Og/L+青霉素100mg/L中,培養(yǎng)溫 度為15°C,光照為10h/d,光強1000 Lx環(huán)境下保存可達15個月以上。
(7) 恢復培養(yǎng)對步驟(6)中保存一年以上己進入半休眠狀態(tài)的小子球轉 移到,同步驟(2)相同培養(yǎng)條件下進行恢復培養(yǎng)一個月后,轉移到新鮮的Ml 培養(yǎng)基中進行二代或二代以上的組培繁殖;
(8) 遺傳穩(wěn)定性檢測與利用可觀察到步驟(7)中恢復培養(yǎng)的小子球生長
增殖狀況正常,長勢旺盛,到第2代增殖率與正常組培條件下已形成相應大小
試管球莖的組培苗相當,為3.8-4.2,通過可溶性蛋白和過氧化物酶(P0D)檢測 未發(fā)生遺傳變異。該植株或按步驟(3)至(6)進行種質資源離體再保存;或 按步驟(3)至(5)用于種苗擴繁生產。
實施例2:(彩色馬蹄蓮種質資源離體保存方法2)
本例誘導培養(yǎng)基為M1: MS+6-BA1. 5mg/L+IBA0. 3mg/L+青霉素50mg/L,培養(yǎng)條 件為24。C,光強3000Lx,光照12h/d;
增殖培養(yǎng)基為M2: MS+6-BAO. 8mg/L+IBA0. 3mg/L+青霉素100mg/L,培養(yǎng)條件 為25QC,光強2500Lx,光照12h/d條件下培養(yǎng)一個月;
生根培養(yǎng)基為M3: 1/2MS+6-BA0. 4mg/L+NAA0. 5mg/L+Aclg/L,培養(yǎng)條件為23°C, 光強3000Lx,光照12h/d條件下培養(yǎng)一個月;
球莖膨大培養(yǎng)為M4: MS+6-BA2. Omg/L+NAAO. 5mg/L+Aclg/L,培養(yǎng)條件為光照 期間22。C,黑暗時間溫度為13'C,光照時間為14h/d,光強2500Lx;
種質保存培養(yǎng)基為M5: 1/2MS+6-BAO. 2mg/L+NAA0. 3mg/L +甘露醇15. Og/L+青 霉素100mg/L,培養(yǎng)條件為1(TC,光照為10h/d,光強IOOO Lx;
其余步驟,工藝均同于實施例l。
實施例3:(彩色馬蹄蓮種質資源離體保存方法3)
本例誘導培養(yǎng)基為M1: MS+6-BA1.0mg/L+IBA0. 5mg/L+青霉素50mg/L上;培養(yǎng) 條件為22。C,光強2000Lx,光照12h/d;
增殖培養(yǎng)基為M2: MS+6-BA0. 5mg/L+IBA0. 15mg/L+青霉素100mg/L,培養(yǎng)條件 為23°C,光強2000Lx,光照12h/d條件下培養(yǎng)一個月;
生根培養(yǎng)基為M3: 1/2MS+6-BA0. 3mg/L+NAA0. 5mg/L+Aclg/L,培養(yǎng)條件為26°C, 光強2500Lx,光照12h/d條件下培養(yǎng)一個月;
球莖膨大培養(yǎng)為M4: MS+6-BA1. 5mg/L+NAA0. 5mg/L+Aclg/L,培養(yǎng)條件為光照 期間培養(yǎng)溫度為24°C,黑暗期間培養(yǎng)溫度為13°C,光照時間為16h/d,光強 2000Lx;
種質保存培養(yǎng)基為M5: 1/2MS+6-BAO. 3mg/L+NAA0. 4mg/L +甘露醇18. Og/L+青 霉素100mg/L,培養(yǎng)條件為13。C,光照為10h/d,光強1000Lx; 其余步驟,工藝均同于實施例l。 試驗例(遺傳穩(wěn)定性檢測)
(1) 植物材料
a) 對照材料以常規(guī)正常繁殖生產的莖尖組培苗為材料;
b) 處理材料以恢復培養(yǎng)的保存材料二代繁殖苗為檢測對象;
(2) 將對照與處理材料經過增殖、生根后種植田間,觀察生長、開花情況均 趨一致,葉片與花均無變異發(fā)生;
(3) 對照與處理材料蛋白質和同工酶樣品溶液的制備分別準確稱取2.0g試 管苗葉片,剪碎后加入適量的石英砂于冰浴下勻漿,勻漿過程加入4ml稀釋4 倍的濃縮膠緩沖(pH值6. 7), 5000r/min離心20min,取上清液2ml加入lml 蔗糖溶液(40%)和1滴溴酚藍溶液(O. 1%)混勻,于-2(TC冰箱內貯存?zhèn)溆茫?br> (4) 電泳操作采用垂直PAGE不連續(xù)凝膠系統(tǒng)。每個樣品槽上樣30ul,電泳 開始時控制電流為15mA,待樣品進入分離膠后,調整電流為25mA。待溴酚藍 遷移至瓊脂層lcm時停止電泳,整個過程約3h;為防止溫度對酶活的影響, 電泳均在4'C冰箱內進行;
(5) 染色電泳結束后,打開膠板取出凝膠,標記溴酚藍泳動前沿;可溶性蛋
白采用考馬斯亮R2250法染色;P0D采用抗壞血酸-醋酸聯(lián)苯胺法染色;
(6) 譜帶結果與對照無明顯多態(tài)性,表明保存過程中無遺傳變異發(fā)生。
權利要求
1、一種彩色馬蹄蓮種質資源離體保存方法,其特征在于該方法按如下步驟進行(1)培養(yǎng)基的配制各階段培養(yǎng)基組分和各組分在每升培養(yǎng)基內所含重量為A)基本培養(yǎng)基其中,誘導、增殖培養(yǎng)基以蔗糖30g/L,瓊脂7g/L的MS為基本培養(yǎng)基;生根培養(yǎng)基以蔗糖30g/L,瓊脂7g/L的1/2MS為基本培養(yǎng)基;試管球莖膨大培養(yǎng)基以蔗糖40~50g/L,瓊脂6g/L的MS為基本培養(yǎng)基;種質保存培養(yǎng)基以蔗糖20g/L,瓊脂8g/L的1/2MS為基本培養(yǎng)基;pH均為5.6~5.8;B)誘導培養(yǎng)基M1MS+6-BA1.0-2.0mg/L+IBA0.3-0.5mg/L+青霉素50mg/L;C)增殖培養(yǎng)基M2MS+6-BA0.5-1.0mg/L+IBA0.1-0.5mg/L+青霉素100mg/L;D)生根培養(yǎng)基M31/2MS+6-BA0.2-0.4mg/L+NAA0.5mg/L+Ac1g/L;E)球莖膨大培養(yǎng)基M4MS+6-BA1.0-3.0mg/L+NAA0.5mg/L+Ac 1 g/L;F)種質保存培養(yǎng)基M51/2MS+6-BA0.1-0.3mg/L+NAA0.1-0.4mg/L+甘露醇15.0-20.0g/L+青霉素100mg/L;(2)外植體消毒、接種及誘導培養(yǎng)選取彩色馬蹄蓮健康、飽滿母球,用自來水刷洗泥土及最外層褐色表皮,沖洗約20分鐘后,切取母球上1cm3的塊莖芽眼,經自來水沖洗后,于超凈操作臺上用75%酒精浸泡0.5分鐘,無菌水沖洗3次,0.1%HgCl2水溶液常規(guī)滅菌12min,無菌水沖洗3~5次,剝取0.5mm以下莖尖分生組織,接種于誘導培養(yǎng)基M1中,于22-26℃,光強2000-3000Lx,光照12h/d條件下培養(yǎng)一個月;或選取彩色馬蹄蓮組培生產過程中無內生菌污染且生長健康的植株,剝取0.5mm以下莖尖分生組織為誘導、增殖對象;(3)增殖培養(yǎng)將步驟(2)已成活且無污染的叢生芽轉接到增殖培養(yǎng)基M2中,于22-26℃,光強2000-3000Lx,光照12h/d條件下培養(yǎng)一個月;繼代周期為一個月,將塊狀芽叢剪成小塊進行擴繁;(4)生根培養(yǎng)挑選步驟(3)中健壯叢狀小植株剪成單株轉接到生根培養(yǎng)基M3中,于22-26℃,光強2000-3000Lx,光照12h/d條件下培養(yǎng)一個月,長成4-6條白色長根的小苗;(5)球莖膨大培養(yǎng)挑選步驟(4)根與莖葉皆健壯植株轉接到球莖膨大培養(yǎng)基M4中進行試管養(yǎng)球,在22-25℃,光照12-16h/d,光強2000-3000Lx下培養(yǎng)約一個月時間;(6)種質保存培養(yǎng)挑選步驟(5)小子球飽滿的植株轉接到種質保存培養(yǎng)基M5中,在10-15℃,光照10h/d,光強1000Lx環(huán)境下保存,保存期長達15個月以上;(7)恢復培養(yǎng)將步驟(6)保存培養(yǎng)一年以上已進入半休眠狀態(tài)的小子球植株,先轉移到同步驟(2)培養(yǎng)條件下恢復培養(yǎng)一個月,再轉接到新鮮的誘導培養(yǎng)基M1中進行二代或二代以上的組培繁殖;(8)遺傳穩(wěn)定性檢測與利用觀察并挑選步驟(7)組培繁殖的小子球生長、增殖狀況正常,長勢旺盛,增殖率為3.8-4.2,經可溶性蛋白和過氧化物酶(POD)檢測未發(fā)生遺傳變異的植株;該植株或按步驟(3)至(6)進行種質資源離體再保存;或按步驟(3)至(5)用于種苗擴繁生產。
2、按權利要求1所述的方法,其特征在于所述的1/2MS基本培養(yǎng)基為大量 元素減半的Murashige-Skoog (MS)培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種彩色馬蹄蓮種質資源離體保存方法,屬于植物種質資源保存及組織培養(yǎng)技術領域。該方法包括培養(yǎng)基的配制;外植體消毒、接種及誘導培養(yǎng);增殖培養(yǎng);生根培養(yǎng);球莖膨大培養(yǎng);種質保存培養(yǎng);恢復培養(yǎng)及遺傳穩(wěn)定性檢測與利用等步驟。該方法取彩色馬蹄蓮0.5mm莖尖分生組織為外植體,減少了培養(yǎng)基中大量元素并添加了甘露醇和青霉素,在10-15℃,光照10h/d,光強1000Lx環(huán)境下保存球莖苗,15個月后無歐文氏菌污染,存活率達100%,恢復培養(yǎng)后生長、增殖仍正常,無可遺傳變異發(fā)生。該方法具成本低廉,操作簡便等特點,可在彩色馬蹄蓮種質保存領域中推廣應用。
文檔編號A01N3/00GK101185433SQ20071016473
公開日2008年5月28日 申請日期2007年12月10日 優(yōu)先權日2007年12月10日
發(fā)明者玫 劉, 吳延軍, 孫崇波, 張慧琴, 蔣桂華, 鳴 謝, 郭方其, 黃普樂 申請人:浙江省農業(yè)科學院
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