專利名稱：：西伯利亞百合脫毒試管苗鱗片高效再生鱗莖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬生物科學(xué)中的組織培養(yǎng)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種百合試管苗鱗片高效再生試管微型鱗莖技術(shù)。二、
背景技術(shù)：
百合是世界五大鮮切花之一，不僅花姿優(yōu)美，色彩豐富，氣味芬芳，而且其鱗莖還具有食用和藥用價值。因此，近年來對百合的研究日趨深入和廣泛，特別是在組織培養(yǎng)及快速繁殖方面已走向了成熟化和工業(yè)化。西伯利亞百合"/6en'aJ屬于東方百合雜種系，是近年國內(nèi)外花卉市場熱銷的百合品種之一。傳統(tǒng)的百合繁殖方法主要釆用常規(guī)分球、分珠芽、鱗片扦插、鱗片包埋等。采用這些方法進(jìn)行繁殖，繁殖系數(shù)較小，特別是經(jīng)多代繁殖以后，常造成種性退化，甚至病毒積累，影響百合的產(chǎn)量和品質(zhì)。組織培養(yǎng)技術(shù)能夠迅速去除病毒和更新品種，加快繁殖速度、縮短育種周期。百合的組織培養(yǎng)使用最多的外植體是鱗片。百合鱗片作為外植體具有容易獲得，分化能力強(qiáng)，對培養(yǎng)基要求不高等優(yōu)點(diǎn)，是目前百合組織培養(yǎng)中普遍采用的外植體。自1982年陳為民、黃濟(jì)明分別采用百合鱗片作為外植體成功誘導(dǎo)產(chǎn)生了百合的再生植林以來，國內(nèi)外關(guān)于百合鱗片組織培養(yǎng)的報道較多，主要是通過調(diào)節(jié)激素的配比來誘導(dǎo)其組織分化并再生植抹，但未見研究鱗片縱切片不定芽狀微型鱗莖分化的報道。三、
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是尋找更好的百合組織培養(yǎng)新材料和有針對性的組織培養(yǎng)新方法，使西伯利亞百合試管苗鱗片高效再生不定芽狀微型鱗莖，為該品種的組培快繁及產(chǎn)業(yè)化、轉(zhuǎn)基因研究等提供技術(shù)基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，百合鱗莖不同部位的鱗片，分化不定芽的能力有差異，從強(qiáng)到弱依次為外層>中層>內(nèi)層。鱗片不同部位切段的不定芽分化速率和數(shù)量也存在差異，依次為鱗片基部〉中部〉上部。本發(fā)明的技術(shù)解決方案為一種西伯利亞百合脫毒試管苗鱗片高效再生鱗莖方法，其特征是該方法包括以下步驟a.將西伯利亞百合試管苗置于養(yǎng)鱗莖培養(yǎng)基上培養(yǎng)約1.5個月，培養(yǎng)溫度25土2。C，光照20001ux,光照時間12小時/天；b.選取1~1.5cm直徑的試管鱗莖，剝?nèi)⊥鈧?cè)1~3層鱗片，在無菌條件下用鋒利的刀具將鱗片縱向切為厚度l~2mm的薄片，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽(微型鱗莖)的發(fā)生；培養(yǎng)溫度25±2°C,光照20001ux,光照時間12小時/天；培養(yǎng)15天后可見不定芽狀小鱗莖的發(fā)生；c.不定芽狀微型鱗莖2~3cm高時，轉(zhuǎn)接入養(yǎng)鱗莖培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度"±2°C,光照20001ux，光照時間12小時/天；d.鱗莖直徑達(dá)到1.5~2.Ocm時，移入24。C的冷庫中培養(yǎng)30~50天；e.打開瓶口在大棚中常溫?zé)捗?~5天，自來水洗凈根系上的培養(yǎng)基，移栽入珍珠巖和草炭土比例為1:3的移栽基質(zhì)中自然生長育苗。18天后可見地上莖抽出地面。才直;f朱生長健壯，且整齊一致。上述方法中養(yǎng)鱗莖廣俗稱#承，措在逸歡裙#務(wù)伴7"，炎微型舉JV^/、舉,J:逸iS遽潛義^潛#《在。^#，_￡徑AJc/b以7"定乂^參差，。.J"^定乂^W、舉JV培養(yǎng)基配方為MS培養(yǎng)基添加蔗糖80100g/L。附MSi咅養(yǎng)基(MurashingandSkoogmedium)才示;焦酉己方NH4N031650mg/1KN。3l卯0mg/1CaCl2■2H20440mg/1MgS047H20370mg/1KH2P04170mg/1KI0.83mg/1H3B036.2mg/1MnS04-H2016.9mg/1ZnS047H208.6mg/1Na2Mo042H200.25mg/1CuS045H200,025mg/1CoCl2■6H200.025mg/1FeS047H2027.8mg/1Na2-EDTA37,3mg/1肌醇100mg/1煙酸0.5mg/1鹽酸硫胺素0.1mg/1鹽酸吡眵醇0.5mg/1甘氨酸2mg/1謙導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+2,4-D0.5mg/L+TDZ0.006mg/L+蔗糖30g/L;在步驟(c)中，不定芽狀微型鱗莖首次轉(zhuǎn)接入養(yǎng)鱗莖培養(yǎng)基時，應(yīng)在無菌條件下剪去上部約2/3的葉片，第二次養(yǎng)鱗莖時在無菌條件下，將完整小鱗莖取出，切除周圍雜亂組織和葉片，接種到養(yǎng)鱗莖培養(yǎng)基。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其顯著優(yōu)點(diǎn)是極大的提高了試管鱗片的再生微型鱗莖的效率和繁殖系數(shù)，為快速繁殖百合試管微型鱗莖和轉(zhuǎn)基因研究提供了技術(shù)基礎(chǔ)。四圖1剝?nèi)△[片的鱗莖；圖2接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的鱗片縱向切片；圖3鱗片縱向的分化效果；圖4箭頭所指處為養(yǎng)鱗莖之前的不定芽狀微型鱗莖；圖5進(jìn)入冷庫的試管鱗莖；圖6TDZ不濃度對鱗片縱切片分化不定芽狀微型鱗莖的影響曲線。五具體實施方式實施例1:選取1~1.5cm直徑的試管鱗莖，剝?nèi)⊥鈧?cè)1~3層鱗片，在無菌條件下用鋒利的刀具將鱗片縱向切為厚度1~2隱的薄片，每個鱗片平均可得到6~8片鱗片縱切片，切片形狀參見附圖2。實施例2:誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，2,4-D添加濃度對鱗片縱切片分化不定芽狀微型鱗莖的影響見表l。表l2，4-D濃度對鱗片縱切片分化不定芽狀微型鱗莖的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>鱗片縱切片接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上五天開始逐漸轉(zhuǎn)綠。十天可見基部有芽點(diǎn)出現(xiàn)，近軸面與遠(yuǎn)軸面表皮輕微愈傷化。十二天時輕微愈傷化的表皮有出現(xiàn)芽點(diǎn)，十五天形成完整不定芽狀微型鱗莖。表1說明TDZ用量在0.005mg/L時隨2,4-D用量加大平均不定芽狀微型鱗莖數(shù)增加，在0.5mg/L時最大，隨后逐漸降低。不定芽狀微型鱗莖發(fā)生頻率與2,4-D用量沒有太大關(guān)聯(lián)。確定0.5mg/L2,4-D為鱗片縱切片不定芽狀微型鱗莖誘導(dǎo)的最佳用量。實施例3:誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，TDZ不同濃度對鱗片縱切片分化不定芽狀^t型鱗莖的影響見表2和附圖6。表2TDZ不濃度對鱗片縱切片分化不定芽狀微型鱗莖的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>0.0025043868.243540.00450501006.53250.0055045卯73150.006505010084000細(xì)50501007.53750.0150501006.743370.055042844.6193對TDZ使用濃度測試表明在TDZ用量為0.002mg/L時平均不定芽狀微型鱗莖數(shù)達(dá)到最高，但總不定芽狀微型鱗莖數(shù)量少，發(fā)生頻率降低。TDZ用量為0.006mg/L時雖然平均不定芽狀微型鱗莖數(shù)略低于0.002mg/L,但是不定芽狀微型鱗莖總數(shù)高于0.002mg/L,發(fā)生頻率可以達(dá)到100°/。。所以確定0.006mg/LTDZ為鱗片縱切片不定芽狀微型鱗莖誘導(dǎo)的最佳用量。采用本發(fā)明提供的的方法，極大的提高了試管鱗片的再生微型鱗莖的效率和繁殖系數(shù)，為快速繁殖百合試管微型鱗莖和轉(zhuǎn)基因研究提供了技術(shù)基礎(chǔ)。權(quán)利要求1.一種西伯利亞百合脫毒試管苗鱗片高效再生鱗莖方法，其特征是該方法包括以下步驟a.將西伯利亞百合試管苗置于養(yǎng)鱗莖培養(yǎng)基上培養(yǎng)約1.5個月，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照2000lux，光照時間12小時/天；b.選取1～1.5cm直徑的試管鱗莖，剝?nèi)⊥鈧?cè)1～3層鱗片，在無菌條件下用鋒利的刀具將鱗片縱向切為厚度1～2mm的薄片，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽狀微型鱗莖發(fā)生；培養(yǎng)溫度25±2℃，光照2000lux，光照時間12小時/天；c.不定芽狀微型鱗莖葉片2～3cm高時，轉(zhuǎn)接入養(yǎng)鱗莖培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照2000lux，光照時間12小時/天；d.鱗莖直徑達(dá)到1.5～2.0cm時，移入2～4℃的冷庫中培養(yǎng)30～50天；e.打開瓶口在大棚中常溫?zé)捗?～5天，自來水洗凈根系上的培養(yǎng)基，移栽入珍珠巖和草炭土比例為1∶3的移栽基質(zhì)中自然生長育苗。2.如權(quán)利要求l所述的西伯利亞百合脫毒試管苗鱗片高效再生鱗莖方法，其特征是誘導(dǎo)培養(yǎng)基的最佳配方為MS+2,4-D0.5mg/L+TDZ0.006mg/L+蔗糖30g/L。全文摘要一種西伯利亞百合脫毒試管苗鱗片高效再生鱗莖方法，其特征是選取1～1.5cm直徑的試管鱗莖，剝?nèi)⊥鈧?cè)1～3層鱗片，在無菌條件下用鋒利的刀具將鱗片縱向切為厚度1～2mm的薄片，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽的發(fā)生。當(dāng)不定芽長到2～3cm高時再轉(zhuǎn)入養(yǎng)鱗莖培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)鱗莖直徑達(dá)到1.5～2.0cm時，分別進(jìn)行冷庫培養(yǎng)、常溫?zé)捗绾蠹纯梢圃匀胝渲閹r和草炭土基質(zhì)中進(jìn)行常規(guī)育苗。文檔編號A01H4/00GK101133717SQ20071013082公開日2008年3月5日申請日期2007年8月22日優(yōu)先權(quán)日2007年8月22日發(fā)明者席夢利,施季森,王鵬凱,胡鳳榮申請人:南京林業(yè)大學(xué)