專利名稱：：一種分子標(biāo)記輔助選擇培育抗穗發(fā)芽雜交稻不育系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于水稻分子育種領(lǐng)域，具體涉及一種借助分子標(biāo)記輔助選擇培育抗穗發(fā)芽雜交稻不育系的方法。
背景技術(shù)：
：水稻是我國(guó)的主要糧食作物之一。發(fā)展水稻生產(chǎn)對(duì)保障食物安全，維護(hù)社會(huì)穩(wěn)定，促進(jìn)經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)均具有重大意義。穗發(fā)芽是關(guān)系稻米品質(zhì)和稻種質(zhì)量的重要農(nóng)藝性狀。在我國(guó)南方稻區(qū)不育系繁殖、制種過(guò)程中，由于赤霉素的廣泛使用，加上收獲季節(jié)的高溫高濕，穗發(fā)芽率通常在20%~30%,最高可達(dá)60%~80%，嚴(yán)重影響雜交稻種子的質(zhì)量。穗發(fā)芽與水稻休眠性密切相關(guān)，為數(shù)量性狀，受多種因素協(xié)同作用，在育種實(shí)踐中僅依賴表型鑒定篩選穗發(fā)芽抗性是困難的。而借助與穗發(fā)芽抗性緊密連鎖分子標(biāo)記輔助選擇培育抗穗發(fā)芽保持系及不育系是解決雜交稻種子穗上發(fā)芽問(wèn)題最經(jīng)濟(jì)有效的途徑。近年來(lái)，較多研究者采用DNA分子標(biāo)記對(duì)穗發(fā)芽和休眠性進(jìn)行數(shù)量性狀位點(diǎn)定位(QTL)分析，在7jc稻的12條染色體上均檢測(cè)到與穗發(fā)芽和休眠性相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)。但這些研究檢測(cè)到的數(shù)量性狀位點(diǎn)，對(duì)表型變異的解釋效應(yīng)較小，難以用于進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種分子標(biāo)記輔助選擇培育抗穗發(fā)芽雜交稻不育系的方法，該方法能快速有效地選擇抗穗發(fā)芽材料，減小育種規(guī)才莫，降低育種成本，高效快速地選育出抗穗發(fā)芽雜交稻不育系。本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題，所采用的技術(shù)方案是一種分子標(biāo)記輔助選擇培育抗穗發(fā)芽雜交稻不育系的方法，其步驟是A、保持系重點(diǎn)株系的選育以抗穗發(fā)芽品種為供體親本，以配合力高但易穗發(fā)芽的不育系的相應(yīng)保持系為輪回親本進(jìn)行雜交、回交和自交，同時(shí)每季也種植供體親本和輪回親本；在各分離世代選擇中，進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇即用RM447、RM3754兩個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記引物對(duì)群體單林和親本的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，選擇群體單林中電泳帶型與供體親本相同的單抹，再結(jié)合穗發(fā)芽鑒定和其它育種目標(biāo)性狀的選擇，選擇出進(jìn)行下一代回交或自交的單抹；回交2~3代再自交57代得到若干重點(diǎn)株系；B、不育系的選育將A步得到的重點(diǎn)林系與A步所述的配合力高但易穗發(fā)芽的不育系成對(duì)回交47代；在回交過(guò)程中，采用與A步相同的分子標(biāo)記輔助選擇方法進(jìn)行選擇；即培育出抗穗發(fā)芽雜交稻不育系。本發(fā)明的分子標(biāo)記輔助選擇使用與穗發(fā)芽抗性緊密連鎖的SSR引物是通過(guò)以下方法發(fā)現(xiàn)的以美國(guó)光身稻Lemont為抗穗發(fā)芽基因的供體，以中國(guó)南方廣泛應(yīng)用的不育系G46A的保持系G46B為輪回親本進(jìn)行雜交、回交和自交，F(xiàn)j直林與G46B回交2代并自交構(gòu)建BC2F5群體，經(jīng)多代穗發(fā)芽抗性鑒定獲得G46B的抗穗發(fā)芽基因?qū)胂礙81。以G46B和K81構(gòu)建F2群體，測(cè)定親本及&單抹的穗發(fā)芽率，并用SSR標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建遺傳連鎖圖，采用復(fù)合區(qū)間作圖法在水稻第8染色體長(zhǎng)臂末端檢測(cè)到主效QTL,對(duì)穗發(fā)芽表型變異的貢獻(xiàn)率達(dá)43.04%,命名為qPSR8。該區(qū)段共發(fā)掘到9個(gè)與穗發(fā)芽抗性緊密連鎖的SSR標(biāo)記引物(RM3895,RM447,RM3754,RM6948,RM7631,RM6845,RM3120,RM3496，RM477)。其中與qPSR8最近的兩個(gè)標(biāo)記為RM447和RM3754，遺傳距離分別為1.5cM和4cM。從而選出與穗發(fā)芽抗性基因距離最近的兩個(gè)標(biāo)記引物RM447和RM3754作為選育過(guò)程中分子標(biāo)記輔助選擇時(shí)使用的引物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是在選育過(guò)程中采用了與穗發(fā)芽抗性緊密連鎖的SSR引物RM447和RM3754進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，在5~6葉秧苗期即可釆集葉片，在不影響植抹正常生長(zhǎng)情況下，即可在實(shí)驗(yàn)室對(duì)穗發(fā)芽抗性基因進(jìn)行直接檢測(cè)，不受環(huán)境條件影響，可在3~5天內(nèi)獲得結(jié)果，檢測(cè)速度迅速，檢測(cè)準(zhǔn)確性高，實(shí)驗(yàn)證明其選擇準(zhǔn)確性可達(dá)到80%以上。對(duì)于本代植抹，檢測(cè)出的不具抗性基因植株即可拔除；而進(jìn)行下一代回交或自交的植林，其選擇準(zhǔn)確性大大提高，所需種植的植抹群體大大減少，從而明顯降低育種規(guī)模，減少育種成本，使育種者能高效快速地選育出抗穗發(fā)芽雜交稻不育系。上述的穗發(fā)芽鑒定的具體做法為抽穗期至收獲期用透明塑料薄膜搭建頂棚，棚高23米，四周通風(fēng)透氣；記錄抽穗期，所有材料于開(kāi)花后35-40天收獲。每林距離穗子基部4~6厘米處隨機(jī)取3個(gè)穗子，立即浸入水中3~5小時(shí)，倒掉大部分水，每個(gè)三角瓶?jī)H留l厘米深的水，瓶口用塑料薄膜覆蓋，置于20。C環(huán)境中，7天后種子胚根突破種皮即算作發(fā)芽，即得到發(fā)芽率。抽穗期至收獲期，植抹生長(zhǎng)于棚內(nèi)，方便人工控制其環(huán)境濕度及土壤水分，避免氣候變化對(duì)植抹穗發(fā)芽特性的影響；取整穗發(fā)芽更能反映植株本身的穗發(fā)芽特性。這樣，鑒定出的植林穗發(fā)芽特性更準(zhǔn)確有效，進(jìn)一步提高了育種選擇的效率。下面結(jié)合具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。具體實(shí)施方式實(shí)施例一種分子標(biāo)記輔助選擇培育抗穗發(fā)芽雜交稻不育系的方法，其步驟是A、保持系重點(diǎn)抹系的選育以抗穗發(fā)芽品種美國(guó)光身稻Lemont為抗穗發(fā)芽基因的供體親本，以中國(guó)南方秈稻區(qū)廣泛使用的不育系G46A的保持系G46B為輪回親本進(jìn)行雜交、回交和自交，同時(shí)每季也種植供體親本和輪回親本。在各分離世代選擇中，進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇即用RM447、RM3754兩個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記引物(SSR)對(duì)群體單林和親本的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，選擇群體單抹中電泳帶型與供體親本相同的單抹，再結(jié)合穗發(fā)芽抗性鑒定和其它育種目標(biāo)性狀的選擇，選擇出進(jìn)行下一代回交或自交的單林；回交3代再自交5代得到30個(gè)重點(diǎn)抹系。其它育種目標(biāo)性狀是指根據(jù)育種要求而需要選擇的性狀，如產(chǎn)量性狀、品質(zhì)性狀、抗病蟲(chóng)害性狀，其選擇與鑒別的方法均為現(xiàn)有^l支術(shù)。保持系重點(diǎn)抹系的個(gè)數(shù)通常為10100個(gè)，如抗穗發(fā)芽特性與其它育種目標(biāo)性狀已較多的集中在少數(shù)抹系上則可選擇較少的重點(diǎn)抹系，否則應(yīng)選擇較多的重點(diǎn)林系。本例各分離世代的性狀選擇時(shí)，穗發(fā)芽鑒定的具體做法為抽穗期至收獲期用透明塑料薄膜^^建頂棚，棚高2米，四周通風(fēng)透氣；記錄抽穗期，所有材料于開(kāi)花后3540天收獲。每抹距離穗子基部5厘米處隨機(jī)取3個(gè)穗子，立即浸入水中4小時(shí)，倒掉大部分水，每個(gè)三角瓶?jī)H留1厘米深的水，瓶口用塑料薄膜覆蓋，置于2(TC環(huán)境中，7天后種子胚根突破種皮即算作發(fā)芽，即得到發(fā)芽率。發(fā)芽率的具體公式為穗發(fā)芽率(％)-發(fā)芽種子數(shù)Z供試種子數(shù)xlOO。B、不育系的選育將A步得到的30個(gè)重點(diǎn)抹系與不育系G46A成對(duì)回交5代；在回交過(guò)程中，采用與A步相同的分子標(biāo)記輔助選擇方法進(jìn)行選擇；即培育出優(yōu)質(zhì)、高配合力的抗穗發(fā)芽雜交稻不育系K1A和K2A。在該過(guò)程中，還可同時(shí)種植供體親本(美國(guó)光身稻Lemont)及輪回親本(G46B);這樣在選擇時(shí)，能夠以供體親本及輪回親本作為對(duì)照，消除不同世代的種植環(huán)境及氣候變化對(duì)穗發(fā)芽抗性的影響，從而更好地進(jìn)行性狀選擇和鑒別。本例育成的抗穗發(fā)芽不育系K1A和K2A,保持了G46A的產(chǎn)量配合力水平。以其為母本，以現(xiàn)有各種優(yōu)良恢復(fù)系為父本，可育成各種優(yōu)質(zhì)、抗病、抗穗發(fā)芽雜交種供生產(chǎn)使用。如申請(qǐng)人已利用大面積生產(chǎn)應(yīng)用的成恢177、成恢727、蜀恢527、綿恢725等恢復(fù)系為父本，育成了多個(gè)雜交組合，這些雜交組合的結(jié)實(shí)率為80.27%-85.9%，平均為82.63%。本發(fā)明在實(shí)施時(shí)，保持系重點(diǎn)植抹選育過(guò)程中，回交的代數(shù)可以為2~3代，自交的代數(shù)可以是5~7代，其具體的代數(shù)以與田間農(nóng)藝性狀穩(wěn)定一致為準(zhǔn)。本發(fā)明所使用的供體親本，除了可以是美國(guó)光身稻Lemont，還可以是IR64、IR13427、IR1529、博IIB等各種具有抗穗發(fā)芽特性的水稻品種。輪回親本也可以是現(xiàn)有的各種配合力高但易穗發(fā)芽的不育系的保持系，如II-32B、803B等。本發(fā)明使用的SSR標(biāo)記引物RM447、RM3754的序列見(jiàn)下表RM447、RM3754序列表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權(quán)利要求1、一種分子標(biāo)記輔助選擇培育抗穗發(fā)芽雜交稻不育系的方法，其步驟是A、保持系重點(diǎn)株系的選育以抗穗發(fā)芽品種為供體親本，以配合力高但易穗發(fā)芽的不育系的相應(yīng)保持系為輪回親本進(jìn)行雜交、回交和自交，同時(shí)每季也種植供體親本和輪回親本；在各分離世代選擇中，進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇即用RM447、RM3754兩個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記引物對(duì)群體單株和親本的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，選擇群體單株中電泳帶型與供體親本相同的單株，再結(jié)合穗發(fā)芽抗性鑒定和其它育種目標(biāo)性狀的選擇，選擇出進(jìn)行下一代回交或自交的單株；回交2～3代再自交5～7代得到若干重點(diǎn)株系；B、不育系的選育將A步得到的重點(diǎn)株系與A步所述的配合力高但易穗發(fā)芽的不育系成對(duì)回交4～7代；在回交過(guò)程中，采用與A步相同的分子標(biāo)記輔助選擇方法進(jìn)行選擇；即培育出抗穗發(fā)芽雜交稻不育系。2、如權(quán)利要求1所述的一種分子標(biāo)記輔助選擇培育抗穗發(fā)芽雜交稻不育系的方法，其特征在于，所述的穗發(fā)芽鑒定的具體^L法為抽穗期至收獲期用透明塑料薄膜搭建頂棚，棚高2~3米，四周通風(fēng)透氣；記錄抽穗期，所有材料于開(kāi)花后35~40天收獲。每抹距離穗子基部4~6厘米處隨機(jī)取3個(gè)穗子，立即浸入水中3~5小時(shí)，倒掉大部分水，每個(gè)三角瓶?jī)H留1厘米深的水，瓶口用塑料薄膜覆蓋，置于2(TC環(huán)境中，7天后種子胚根突破種皮即算作發(fā)芽，即得到發(fā)芽率。全文摘要一種分子標(biāo)記輔助選擇培育抗穗發(fā)芽雜交稻不育系的方法，其步驟是A.以抗穗發(fā)芽品種為供體親本，以配合力高但易穗發(fā)芽的不育系的相應(yīng)保持系為輪回親本進(jìn)行雜交、回交和自交，同時(shí)每季也種植供體親本和輪回親本；在各分離世代選擇中，用RM447、RM3754兩個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記引物進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，回交2～3代再自交5～7代得到若干重點(diǎn)株系；B.將A步得到的重點(diǎn)株系與A步所述的配合力高但易穗發(fā)芽的不育系成對(duì)回交4～7代；回交過(guò)程中，采用與A步相同的分子標(biāo)記輔助選擇方法進(jìn)行選擇；即培育出抗穗發(fā)芽雜交稻不育系。該方法能快速有效地選擇抗穗發(fā)芽材料，減小育種規(guī)模，降低育種成本，高效快速地選育出抗穗發(fā)芽雜交稻不育系。文檔編號(hào)A01H1/02GK101176425SQ20071005062公開(kāi)日2008年5月14日申請(qǐng)日期2007年11月27日優(yōu)先權(quán)日2007年11月27日發(fā)明者任光俊,任明鑫,劉光春,劉小平,軍唐,李治華,陸賢軍,高方遠(yuǎn)申請(qǐng)人:四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所