欧美在线观看视频网站,亚洲熟妇色自偷自拍另类,啪啪伊人网,中文字幕第13亚洲另类,中文成人久久久久影院免费观看 ,精品人妻人人做人人爽,亚洲a视频

變異堿性纖維素酶的制作方法

文檔序號:327922閱讀:446來源:國知局

專利名稱::變異堿性纖維素酶的制作方法
技術領域
:本發(fā)明涉及可作為衣料用洗劑等的配料的變異堿性纖維素酶。
背景技術
:使用衣料用洗劑時,洗滌液中的pH基本上在pH1011的堿性區(qū)域。因此,要求用作衣料用洗劑配料的酶適應堿性環(huán)境,且在堿性環(huán)境下具有穩(wěn)定性。目前,就可用作衣料用洗劑等的配料的堿性纖維素酶而言,己知有,源于屬于芽孢桿菌屬(Bac/〃w)的萬ac/〃"s取KSM-635的堿性纖維素酶(揭示于日本特公昭60-23158號公報,特公平6-030578號公報,美國專利第4945053號說明書等)、源于5a"7/w^.KSM-64的堿性纖維素酶(Shikata&a/.々".c.編.CTzew.,54,91-96,1990;Sumitomo"a/.,5/o"/.所o&c/mo/.歷oc/ze附.,56,872-877,1992)、由嗜溫嗜堿菌Sac!7/w^.KSM-S237(FERM-BP7875:于平成9年2月6日保藏于日本茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6(郵政編碼305-8566)的獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所的專利生物保藏中心)生成的耐熱性堿性纖維素酶(日本特開平10-313859號公報)、源于Sa"7/wsKSM-N257的堿性纖維素酶(日本特愿平12-281378)、源于萬a"7/ws取KSM-N131的堿性纖維素酶(日本特愿平12-373859)等,以羧甲基纖維素(CMC)為基質時,它們的最優(yōu)反應pH值均在9附近,該pH值并不是最適于洗滌的。而就葡糖苷酶而言,改變其最優(yōu)反應pH值的研究有構筑源于嗜堿性芽孢桿菌(Bacz7/w)的堿性纖維素酶(NK1)和源于枯草桿菌(^^7/ww^7&)的中性纖維素酶(BSC)的嵌合蛋白,改變其pH值特性的實例,它使最優(yōu)pH值由堿性移向中性(ParkWa/.,£"g.,6,921-926,1993)。而最近,有報告指出源于木霉(7Hc/20^rw"^Me/)的纖維二糖水解酶(Cel7A),通過取代其活性中心附近的氨基酸,比野生型更能提高最優(yōu)pH值(BekerWa/,說'oc/^w./,356,19-31,2001),但因野生型酶的最優(yōu)pH值在酸性區(qū)域,其變異體的最優(yōu)pH值最多不過提高了1個pH值單位。因此,實際情況是,幾乎還未被報知有使葡糖苷酶的最優(yōu)反應pH值移向堿性側的實例。
發(fā)明內(nèi)容而本發(fā)明的目的在于,通過改變堿性纖維素酶的遺傳基因,提供具有最適于洗劑用酶的pH值的變異堿性纖維素酶。本發(fā)明人等預判了序列號1所示的堿性纖維素酶(Egl-237)的立體構造,特別是以其活性域為中心的立體構造,利用位點特異性誘變法,導入各種變異,尋求目標酶,結果發(fā)現(xiàn)使形成環(huán)狀構造的局部特定區(qū)域的氨基酸殘基缺失,并在該部位插入新肽,就能提高CMC分解活性的最優(yōu)反應pH值。艮P,本發(fā)明涉及序列號1所示氨基酸序列或與其具有90%以上同源性的纖維素酶,并提供使選自序列號1的343位377位或相當于該位置的氨基酸殘基中的一個以上缺失,將氨基酸殘基數(shù)215的肽插入該缺失部分的變異堿性纖維素酶以及對其進行編碼的遺傳基因。本發(fā)明還提供含該遺傳基因的媒介物,以及含該媒介物的轉化體。圖lalc為與序列號1所示氨基酸序列具有90%以上同源性的纖維素酶的氨基酸序列排列圖。圖2為丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸變異體的最優(yōu)反應pH值示意圖。圖3為丙氨酸-組氨酸-丙氨酸變異體的最優(yōu)反應pH值示意圖。圖4為丙氨酸-精氨酸-丙氨酸變異體的最優(yōu)反應pH值示意圖。具體實施例方式本發(fā)明的變異堿性纖維素酶是以序列號1所示氨基酸序列或與其具有90%以上同源性的纖維素酶為變異對象的纖維素酶(下亦稱為"母本堿性纖維素酶(parentalkalinecellulase)"),使選自該序列號1的343位377位或相當于該位置的氨基酸殘基中的一個以上缺失,將氨基酸殘基數(shù)215的肽插入到該缺失部分而形成的,母本堿性纖維素酶既可以是野生型的變異體,也可以是實施了人工變異的變異體。在本發(fā)明中,與母本堿性纖維素酶的序列號1所示的氨基酸序列有90%以上同源性的纖維素酶,更優(yōu)選為顯示出與該氨基酸序列有95%以上同源性的纖維素酶,進一步優(yōu)選為顯示出有98%以上同源性的纖維素酶,它們既可以是野生型,也可以是野生型的變異體。另外,氨基酸序列的同源性可使用GENETYX-WIN的最大匹配法或同源性檢索等程序(SoftwareDevel叩mentCo.)進行計算。另外,與該以序列號1表示的氨基酸序列具有90%以上同源性的纖維素酶,在使用同源模擬法用3D-1D、XPLORE及PROCHECK程序預測纖維素酶分子構造后的情況下,優(yōu)選為與序列號1中第42位的亮氨酸第404號的纈氨酸的活性域具有70%以上、更優(yōu)選為80%以上、進一步優(yōu)選為90%以上、更進一步優(yōu)選為95%以上、特別優(yōu)選為98%以上的同源性,且優(yōu)選為相當于序列號1中第343位的天冬氨酸第377位的亮氨酸的氨基酸序列在纖維素酶分子內(nèi)具有環(huán)狀構造。且,此時的氨基酸序列的同源性能以例如Lipman-Pearson法""'e"ce,227,1435,1985)等為基準計算。而且,母本堿性纖維素酶優(yōu)選具有以利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法或凝膠過濾法得到的的分子量為86000±2000的羧甲基纖維素為基質時的最優(yōu)反應pH值在7.59.0之間,最優(yōu)反應溫度在4050'C的范圍內(nèi)等性質,且母本堿性纖維素酶優(yōu)選為能像消化羧甲基纖維素一樣高效消化地衣多糖,并優(yōu)選為,即使在pH9、5(TC的條件下處理IO分鐘也具有充分的穩(wěn)定性。特別優(yōu)選為具有如下性質的母本堿性纖維素酶,即,分子量為86000±2000(利用SDS-PAGE法或使用SephacrylS200柱的凝膠過濾法測得);最優(yōu)反應pH值為8.69.0;最優(yōu)反應溫度為50°C;能像消化羧甲基纖維素一樣高效消化地衣多糖;在pH9的5mM氯化铞的存在下,進行5(TC、IO分鐘的處理的情況下,具有95%以上(以30。C、IO分鐘處理時的殘存活性為100%)的殘存活性。綜上,本發(fā)明的母本堿性纖維素酶,除了以序列號1表示的堿性纖維素酶以外,如上所述,優(yōu)選為還有與序列號1的特定活性域具有較高的同源性、且具有序列號1的特定氨基酸序列在纖維素酶分子內(nèi)有環(huán)狀構造的氨基酸序列上的特征和/或上述酶類學性質,特別是具有該氨基酸序列上的特征且具有酶類學性質,顯示出與序列號1所示氨基酸序列90%以上、優(yōu)選為95%以上、更優(yōu)選為98%以上的同源性。具體可以舉出"具有以序列號1表示的氨基酸序列的堿性纖維素酶"的Egl-237(源于5""'〃"s取KSM-S237(FERMBP-7875)、Hakamada等,所cwd.所o/ec/wo/.說oc/je肌,64,2281-2289,2000)、源于i5ac/〃"ss/.1139菌株的堿性纖維素酶(Egl-1139,F(xiàn)ukumori等,M'cra6/oU32,2329-2335,同源性91.4%)、源于Ba"7/w";.KSM-64菌株的堿性纖維素酶(Egl-64,Sumitomo等,S/o^c/mo/.B/oc/ze肌,56,872-877,1992,同源性91.9%)、源于Bfl"7/w平KSM-N131菌株的纖維素酶(Egl-N131b,日本特愿2000-47237號,同源性95.0%)等。本發(fā)明的變異堿性纖維素酶是在上述母本堿性纖維素酶中,使選自序列號1的343位377位或相當于該位置的氨基酸殘基缺失一個以上,將氨基酸殘基數(shù)215的肽插入該缺失部分的纖維素酶。缺失的氨基酸殘基只要是在序列號1的343位377位的任意連續(xù)或非連續(xù)的135個氨基酸殘基即可,優(yōu)選為在350位377位中的、更優(yōu)選為在355位365位中的、進一步優(yōu)選為357位362位中的氨基酸殘基。特別優(yōu)選為343位377位中的任意127殘基、215殘基或310殘基,355位377位中的任意18殘基、36殘基或所有氨基酸殘基,357位362位中的任意2殘基、25殘基或所有氨基酸殘基。發(fā)明人推定該序列號1的343位377位的氨基酸區(qū)域為,根據(jù)利用同源模擬的立體構造解析(OzawaW尸raWw£"g.,14,501-504,2001),是存在于較大偏離于Egl-237的活性中心的位置,自由度高且與纖維素酶構造的維持密切相關的形成環(huán)狀構造的局部區(qū)域。而就辨識"相當于序列號1的343位377位的位置的氨基酸殘基"的方法而言,可通過例如使用Lipman-Pearson法等公知算法比較氨基酸序列,賦予存在于各堿性纖維素酶的氨基酸序列中的保存氨基酸殘基最大同源性進行。通過用這樣的方法排列纖維素酶的氨基酸序列,就可在不受氨基酸序列中的插入、缺失影響地對相同氨基酸殘基在各纖維素中的序列中的位置進行定位(圖lalc)。發(fā)明人推測,假設存在于三維構造中的相同位置定義為相同位置,則具有與對象纖維素酶的特性相關的類似效果。例如,如表示上述Egl-1139、Egl-64、Egl-N131b的相當于以序列號1表示的具有氨基酸序列的纖維素酶(Egl-237)的357位362位的位置,則如下表l所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>應插入該缺失部位的肽,可由20種必需氨基酸的任一種構成,優(yōu)選含有丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸,特別優(yōu)選為含有丙氨酸、丙氨酸和組氨酸、丙氨酸和精氨酸。而構成肽的氨基酸殘基的數(shù)目優(yōu)選為215,更優(yōu)選為210,進一步優(yōu)選為26,特別優(yōu)選為3。這類肽的優(yōu)選例,可以舉出例如天冬氨酸-蘇氨酸-丙氨酸-纈氨酸-甘氨酸-異亮氨酸、丙氨酸-絲氨酸-蛋氨酸-亮氨酸-苯基丙氨酸-谷氨酸、半胱氨酸-亮氨酸-甘氨酸-組氨酸-絲氨酸、酪氨酸-谷氨酸-賴氨酸-丙氨酸-丙氨酸、天冬氨酸-蛋氨酸-異亮氨酸-纈氨酸、異亮氨酸-蘇氨酸-脯氨酸-賴氨酸、甘氨酸-亮氨酸-半胱氨酸、絲氨酸-纈氨酸-苯基丙氨酸,其中,尤其優(yōu)選為兩端有丙氨酸殘基的36殘基的肽,更優(yōu)選為丙氨酸-任一氨基酸-丙氨酸,特別優(yōu)選為丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸、丙氨酸-組氨酸-丙氨酸或丙氨酸-精氨酸-丙氨酸。另外,本發(fā)明的變異堿性纖維素酶只要不喪失堿性纖維素酶活性和可變異性,則上述變異還包括氨基酸序列中1多個氨基酸殘基缺失、取代或加成。本發(fā)明的變異堿性纖維素酶還可例如利用下述方法向母本堿性纖維素酶導入目標變異。艮P,可對培養(yǎng)母本堿性纖維素酶而得的培養(yǎng)液進行離心分離,從中分離出菌體,調制含有來自該菌體的堿性纖維素酶遺傳基因的染色體DNA(例如,按照Marmar法UMo/.5/o/.,3,208-212,1961)或齋藤和三浦的方法說'op/2".Jcto,72,619-629,1963)),使用鳥槍克隆法或PCR法就可克隆對母本堿性纖維素酶(例如具有以序列號l表示的氨基酸序列的堿性纖維素酶)進行編碼的遺傳基因(序列號2)。向克隆的遺傳基因導入變異,使用含變異遺傳基因的質體,對適當?shù)乃拗骶M行轉化,培養(yǎng)轉化株,從而由該培養(yǎng)物得到本發(fā)明的變異堿性纖維素酶。將變異導入編碼親性纖維素酶的方法,可使用位點特異性誘變法等。例如,可使用日本Takara公司的"位點直接突變系統(tǒng)突變快速套件(Site-DirectedMutagenesisSystemMutan-SuperExpressKmkit)"等。導入了變異的堿性纖維素酶遺傳基因可嵌入適當?shù)拿浇槲?。可用于本發(fā)明的媒介物,可使用任意物質,只要可保持在宿主菌內(nèi)的復制,能表達堿性纖維素酶遺傳基因,可穩(wěn)定保持嵌入的該遺傳基因即可。例如,以芽孢桿菌屬細菌為宿主時,可舉出pUBllO、pHY300PLK等,以大腸菌為宿主時,可舉出pUC18、pUC19、pBR322或pHY300PLK等。為使采用如此得到的重組媒介物進行宿主菌的轉化,可使用原生質法、感受態(tài)細胞法和電穿孔法。對宿主菌無特別限制,可以舉出芽孢桿菌屬(枯草桿菌)等的革蘭氏陽性菌,大腸桿菌(&Wen'c/n'aco//)等革蘭氏陰性菌,鏈霉菌屬(Sfreptomw",放線菌)、酵母菌屬(&cc/7aram_ycw,酵母)、曲霉菌屬(A/^g///w,霉菌)等菌屬的真菌。所得轉化體可在使用能用于孵化的包括碳源、氮源、金屬鹽、維生素等的培養(yǎng)基的情況下,在適當條件下培養(yǎng)。利用通常方法,從如此得到的培養(yǎng)液中分離出酶,并精制,通過凍結干燥、噴霧干燥、結晶,即可得到所需酶形態(tài)。如此得到的變異堿性纖維素酶的最優(yōu)反應pH值高于母本堿性纖維素酶,優(yōu)選為移向pH9.09.5、更優(yōu)選為pH9.510.0的高堿性側。并優(yōu)選為除變異堿性纖維素酶的最優(yōu)反應pH值之外,保持著上述母本堿性纖維素酶其它性質。實施例實施例lEgl-237環(huán)狀區(qū)域的改變以結晶構造己被解析的CelK的解析數(shù)據(jù)為基礎,通過同源模擬構筑Egl-237的分子模版,模版構造的精密化通過3D-1D、XPLORE和PROCHECK程序進行。然后,根據(jù)所得信息,使環(huán)狀構造內(nèi)的部分氨基酸(357號甘氨酸362號蘇氨酸)缺失,同時導入新丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸、丙氨酸-組氨酸-丙氨酸及丙氨酸-精氨酸-丙氨酸。該環(huán)狀區(qū)域的變異,分別使用變異導入引物1、2、3(序列號3、4、5),反義引物使用變異導入引物4(序列號6)。在丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸的變異導入中,將在pHY300PLK中重組的Egl-237遺傳基因用作模版DNA。而對于丙氨酸-組氨酸-丙氨酸及丙氨酸-精氨酸-丙氨酸的變異導入,將在pHY300PLK中重組的丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸變異體質體用作模版DNA。具體而言,將模版DNA質體0.5pL(10ng)、變異導入用引物20pL(lpM)、反義引物20pL(lpM)、10倍濃度的PCR用緩沖液10pL、10mM脫氧核苷三磷酸(dNTP)混合液8|aL、/>o6eWDNA聚合酶0.5|xL(2.5單位,Takara)和去離子水39.5|iL混合后,用"geneampPCRsystem9700"(Amersham-Pharmacia)實施PCR。反應條件為,經(jīng)94。C的兩分鐘熱改性后,在94°C-1分鐘、60°C-1分鐘、72°C-1.5分鐘(30次循環(huán))和72°C-3分鐘的條件下進行。用"GfXPC7DA^aw/Ge/尸wnyc加》w尺"(Amersham-Pharmacia)"精制所得PCR產(chǎn)物(43.5|iL),然后添加5.5pL的IO倍濃度的磷酸化用緩沖液和l^L(IO單位)多核苷酸激酶,在37。C下進行1小時磷酸化反應后,進行精制。將模版DNA質體2nL(20ng)、10倍濃度的PCR用緩沖液10pL、10mMdNTP混合液8pL、/yo&wDNA聚合酶lpL(5單位)和去離子水54pL與磷酸化的PCR產(chǎn)物25pL混合,然后進行PCR。反應條件為,經(jīng)94"C的2分鐘熱改性后,在94'C-1分鐘、58"C-1分鐘、72'C-6分鐘(30次循環(huán))和72°C-12分鐘的條件下進行。精制所得PCR產(chǎn)物后(43L),添加5.5pL的10倍濃度的磷酸化用緩沖液和lpL(10單位)的多核苷酸激酶,在37'C下進行1小時磷酸化反應。使利用乙醇沉淀而回收的10pL的DNA溶液,在使用//g加'o"始v^2(Takara)、16"C的條件下,進行18小時連接反應,自封閉成環(huán)后,再利用乙醇沉淀回收DNA混合液。實施例2轉化法使用實施例1所得DNA混合液5nL,導入枯草桿菌ISW1214菌株,得到轉化體(ChangandCohen,Mo/.Ge".Ge"[,168,111,1979)。將由該方法得到的原生質體涂沫在含四環(huán)素(15pg/mL,Sigma)的DM3再生瓊脂培養(yǎng)基(0.8%(w/v),瓊脂,和光純藥;0.3M琥珀酸二鈉六水合物,0.5%酪蛋白氨基酸,Difco;0.5%酵母提取物;0.35%KH2PO4;0.15%K2HPO4;0.5%葡萄糖;0.4%MgCl2.6H2O;0.01%牛血清蛋白,Sigma;0.5%CMC,關東化學;0.005%臺盼藍,Merck;及氨基酸混合液,亮氨酸、蛋氨酸10pg/mL)上,在30'C下培養(yǎng)72小時,得到轉化體。在DM3再生瓊脂平板培養(yǎng)基上,在3(TC下,將形成菌鞘層(halo)的轉化體用含四環(huán)素(15pg/mL)的胨培養(yǎng)基(3%胨S;3%麥芽糖;0.5%魚肉提取物,和光純藥;0.1%酵母提取物;0.1%KH2PO4;0.02%MgS(V7H2O)搖動培養(yǎng)15小時,收集菌體后,用"MicroPrepPlasmidPurificationkit"(Amersham-Pharmacia)回收質體并精制。使用377DNA序列儀(AppliedBiosystems)確認插入所取得的質體中的纖維素酶遺傳基因的變異序列。為能破譯變異導入附近區(qū)域,選用適當?shù)男蛄袃x用引物,進行堿基序列破譯,甄選導入的目標變異質體。實施例3纖維素酶變異體的生產(chǎn)在30'C下經(jīng)72小時,使用含3。/。胨S(日本制藥制)、0.5%魚肉提取物、0.05%酵母提取物、0.1%KH2PO4、0.02%MgS(V7H2O、四環(huán)素(15嗎/mL)及5%麥芽糖的培養(yǎng)基,培養(yǎng)及ISW1214宿主菌株。培養(yǎng)各種變異體的結果是環(huán)狀區(qū)域變異體丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸的纖維素酶活性量為36800U/L,丙氨酸-組氨酸-丙氨酸纖維素酶活性量為34700U/L,丙氨酸-精氨酸-丙氨酸的纖維素酶活性量為32400U/L。纖維素酶活性用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測定。即,將O.lmL適當稀釋的酶液加入含0.2mL的0.5M甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH9.0)、0.4mL的2.5。/0(w/v)羧甲基纖維素(A01MC,日本制紙)、0.3mL的去離子水的反應液中,在40。C下反應20分鐘,然后添加lmL的二硝基水楊酸試劑(0.5%二硝基水楊酸、30%羅謝爾鹽、1.6%氫氧化鈉水溶液),在沸水中進行5分鐘的還原糖顯色。在冰水中急冷,添加4mL的去離子水,測定535nm的吸光度,求得還原糖的生成量。將二硝基水楊酸試劑加入未加酶液處理的反應液中,然后添加酶液,同樣進行顯色反應,得到空白樣品。以在上述反應條件下l分鐘內(nèi)相當于生成l]imol葡萄糖的還原糖量,為1單位(1U)酶。實施例4重組纖維素酶環(huán)狀修飾體的精制用去離子將重組纖維素酶環(huán)狀修飾體的培養(yǎng)上清液稀釋到10倍,然后點涂至用lOmM三氨基甲烷鹽酸緩沖液(pH8.0)預平衡的DEAEToyopearl柱(Tosoh,2.5cmX5cm)中。用該緩沖液洗凈柱后,利用該緩沖液中00.4M氯化鈉400mL的直線濃度梯度,使蛋白質溶離。目標重組纖維素酶環(huán)狀修飾體在氯化鈉濃度0.25M附近,以近乎單組份地電泳溶離。脫鹽濃縮時,使用超級過濾膜(PMIO,Millipore)。實施例5重組纖維素酶修飾體的最優(yōu)反應pH值使用實施例4所得重組纖維素酶修飾體的精制樣品,研究pH值對酶反應的影響。使用甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH8.210.9)研究最優(yōu)反應pH值后,結果判定重組野生型纖維素酶的最優(yōu)反應pH值為9.0,而丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸變異體的纖維素酶的最優(yōu)反應pH值為10,向高堿性側移動了lpH單位(圖2)。另外,丙氨酸-組氨酸-丙氨酸變異體及丙氨酸-精氨酸-丙氨酸變異體的最優(yōu)反應pH值在9.6附近,且以最優(yōu)pH值9.6的活性為100%時,pH8.8pH9.9的相對活性值為95%以上,與母本纖維素酶或丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸變異體相比,得到提高。產(chǎn)業(yè)實用性本發(fā)明的變異堿性纖維素酶具有接近洗滌液中的pH值(pH10.5附近)的最優(yōu)pH值,適于用作洗滌用酶。序列表<110>花王株式會社<120>變異堿性纖維素酶<130>P〈150〉JPP2002-124474<151〉2002-04-25<160〉6<170>PatentlnVer.2.1<210>1<211>824<212>PRT<213>芽孢桿菌sp.KSM-S237(Sac』77us印.KSM-S237)〈400>1MetMetLeuArgLysLysThrLysGinLeulieSerSerlieLeulie151015LeuValLeuLeuLeuSerLeuPheProAlaAlaLeuAlaAlaGluGly202530AsnThrArgGluAspAsnPheLysHisLeuLeuGlyAsnAspAsnVal354045LysArgProSerGluAlaGlyAlaUuGinLeuGinGluValAspGly5055GinMetThrLeuValAspGin6570MetSerThrHisGlyLeuGin85AlaTyrLysAlaLeuSerAsn100AlaMetTyrValGlyGluAsn115LysGinArgVallieAspGly130135TyrVallieValAspTrpHis145150ProValTyrAlaGlyAlaLys165TyrProAsnAsnProHislielieTyrGluLeu180185SerAsnAsnAsnGlyGlyAlaGlylieProAsn195200LysAlaValLysGluTyrAlaAspProlieVal210215SerGlyAsnAlaAspAspAsnlielielieVal225230235SerGinArgProAspLeuAlaAlaAspAsnPro24525060GlyGluLyslieGinLeuArgGly7580PheProGlulieLeuAsnAspAsn9095TrpAspSerAsnMetlieArgLeu105110TyrAlaThrAsnProGluLeulie125GluLeuAlalieGluAsnAspMet140GlyAspProArgAsp160GlulieAlaAlaLeu175AlaAsnGluProSer190AsnGluGluGlyTrp205GluMetLeuArgLys220GlySerProAsnTrp240lieAspAspHisHis255HisTrpAspGly120lieValHisAlaPro155AspPhePheArg170ThrMetTyrThrValHisPheTyrThrGlySerHisAlaAlaSerThr260265270GluSerTyrProSerGluThrProAsnSerGluArgGlyAsnValMet275280285SerAsnThrArgTyrAlaLeuGluAsnGlyValAlaValPheAlaThr290295300GluTrpGlyThrSerGinAlaSerGlyAspGlyGlyProTyrPheAsp305310315320GluAlaAspValTrplieGluPheLeuAsnGluAsnAsnlieSerTrp325330335AlaAsnTrpSerLeuThrAsnLysAsnGluValSerGlyAlaPheThr340345350ProPheGluLeuGlyLysSerAsnAlaThrAsnLeuAspProGlyPro355360365AspHisValTrpAlaProGluGluLeuSerLeuSerGlyGluTyrVal370375380ArgAlaArglieLysGlyValAsnTyrGluProlieAspArgThrLys385390395柳TyrThrLysValLeuTrpAspPheAsnAspGlyThrLysGinGlyPhe405410415GlyValAsnSerAspSerProAsntysGluLeulieAlaValAspAsn420425430GluAsnAsnThrLeuLysValSerGlyLeuAspValSerAsnAspVal435440445SerAspGlyAsnPheTrpAlaAsnAlaArgLeuSerAlaAsnGlyTrp450455柳GlyLysSerValAsplieLeuGlyAlaGluLysLeuThrMetAspVal465470475480lieValAspGluProThrThrValAlalieAlaAlalieProGinSerSerLysSerGly500GluAspPheVal515lieThrGlyGlu530GluAspAsnAsn545AlaAspVallieGlulieProVal580ValPheGluAsp595GlyValLysThr610LeuSerTrpGlu625AlaThrAlaProGluAsnAspTyr660ThrGluGlyAla675GlyTyrTrpVal690485490TrpAlaAsnProGluArg505GinGinThrAspGlyLys520AspAlaProAsnLeuLys535MetAsnAsnlielieLeu550TyrLeuAspAsnlieLys565570ValHisAspProLysGly585GlyThrArgGinGlyTrp600AlaLeuThrlieGluGlu615PheGlyTyrProGluVal630ArgLeuAspPheTrpLys645650ValAlaPheAspPheTyr665MetAsnlieAsnLeuVal680GinAlaProLysThrTyr695495AlaValArgValAsnAla510TyrLysAlaGlyLeuThr525AsnlieAlaPheHisGlu540PheValGlyThrAspAla555560VallieGlyThrGluVal575GluAlaValLeuProSer590AspTrpAlaGlyGluSer605AlaAsnGlySerAsnAla620LysProSerAspAsnTrp635640SerAspLeuValArgGly655LeuAspProValArgAla670PheGinProProThrAsn685ThrlieAsnPheAspGlu700LeuGluGluAlaAsnGinValAsnGlyLeuTyrHisTyrGluValLys705710715720lieAsnValArgAsplieThrAsnlieGinAspAspThrLeuLeuArg725730735AsnMetMetlieliePheAlaAspValGluSerAspPheAlaGlyArg740745750ValPheValAspAsnValArgPheGluGlyAlaAlaThrThrGluPro755760765ValGluProGluProValAspProGlyGluGluThrProProValAsp770775780GluLysGluAlaLysLysGluGinLysGluAlaGluLysGluGluLys785790795800GluAlaValLysGluGluLysLysGluAlaLysGluGluLysLysAla805810815ValLysAsnGluAlaLysLysLys820<210>2<211>2475<212>腿<213>芽孢桿菌印.KSM-S237<220〉<221>CDS<222>(l)..(2475)<400〉2atgatgtta3gaaagaaaacaaagcagttgatttcttccattMetMetLeuArgLysLysThrLysGinLeulieSerSerlie15ttagttLeuValttaLeu3CtAsnThr333cgcLysArg50GinMet65cgtArg35cctProcttetaLeuLeu20gaagacGluAsptctSer33tAsn10ttatttccggcagetcttgcagcaLeuPheProAlaAlaLeuAlaAla2530catttattaggtaatgacHisLeuLeuGlyAsnAsp45cttattLeulie15g犯ggaGluGlytctgagSerGlugetAlatttaaaPheLys40ggcgcaGlyAla55satAsngttValThrttagtaLeuValg3tC33C3tAspGinHisttacaattacaaLeuGinLeuGin60ggagaa3883ttGlyGluLyslieg33gtcGluValg3tAspgg3Glytt3CgtGinLeuArg7075Gly80atgagtacacacggattacagtggtttcctgagateMetSerThrHisGlyUuGinTrpPheProGlulie859095gcatacaaagetctttctaacgattgggattccaatatgattcgtcttAlaTyrLysAlaLeuSerAsnAspTrpAspSerAsnMetlieArgLeu4896144192240ttgsatg3t犯c288LeuAsnAspAsn336100105110getatgtatgtaggtgaaaatgggtacgetacaaaccctgagttaate384AlaMetTyrValGlyGluAsnGlyTyrAlaThrAsnProGluLeulie115120125aaacaaagagtgattgatggaattgagttagcgattgaaaatgacatg432LysGinArgVallieAspGlylieGluLeuAlalieGluAsnAspMet130135140tatgttattgttgactggcatgttcatgcgccaggtgatcctagagat480TyrVallieValAspTrpHisValHisAlaProGlyAspProArgAsp145150155160cctgtttatgcaggtgetaaagatttctttagagaaattgcagettta528ProValTyrAlaGlyAlaLysAspPhePheArgGlulieAlaAlaLeu165170175taccctaataatccacacattatttatgagUagcgaatgagccgagt576TyrProAsnAsnProHislielieTyrGluLeuAlaAsnGluProSer180185190agtaataataatggtggagcagggattccgaataacgaagaaggttgg624SerAsnAsnAsnGlyGlyAlaGlylieProAsnAsnGluGluGlyTrp195200205aaagcggtaaaagaatatgetgatccaattgtagaaatgttacgtaaa672LysAlaValLysGluTyrAlaAspProlieValGluMetLeuArgLys210215220ageggtaatgcagatgacaacattateattgttggtagtccaaactgg720SerGlyAsnAlaAspAspAsnlielielieValGlySerProAsnTrp225230235240agtcagcgtccggacttagcagetgataatccaattgatgatcaccat768SerGinArgProAspLeuAlaAlaAspAsnProlieAspAspHisHis245250255acaatgtatactgttcacttctacsetggtteacatgetgetteaact816ThrMetTyrThrValHisPheTyrThrGlySerHisAlaAlaSerThr260265270gaaagetatccgtctgaaactcctaactctgaaagaggaaacgtaatg864GluSerTyrProSerGluThrProAsnSerGluArgGlyAsnValMet275280285agtaacactcgttatgcgttagaaaacggagtagcggtatttgcaaca912SerAsnThrArgTyrAlaLeuGluAsnGlyValAlaValPheAlaThr2卯295300gagtggggaacgagtcaagetagtggagacggtggtccttacUtgat960GluTrpGlyThrSerGinAlaSerGlyAspGlyGlyProTyrPheAsp305310315320gasgcag3tgtatggattgssttttt3aatgaaascssc3tt3gctggGluAlaAspValTrplieGluPheLeuAsnGluAsnAsnlieSerTrp325330335getaactggtctttaacgaataaaaatgaagtatctggtgcatttacaAlaAsnTrpSerLeuThrAsnLysAsnGluValSerGlyAlaPheThr340345350ccattcgagProPheGlu355ttaggtaagLeuGlyLystctaacSerAsn360gC33CC33tCttAlaThrAsnLeuAsp365CC3ggtCC3ProGlyProgatcatgtgtgggcaccagaagaattaagtctttctggagaatatgtaAspHisValTrpAlaProGluGluLeuSerLeuSerGlyGluTyrVal370375380cgtgetcgtattaaaggtgtgaactatgagccaategaccgtacaaaaArgAlaArglieLysGlyValAsnTyrGluProlieAspArgThrLys385390395400tacacgaaagtactttgggactttaatgatggaacgaagcaaggatttTyrThrLysValLeuTrpAspPheAsnAspGlyThrLysGinGlyPhe405410415ggagtgaatteggattctccaaataaagaacttattgcagttgataatGlyValAsnSerAspSerProAsnLysGluLeulieAlaValAspAsn4204254301008105611041152120012481296g3333C33CGluAsnAsn435tC8gatggcSerAspGly450gg33333gtGlyLysSer465attgttgatlieValAsp3CtThr33CAsngttValttgLeuttcPheg3tAspg33Glu3gt3333gtgg3SerLysSerGly500gaagattttgtcGluAspPheVal515aaagttLysValtegggattagatSerGlyLeuAsp440CC3Pro485tggTrptgggetTrpAla455attttalieLeu4703Cg3CgThrThraatgetcgtAsnAlaArgcttLeuggtgetgagGlyAlaGlugtagetattValAlalie490cagGingt3Val33gLys475gcgAlatctSer柳cttLeugcgAlagcaaatccagagcgtgetAlaAsnProGluArgAla505caaacggacggtaagtatGinThrAspGlyLysTyr520agtaacgatgttSerAsnAspVal445gccaacggttggAlaAsnGlyTrp1344gttVal3C33tgg3tgttThrMetAspVal480attccacaaagtlieProGinSer495Cg3gtg33CgcgArgValAsnAla510aaagetggattaacaLysAlaGlyLeuThr525attacaggagaagatgetcctaacetaaaaaatategettttcatgaalieThrGlyGluAspAlaProAsnUuLysAsnlieAlaPheHisGlu139214401488153615841632530gaagatGluAsp545getgacAlaAsp535aacaatatgaacaacateAsnAsnMetAsnAsnlie550gttValg333ttGlulieCC3ProgtttttValPheg33Glu595atttaclieTyr565gttgttValVal580g3CggtAspGlyggtgtgaaaGlyValLys610ttagataacLeuAspAsn3C3getThrAlaattctglieLeucatgatccaHisAspPro3tt333lieLys570aaaggaLysGly585540ttcgtgggaactgatPheValGlyThrAsp555gt33ttgg33C3g33VallieGlyThrGlu575gC3Ala560gttValg33gCtgttGluAlaValacacgtcaaThrArgGin600tt33C33ttLeuThrlieggttgggactggGlyTrpAspTrpgaagaagcasacGluGluAlaAsngetAla605ggtGlycttcctLeuPro590ggagagGlyGlutctSertctSertCt33CgcgSerAsnAlattateatgggaatttLeuSerTrpGluPhe625615620ggatatccagaagtaaaacctGlyTyrProGluValLysPro6306353gtSerg3t33CtggAspAsnTrp640168017281776182418721920gcaacagetccacgtttagatttctggaaatctgacttggttcgcggt1968<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>gtctttgtagataatgttcgttttgagggggetgetactactgagccg2304ValPheValAspAsnValArgPheGluGlyAlaAlaThrThrGluPro755760765gttgaaccagagccagttgatcctggcgaagagacgccacctgtcgat2352ValGluProGluProValAspProGlyGluGluThrProProValA印770775780gagaaggaagcgaaaaaagaacaaaaagaagcagagaaagaagagaaa2400GluLysGluAlaLysLysGluGinLysGluAlaGluLysGluGluLys785790795800gaagcagtaaaagaagaaaagaaag33getaaagaagaaaagaaagca2448GluAlaValLysGluGluLysLysGluAlaLysGluGluLysLysAla805810815gtcaaaaatgaggetaagaaaaaataa2475ValLysAsnGluAlaLysLysLys820<210>3<2U〉54<212>DNA〈213〉人工序列<400〉3gtgcatttacaccattcgagttagctggcgcaaatcttgacccaggtccagate54<210>4〈211>34〈212〉DNA<213>人工序列<400>4ccattcgagttagctcacgcaaatcttgacccagM<210>5〈211>34<212>瞧<213>人工序列<400>5ccattcgagttagctcgtgcaaatcttgacccag34<210>6<211>31<212>脆〈213〉人工序列<400>6caataacatccattgtaagcttctcagcacc3權利要求1.一種變異堿性纖維素酶,其特征在于,它是通過從具有序列號1的氨基酸序列或顯示與其具有至少95%的同源性的同源氨基酸序列的纖維素酶中,使含有選自序列號1的343位~377位或所述同源氨基酸序列的相應位置的一個或多個氨基酸殘基的肽缺失,并且用具有2~15個氨基酸殘基的插入肽取代所述肽而得到,其中所述變異堿性纖維素酶具有堿性纖維素酶活性。2.如權利要求1所述的變異堿性纖維素酶,其特征在于,通過使含有選自序列號1的357位362位或所述同源氨基酸序列的相應位置的一個或多個氨基酸殘基的肽缺失,并且用具有25個氨基酸殘基的插入肽代替所述肽而得到。3.如權利要求1所述的變異堿性纖維素酶,其特征在于,通過從序列號1的357位362位或從所述同源氨基酸序列的相應位置中使含有全部氨基酸殘基的肽缺失,并且用具有3個氨基酸殘基的插入肽代替所述肽。4.如權利要求1所述的變異堿性纖維素酶,其特征在于,所述插入肽含有丙氨酸和甘氨酸、丙氨酸和組氨酸、或丙氨酸和精氨酸作為結構氨基酸殘基。5.如權利要求1所述的變異堿性纖維素酶,其特征在于,所述插入肽選自丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸、丙氨酸-組氨酸-丙氨酸或丙氨酸-精氨酸-丙氨酸。6.對權利要求1所述的變異堿性纖維素酶進行編碼的遺傳基因。7.含有權利要求6所述的遺傳基因的重組載體。8.含有權利要求7所述的重組載體的分離轉化的微生物。9.一種制造變異堿性纖維素酶的方法,其特征在于,包括在培養(yǎng)基中以適于生產(chǎn)和集聚所述變異堿性纖維素酶的條件和一定的時間培養(yǎng)如權利要求8所述的分離轉化的微生物,并分離所述變異堿性纖維素酶。10.如權利要求1所述的變異堿性纖維素酶,其特征在于,所述同源氨基酸序列顯示與所述序列號1的氨基酸序列有至少98%的同源性。11.如權利要求10所述的變異堿性纖維素酶,其特征在于,通過使含有選自序列號1的357位362位或所述同源氨基酸序列的相應位置的一個或多個氨基酸殘基的肽缺失,并且用具有25個氨基酸殘基的插入肽代替所述肽而得到。12.如權利要求10所述的變異堿性纖維素酶,其特征在于,通過從序列號1的357位362位或從所述同源氨基酸序列的相應位置中使含有全部氨基酸殘基的肽缺失,并且用具有3個氨基酸殘基的插入肽代替所述肽而得到。全文摘要本發(fā)明的變異堿性纖維素酶,其特征在于,它是通過從具有序列號1的氨基酸序列或顯示與其具有至少95%的同源性的同源氨基酸序列的纖維素酶中,使含有選自序列號1的343位~377位或所述同源氨基酸序列的相應位置的一個或多個氨基酸殘基的肽缺失,并且用具有2~15個氨基酸殘基的插入肽取代所述肽而得到,其中所述變異堿性纖維素酶具有堿性纖維素酶活性。文檔編號C12N15/63GK101104849SQ20071000651公開日2008年1月16日申請日期2003年4月25日優(yōu)先權日2002年4月25日發(fā)明者小林徹,小澤忠弘,袴田佳宏申請人:花王株式會社
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1
龙井市| 怀远县| 普陀区| 怀来县| SHOW| 玉林市| 临颍县| 兰坪| 胶南市| 舞钢市| 定西市| 麟游县| 广河县| 大邑县| 胶南市| 邢台市| 巴林右旗| 桃园市| 富裕县| 仪陇县| 扎鲁特旗| 东兴市| 麦盖提县| 安龙县| 元氏县| 定南县| 葵青区| 巴青县| 南召县| 黑龙江省| 辉南县| 温泉县| 扎兰屯市| 门源| 永清县| 汤阴县| 突泉县| 甘南县| 西乡县| 德钦县| 于田县|