專利名稱：：絲狀菌孢子的制造方法及植物病害防治方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及與植物病害的防治相關(guān)的4支術(shù)。更詳細(xì)地說(shuō)，涉及可以形成足以作為青霉屬菌的微生物農(nóng)藥或材料的實(shí)用化的充分量的孢子的技術(shù)。
背景技術(shù)：
：化學(xué)農(nóng)藥是對(duì)于植物的病蟲(chóng)害防治的一種不可或缺的手段，為穩(wěn)定的食物生產(chǎn)作出了很大的貢獻(xiàn)。但是，近年來(lái)逐漸出現(xiàn)了由于化學(xué)農(nóng)藥的大量施用而產(chǎn)生的抗藥性病蟲(chóng)害的發(fā)生或環(huán)境負(fù)荷的問(wèn)題。以此為背景，近年來(lái)利用設(shè)想對(duì)環(huán)境的負(fù)荷比上述化學(xué)農(nóng)藥更低的樣i生物的，也被稱為"生物農(nóng)藥(Biologicalagrochemicals)"的生物防治的研究取得進(jìn)展，其部分已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了實(shí)用化。作為被期望用于上述生物農(nóng)藥的微生物，已知有例如青霉屬菌等絲狀菌。其中，作為青霉屬菌的完全世代的黃藍(lán)狀菌屬(Talaromyces屬)，已經(jīng)作為草莓炭疽病或白粉病用的農(nóng)藥用殺菌劑被利用(黃藍(lán)狀菌(Talaromycesflavus)水合劑，農(nóng)林水產(chǎn)省第20659號(hào))。專利文獻(xiàn)1公開(kāi)了對(duì)草莓炭疽菌具有拮抗作用的黃藍(lán)狀菌。另外，專利文獻(xiàn)2中公開(kāi)了作為對(duì)芒果炭疽病具有拮抗作用的微生物擴(kuò)展青霉(Penicilliumexpansum),專利文獻(xiàn)3公開(kāi)了對(duì)灰霉菌顯示防治效果的沙門(mén)柏干酪青霉(Penicilliumcamemberti)。利用這些青霉屬菌作為微生物農(nóng)藥或材料時(shí)，可使用通過(guò)一般的液體培養(yǎng)得到的培養(yǎng)菌絲體。但是由于菌絲體與耐久性的孢子相比缺乏生存性，因而實(shí)用性不夠。因此期待一種可以大量且低廉地生產(chǎn)耐久性的孢子的技術(shù)。目前以來(lái)，作為絲狀菌的孢子形成方法，可進(jìn)行固體培養(yǎng)或液體培養(yǎng)。在進(jìn)行固體培養(yǎng)的情況下，使用米、麥、玉米等谷物類，或者麩子等來(lái)源于谷物的固體成分等，但對(duì)固體培養(yǎng)進(jìn)行滅菌需要很長(zhǎng)時(shí)間，同時(shí)也難以進(jìn)行無(wú)菌管理，另外也難以控制培養(yǎng)過(guò)程中的溫度、水分、pH等的環(huán)境因素。另外，這些固體成分與孢子間的分離很困難，且培養(yǎng)時(shí)間也長(zhǎng)，培養(yǎng)成本也高。另一方面，液體培養(yǎng)由于可利用許多的通用性培養(yǎng)裝置，因而具有滅菌容易，且培養(yǎng)中溫度、氧氣供給量、pH等的環(huán)境控制也容易這樣的優(yōu)點(diǎn)，但存在孢子形成困難的問(wèn)題。為解決該問(wèn)題，出現(xiàn)了例如使用半乳糖和/或果糖作為碳源的方法(參見(jiàn)專利文獻(xiàn)4),使用鎂鹽和/或鉀鹽作為培養(yǎng)基成分的方法(參見(jiàn)專利文獻(xiàn)5),添加果糖0.1~5%、氯化4丐0.01~0.5%、谷氨酸0.01-0.5%的絲狀菌的液體培養(yǎng)方法(參見(jiàn)專利文獻(xiàn)6)。另外，作為對(duì)絲狀菌的孢子形成有效的培養(yǎng)基，有人報(bào)導(dǎo)了在糖蜜5~20g/l、玉米漿(CSL)10-25g/1、氯化鈉5~15g/l、石危酸釣0.1~0.5g/l、石岸酸二氫鉀0.001~0.01g/l、碌l酸4美7水合物0.001~0.01g/l、石危酸銅0.001~0.005g/l、硫酸鐵0.0009~0.005g/l中含有消泡劑或瓊脂等固化劑的培養(yǎng)基(參見(jiàn)專利文獻(xiàn)7)等。進(jìn)而，已知添加鈣鹽對(duì)于青霉屬菌的孢子的形成有效(參見(jiàn)非專利文獻(xiàn)l)。專利文獻(xiàn)1:特開(kāi)平10-229872號(hào)公才艮專利文獻(xiàn)2:特開(kāi)2001-39810號(hào)7>才艮專利文獻(xiàn)3:特開(kāi)2004-231626號(hào)公才艮專利文獻(xiàn)4:特開(kāi)平9-322759號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)5:特開(kāi)平11-276158公報(bào)專利文獻(xiàn)6:特開(kāi)2000-201669號(hào)/>報(bào)專利文獻(xiàn)7:UnitedStatePatent6593127號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)1:Trans.Br.Mycol.Soc.,80(2),pp319-325,198
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在以絲狀菌作為微生物農(nóng)藥或材料而實(shí)用化時(shí)，存在根據(jù)現(xiàn)有的培養(yǎng)方法仍然難以得到足夠量的孢子形成量的技術(shù)問(wèn)題。而且，由于BSE問(wèn)題等，對(duì)于使用的培養(yǎng)基成分的碳源或氮源，希望由來(lái)源于動(dòng)物的培養(yǎng)基成分置換成安全的來(lái)源于植物的培養(yǎng)基成分。因此，本發(fā)明的目的在于提供一種可形成足以作為微生物農(nóng)藥或材料的實(shí)用化的充分量的絲狀菌孢子，并且安全的技術(shù)。解決技術(shù)問(wèn)題的手段本發(fā)明人針對(duì)液體培養(yǎng)生產(chǎn)用作微生物農(nóng)藥或材料的絲狀菌的孢子的技術(shù)，進(jìn)行了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用適合的來(lái)源于植物的成分作為培養(yǎng)基的碳源或氮源，并且向其中添加合適的無(wú)機(jī)成分，可以生產(chǎn)足以作為用于植物病害防治的微生物農(nóng)藥或材料的實(shí)用化的充分量的孢子。首先，本發(fā)明提供絲狀菌孢子的制造方法。該制造方法中，由于可利用許多的通用性培養(yǎng)裝置，因而具有滅菌容易，且培養(yǎng)中溫度、氧氣供給量、pH等的環(huán)境控制也容易等優(yōu)點(diǎn)，因此選擇液體培養(yǎng)。然后，在該液體培養(yǎng)基中，作為碳源和氮源，含有玉米漿或來(lái)源于大豆的胨，且來(lái)源于碳源和氮源的無(wú)機(jī)成分的量，由目標(biāo)絲狀菌的液體培養(yǎng)時(shí)的孢子形成個(gè)數(shù)來(lái)判斷，當(dāng)不足必需量時(shí)，首先可使其含有氯化鈣，進(jìn)而如有必要，使其含有硫酸鎂，在此基礎(chǔ)上如還有必要，使其含有磷酸氫二鉀，采用這種液體培養(yǎng)基培養(yǎng)絲狀菌，形成孢子。作為碳源和氮源的上述玉米漿或上述來(lái)源于大豆的胨，使其在液體培養(yǎng)基中含有0.1~10%,進(jìn)而作為無(wú)機(jī)成分的上述氯化鈣，使其含有0.2~5.0%,優(yōu)選0.4~3.5%。此時(shí)作為無(wú)才幾成分，在不過(guò)量的程度以內(nèi)，也可加入碌u酸鎂、石壽酸氫二鉀。用于補(bǔ)充而不至于不足培養(yǎng)基中的鎂鹽、鉀鹽的必需量。這時(shí)，希望添加至含有硫酸鎂0.001~10%,優(yōu)選0.005~5.0%。另外希望添加至含有石舞酸氬二鐘0.001~0.3%,優(yōu)選0.05~0.2%。上述絲狀菌是青霉(Penicillium)屬的絲狀菌，作為一合適例，可采用Talaromycessp.B-422(FERMBP-08516)或黃藍(lán)狀菌。對(duì)于上述兩種菌，在判斷來(lái)源于碳源和氮源的無(wú)機(jī)成分的量滿足必需量時(shí)，液體培養(yǎng)時(shí)的孢子形成個(gè)數(shù)為約108個(gè)以上在孢子制造上是有效的。因此，當(dāng)液體培養(yǎng)時(shí)的孢子形成個(gè)數(shù)低于約108個(gè)時(shí)，希望在液體培養(yǎng)基中，作為無(wú)機(jī)成分首先添加氯化鈣，必要時(shí)添加硫酸鎂，更有必要時(shí)添加磷酸氬二鐘。下面，本發(fā)明提供一種將通過(guò)使用含有玉米漿或來(lái)源于大豆的胨作為碳源和氮源、且至少含有氯化朽作為無(wú)機(jī)成分的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)絲狀菌而形成的孢子進(jìn)行回收，使該孢子接觸植物體的植物病害防治方法。此外，所謂"接觸"，是指廣義地含有向植物體散布、浸漬、混合、涂布等方法，另外也可以是將上述孢子在土壤中混合、灌注后，播種植物體種子使其"接觸"，不能狹義地解釋。此時(shí)，作為無(wú)機(jī)成分，在不過(guò)量的程度以內(nèi)，也可在上述液體培養(yǎng)基中加入磷酸氫二鉀、硫酸鎂。用于補(bǔ)充而不至于不足培養(yǎng)基中的鎂鹽、鉀鹽的必需量。這時(shí)，希望添加至含有石危酸鎂0.001~10%,優(yōu)選0.005-5.0%。另外希望添加至含有磷酸氬二鉀0.001~0.3%,優(yōu)選0.05-0.2%。此外，上述本發(fā)明中，所謂"玉米漿(CornSteepLiquor:簡(jiǎn)稱CSL),是指制糖(玉米淀粉)制造過(guò)程中產(chǎn)生的有機(jī)副產(chǎn)物。所謂"來(lái)源于大豆的胨"，是將大豆蛋白質(zhì)通過(guò)蛋白質(zhì)分解酶或酸部分地水解而得到的產(chǎn)物，以寡肽、氨基酸為主要成分。它們中的任何一種，在絲狀菌的培養(yǎng)中都作為供給碳源和氮源的有機(jī)成分而發(fā)揮作用。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明的方法培養(yǎng)青霉屬絲狀菌，可大量且低廉地產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)一般液體培養(yǎng)中難以形成的絲狀菌孢子。用本方法得到的孢子，作為微生物農(nóng)藥和生物材料有用。另外由于未使用任何動(dòng)物性的有機(jī)成分來(lái)培養(yǎng)，因而無(wú)BSE問(wèn)題，是安全的。具體實(shí)施例方式下面，對(duì)于本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明。此外本發(fā)明并不狹義地限定于以下說(shuō)明的實(shí)施方式或?qū)嵤├?。首先，本發(fā)明中作為絲狀菌孢子的液體培養(yǎng)所采用的碳源和氮源，使用玉米漿、或者來(lái)源于大豆的胨。根據(jù)情況也可以使用上述兩種?？梢允褂么蠖狗刍螯S豆面等，但會(huì)導(dǎo)致其與培養(yǎng)后孢子的分離變得困難。另外動(dòng)物性胨得不到充分的孢子形成量。對(duì)于"玉米漿"沒(méi)有特別限定，但可適當(dāng)使用例如昭和產(chǎn)業(yè)公司制、北海道糖業(yè)公司制、日本食品化工公司制、Oriental酵母公司制(乂/k卩7AST、095MPE等)等。對(duì)于"來(lái)源于大豆的胨"也沒(méi)有特別限定，但可使用例如日本制藥公司制Polypeptone-S等。玉米漿或來(lái)源于大豆的胨的合適的添加量為0.1%~10%、優(yōu)選0.5~10%、更優(yōu)選1~5%。添加過(guò)量的量，會(huì)增加不溶物的沉淀，與孢子的分離變得困難。本發(fā)明中，僅僅添加玉米漿或來(lái)源于大豆的胨，就可生產(chǎn)充分量的孢子，但通常也可進(jìn)一步添加一般使用的碳源。例如可進(jìn)一步添加葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、甘油、淀粉、來(lái)源于甘蔗或甜菜的廢糖蜜等。其中，主要基于價(jià)格便宜的理由，希望采用廢糖蜜。例如當(dāng)利用甜菜糖蜜時(shí)，可以使用添加了0.5°/。~10%的培養(yǎng)基。本發(fā)明中除了上述碳源和氮源，還加入碳酸或磷酸等的鹽類、鉀、鈉、鐵、鎂等的金屬鹽作為無(wú)機(jī)成分?；谇嗝箤倬鲋车谋匦枰氐睦碛?，特別優(yōu)選磷酸氬二鉀和硫酸鎂。進(jìn)而，作為促進(jìn)孢子形成的成分，添加4丐鹽。作為該釣鹽，主要基于溶解度的考慮，優(yōu)選氯化鈣。作為氯化鈣濃度，為0.2~5.0%,優(yōu)選0.4~3.5%。添加過(guò)量的氯化4丐，會(huì)增加不溶物的沉淀，與孢子的分離變得困難。此外，可自由地向培養(yǎng)基中添加各種表面活性劑作為消泡劑。通過(guò)在培養(yǎng)溫度為2(TC~40°C、優(yōu)選25。C~35°C,培養(yǎng)基的初始pH為4.0~8.0、優(yōu)選5.0~7.0,液體振蕩培養(yǎng)、基于發(fā)酵罐的通氣攪拌培養(yǎng)等需氧條件下來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，首先利用漂白棉、紗布或者玻璃棉等過(guò)濾培養(yǎng)物，除去菌絲。然后，將得到的濾液離心分離，分離孢子。加水離心分離，進(jìn)行洗滌。多次重復(fù)進(jìn)行這些工序，回收洗滌的孢子。另外，洗滌水可以使用離子交換水、蒸餾水、使用各種濾膜調(diào)配的純水、自來(lái)水等。該孢子顯示與由馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)等固體培養(yǎng)基得到的孢子相同的保存性、防治效果，可作為生物農(nóng)藥、生物材料而使用。此外，本發(fā)明中可作為培養(yǎng)對(duì)象的絲狀菌，例如為青霉屬菌絲狀菌。該青霉屬菌絲狀菌，沒(méi)有特別限定，例如可列舉Eupenicilliumsp.B隱408(FERMBP-08517)、Talaromycessp.B畫(huà)422(FERMBP畫(huà)08516)、Penicilliumsp.B-453(FERMBP-08515)、黃藍(lán)狀菌、擴(kuò)展青霉、沙門(mén)柏干酪青霉等。優(yōu)選Eupenicilliumsp.B畫(huà)408(FERMBP-08517)、Talaromycessp.B國(guó)422(FERMBP-08516)、Penicilliumsp.B-453(FERMBP-08515)、黃藍(lán)狀菌，但更優(yōu)選Talaromycessp.B-422(FERMBP-08516)或黃藍(lán)狀菌。Eupenicilliumsp.B-408(FERMBP-08517)、Talaromycessp.B隱422(FERMBP畫(huà)08516)、Penicilliumsp.B畫(huà)453(FERMBP畫(huà)08515)保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(郵政編碼305-8566日本國(guó)茨i成縣筑波市東l丁目1番地1中央代6)。實(shí)施例l實(shí)施例l中，對(duì)于菌孢子的培養(yǎng)，考察改變液體培養(yǎng)基的組成時(shí)的培養(yǎng)孢子數(shù)的不同。另外，實(shí)驗(yàn)例1至3是本發(fā)明涉及的絲狀菌孢子的制造方法。(實(shí)驗(yàn)例l)將組成為玉米漿(Oriental酵母公司制)3%、磷酸氬二鉀0.1%、硫酸鎂7水合物0.05%、氯化鉀2水合物1%(pH7.0)的培養(yǎng)基50ml分注于:300ml的三角燒瓶中進(jìn)行滅菌(120°C、20分鐘)。在PDA培養(yǎng)基中向前培養(yǎng)的Talaromycessp.B-422(FERMBP-08516)、或黃藍(lán)狀菌中加入滅菌水，調(diào)配至孢子濃度為lxl()S個(gè)/ml。在上述液體培養(yǎng)基中接種0.5ml的Talaromycessp.B-422(FERMBP-08516)孢子液、或黃藍(lán)狀菌孢子液，再在振蕩培養(yǎng)機(jī)(150rpm、25°C)中培養(yǎng)7天。培養(yǎng)結(jié)束后，利用血細(xì)胞計(jì)算盤(pán)測(cè)定孢子數(shù)。另外，黃藍(lán)狀菌是從市售的農(nóng)藥制劑分離而使用的。(實(shí)驗(yàn)例2)將組成為玉米漿(昭和產(chǎn)業(yè)公司制)3%、甜菜糖蜜(北海道糖業(yè)公司制)0.5%、磷酸氳二鉀0.1%、硫酸鎂7水合物0.05%、氯化《丐2水合物l%(pH7.0)的培養(yǎng)基50ml分注于300ml的三角燒瓶中進(jìn)行滅菌(12(TC、20分鐘)。接種0.5ml的根據(jù)實(shí)施例l調(diào)配的Talaromycessp.B-422(FERMBP-08516)孢子液、或黃藍(lán)狀菌孢子液，再在振蕩培養(yǎng)機(jī)(150rpm、25。C)中培養(yǎng)7天。培養(yǎng)結(jié)束后，利用血細(xì)胞計(jì)算盤(pán)測(cè)定孢子數(shù)。(實(shí)驗(yàn)例3)將組成為來(lái)源于大豆的胨(Peptone-S、日本制藥公司制)3%、磷酸氫二鉀0.1%、硫酸鎂7水合物0.05%、氯化釣2水合物1%(pH7.0)的培養(yǎng)基50ml分注于300ml的三角燒瓶中進(jìn)行滅菌(120°C、20分鐘)。接種0.5ml的根據(jù)實(shí)施例l調(diào)配的Talaromycessp.B-422(FERMBP-08516)孢子液、或黃藍(lán)狀菌孢子液，再在振蕩培養(yǎng)機(jī)(150rpm、25°C)中培養(yǎng)7天。培養(yǎng)結(jié)束后，利用血細(xì)胞計(jì)算盤(pán)測(cè)定孢子數(shù)。(比較實(shí)驗(yàn)例l)將組成為甜菜糖蜜(北海道糖業(yè)公司制)0.75%、玉米漿(昭和產(chǎn)業(yè)公司制)2%、氯化鈉1%、硫酸《丐0.025%、磷酸氫二鉀0.0006%、硫酸鎂7水合物0.0005%、硫酸銅0.0001%、硫酸鐵0.0002%(pH7.0)的培養(yǎng)基50ml分注于300ml的三角燒瓶中進(jìn)行滅菌(12CTC、20分鐘)。接種0.5ml黃藍(lán)狀^孢子液:再在振蕩培養(yǎng)機(jī)(150rpm、25°C)中培養(yǎng)7天。"培^結(jié)束后，利用血細(xì)胞計(jì)算盤(pán)測(cè)定孢子數(shù)。(比較實(shí)驗(yàn)例2)將組成為半乳糖2%、氯化釣2水合物2.5%、硝酸鈉0.6°/。、磷酸氬二鉀0.15%、硫酸鎂7水合物0.05%(pH7.0)的培養(yǎng)基50ml分注于300ml的三角燒瓶中進(jìn)行滅菌(120°C、20分鐘)。接種0.5ml的根據(jù)實(shí)施例l調(diào)配的Talaromycessp.B-422(FERMBP-08516)孢子液、或黃藍(lán)狀菌孢子液，再在振蕩培養(yǎng)機(jī)(150rpm、25°C)中培養(yǎng)7天。培養(yǎng)結(jié)束后，利用血細(xì)胞計(jì)算盤(pán)測(cè)定孢子數(shù)。(比較實(shí)驗(yàn)例3)將組成為果糖1%、脫脂奶粉2%、氯化釣2水合物0.2%、谷氨酸0.1%(pH7.0)的培養(yǎng)基50ml分注于300ml的三角燒瓶中進(jìn)行滅菌(12(TC、20分鐘)。接種0.5ml的根據(jù)實(shí)施例l調(diào)配的Talaromycessp.B-422(FERMBP-08516)孢子液、或黃藍(lán)狀菌孢子液，再在振蕩培養(yǎng)機(jī)(150rpm、25。C)中培養(yǎng)7天。培養(yǎng)結(jié)束后，利用血細(xì)胞計(jì)算盤(pán)測(cè)定孢子數(shù)。(比較實(shí)驗(yàn)例4)將組成為馬鈴薯葡萄糖肉湯(Difco公司制)2.4%(pH7.0)的培養(yǎng)基50ml分注于300ml的三角燒瓶中進(jìn)行滅菌(120°C、20分鐘)。接種0.5ml的才艮據(jù)實(shí)施例l調(diào)配的Talaromycessp.B-422(FERMBP-08516)孢子液、或黃藍(lán)狀菌孢子液，再在振蕩培養(yǎng)機(jī)(150rpm、25°C)中培養(yǎng)7天。培養(yǎng)結(jié)束后，利用血細(xì)胞計(jì)算盤(pán)測(cè)定孢子數(shù)。(比較實(shí)驗(yàn)例5)將組成為復(fù)合胨(日本制藥公司制)3%、磷酸氫二鉀0.1%、硫酸鎂7水合物0.05%、氯化鈣2水合物1%(pH7.0)的培養(yǎng)基50ml分注于300ml的三角燒瓶中進(jìn)行滅菌(120°C、20分鐘)。接種0.5ml的根據(jù)實(shí)施例l調(diào)配的Talaromycessp.B-422(FERMBP-08516)孢子液、或黃藍(lán)狀菌孑包子液，再在振蕩培養(yǎng)機(jī)(150rpm、25°C)中培養(yǎng)7天。培養(yǎng)結(jié)束后，利用血細(xì)胞計(jì)算盤(pán)測(cè)定孢子數(shù)。上述實(shí)驗(yàn)例l~3、及比較實(shí)驗(yàn)例l~5所得到的培養(yǎng)液中的孢子濃度如以下的"表r所示。[表l]<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>由上述"表r的結(jié)果可清楚地看到，對(duì)于任意一種菌，實(shí)施例i3中的孢子生產(chǎn)量都要顯著地比比較實(shí)驗(yàn)例i~5的孢子生產(chǎn)量多。此外，使用Talaromycessp.B-422(FERMBP-08516)時(shí)的比較實(shí)施例4、5、及使用黃藍(lán)狀菌時(shí)的比較實(shí)施例l、4、5中，孢子形成困難，呈菌絲狀(參見(jiàn)表l)。實(shí)施例2實(shí)施例2中，考察本發(fā)明的絲狀菌孢子的制造方法中所使用的最佳氯化鈣濃度。采用與實(shí)施例i的實(shí)驗(yàn)例l相同的方法，僅將氯化釣2水合物的濃度改變?yōu)?.1%、0.5%、3.0%,考察培養(yǎng)的Talaromycessp.B-422(FERMBP-08516)孢子數(shù)。結(jié)果如表2所述。[表2]<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)施例3實(shí)施例3中，考察本發(fā)明的絲狀菌孢子的制造方法中孢子數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間的變4匕。將組成為玉米漿(日本食品化工公司制)3%、磷酸氫二鉀0.1%、硫酸鎂7水合物0.05%、氯化釣2水合物1%(pH7.0)的培養(yǎng)基2L分注于3L的發(fā)酵罐中進(jìn)行滅菌U20。C、60分鐘)。在三角燒瓶中接種0.1%的前培養(yǎng)的Talaromycessp.B-422(FERMBP-08516)培養(yǎng)液，使用同樣的培養(yǎng)基在攪拌速度300rpm、溫度25。C、通氣量0.5vvm下進(jìn)行5天的培養(yǎng)。經(jīng)時(shí)取樣，利用血細(xì)胞計(jì)算盤(pán)測(cè)定孢子數(shù)。孢子數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間的變化如圖l所示。由該圖l所示的結(jié)果可知，培養(yǎng)3天的孢子數(shù)幾乎達(dá)到lxl()S個(gè)/ml。實(shí)施例4實(shí)施例4使用上述實(shí)施例3所用的培養(yǎng)基，進(jìn)行孢子的生存性的確認(rèn)。將實(shí)施例4中使用的組成的培養(yǎng)基50ml分注于300ml的三角燒瓶中進(jìn)行滅菌U20。C、20分鐘)。在PDA培養(yǎng)基中接種0.5ml的前培養(yǎng)的Talaromycessp.B-422(FERMBP-08516)孢子液，再在振蕩培養(yǎng)機(jī)(150rpm、25°C)中培養(yǎng)7天。培養(yǎng)結(jié)束后，利用漂白棉過(guò)濾培養(yǎng)液除去菌絲。將得到的濾液進(jìn)行離心分離，收集孢子。加蒸餾水離心分離，進(jìn)行洗滌。重復(fù)操作2次，回收洗滌的孢子，在自來(lái)水中調(diào)配，以使顯微鏡下計(jì)數(shù)的孢子數(shù)約為2xl()S個(gè)/ml。用于比較的固體培養(yǎng)基中形成的孢子，使用在PDA培養(yǎng)基中、25。C下、培養(yǎng)10天的孢子。向培養(yǎng)皿中加入蒸餾水用筆記錄表面后，進(jìn)行與液體培養(yǎng)的情況相同的操作，調(diào)配同樣濃度的孢子液。保持在5。C、2(TC下，測(cè)定3個(gè)月后的活菌數(shù)。得到的結(jié)果如下列"表3"所示?！?1————__—___________———_______——.——,?！猘20。C下保存35。C下j呆存3個(gè)A^、、調(diào)配后的活菌數(shù)。丄。J^丄個(gè)月后的活菌B422孢子液，、月后的活菌數(shù)處(CFU/ml),、數(shù)(CFU/ml)z、(CFU/ml)由液體培養(yǎng)基1.4x1081.7x1081.2x108的調(diào)配由固體培養(yǎng)基的調(diào)配1.5x1080.8x1081.6x108由上述"表3"所示的結(jié)果可知，液體培養(yǎng)得到的孢子顯示與固體培養(yǎng)基中得到的孢子相同的生存性。實(shí)施例5孢子:和固體培養(yǎng)孢子液的對(duì)稻惡苗病的防治效果。、^將與實(shí)施例3同樣得到的Talaromycessp.B-422(FERMBP-08516)液體培養(yǎng)孢子液和固體培養(yǎng)孢子液在5。C下保存1個(gè)月后用于本實(shí)驗(yàn)。將稻惡苗病多發(fā)農(nóng)場(chǎng)中自然感染的水稻罹病種子(2001年產(chǎn)、品種短銀坊主)以浴比1:1的比例浸漬于調(diào)配的Talaromycessp.B-422(FERMBP-08516)孢子液中24小時(shí)，然后在15。C下浸漬4天(浴比1:1),在3(TC下催芽1天后，在裝滿市售的育苗用粒狀培土(商品名〈》島u粒狀培土、林式會(huì)社Kureha制)的育苗用箱中每箱播種相當(dāng)于5g干稻殼(1區(qū)域反復(fù)3次)。然后在出芽器中，在3(TC下使其出芽3天，之后在玻璃溫室內(nèi)育苗。播種14天后考察各試驗(yàn)區(qū)的徒長(zhǎng)苗率，求出防治價(jià)值。其結(jié)果如下列"表4"所示。另外，防治價(jià)值以下列算式1計(jì)算。防治價(jià)值=(1-(處理區(qū)的徒長(zhǎng)苗率+無(wú)處理區(qū)的徒長(zhǎng)苗率))x100[表4]B422孢子液孢子濃度(個(gè)/ml)徒長(zhǎng)苗率(%)防治價(jià)值lxlOe由液體培養(yǎng)基的調(diào)配由固體培養(yǎng)基的調(diào)配無(wú)處理供試稻殼短銀坊主(2001年產(chǎn)、1.54.4100自然感染稻殼)種子處理24小時(shí)浸;:漬浸種催芽出芽15。C4天30°C1天30°C1天9996由上述"表4"所示結(jié)果可知，液體培養(yǎng)中得到的孢子顯示與固體培養(yǎng)基中得到的孢子相同的效果(防治價(jià)值)。產(chǎn)業(yè)實(shí)用性本發(fā)明可以作為制造用于植物病害防治的生物農(nóng)藥或材料中可使用的絲狀菌孢子的技術(shù)、或者植物病害技術(shù)而得到利用。是顯示實(shí)施例3的結(jié)果的圖，是顯示孢子數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間而變化的圖。權(quán)利要求1、一種絲狀菌孢子的制造方法，其使用含有玉米漿和/或來(lái)源于大豆的胨作為碳源和氮源，并且至少含有氯化鈣作為無(wú)機(jī)成分的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)絲狀菌而形成孢子。2、如權(quán)利要求1所述的絲狀菌孢子的制造方法，其特征在于上述液體培養(yǎng)基中，作為無(wú)機(jī)成分，含有磷酸氫二鉀和/或硫酸鎂。3、如權(quán)利要求1或2所述的絲狀菌孢子的制造方法，其特征在于上述液體培養(yǎng)基中，含有0.1~10%的上述玉米漿和/或來(lái)源于大豆的胨。4、如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的絲狀菌孢子的制造方法，其特征在于上述液體培養(yǎng)基中，含有0.2~5.0%的上述氯化鈣。5、如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的絲狀菌孢子的制造方法，其特征在于上述絲狀菌是青霉(Penicillium)屬的絲狀菌。6、如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的絲狀菌孢子的制造方法，其特征在于上述絲狀菌是Talaromycessp.B-422(FERMBP-08516)。7、如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的絲狀菌孢子的制造方法，其特征在于上述絲狀菌是黃藍(lán)狀菌。8、一種植物病害防治方法，其特征在于，將通過(guò)使用含有玉米漿和/或來(lái)源于大豆的胨作為碳源和氮源，并且至少含有氯化釣作為無(wú)機(jī)成分的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)絲狀菌而形成的孢子回收，再使該孢子與植物體接觸。9、如權(quán)利要求8所述的植物病害防治方法，其特征在于上述液體培養(yǎng)基中，作為無(wú)機(jī)成分，含有磷酸氫二鉀和/或硫酸鎂。全文摘要本發(fā)明提供一種由液體培養(yǎng)有效地制造一般在液體培養(yǎng)中難以形成的絲狀菌孢子，以及使用通過(guò)該方法得到的孢子的植物病害防治技術(shù)。通過(guò)使用含有玉米漿和/或來(lái)源于大豆的胨作為碳源和氮源，并且至少含有氯化鈣作為無(wú)機(jī)成分的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)絲狀菌，形成可實(shí)用化的充分量的孢子。另外，回收由此得到的絲狀菌孢子，使其與植物體接觸，有效地防治植物病害。文檔編號(hào)A01G7/00GK101415331SQ20068005420公開(kāi)日2009年4月22日申請(qǐng)日期2006年4月11日優(yōu)先權(quán)日2005年4月11日發(fā)明者三宅泰司,佐久間米子,堅(jiān)石秀明,永塚隆由申請(qǐng)人:株式會(huì)社吳羽