專利名稱：：溶酶體酶編碼基因突變相關(guān)的cns紊亂的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及治療患有與溶酶體酶例如酸性P-葡糖苷酶突變相關(guān)的神經(jīng)病學危險因素、狀況或疾病個體的方法。具體地，對個體施用溶酶體酶的特異性藥理伴侶(pharmacologicalchaperone),其增加神經(jīng)細胞中從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)到溶酶體的蛋白質(zhì)運輸，和/或伴隨增加神經(jīng)細胞中的酶活性。
背景技術(shù)：
：溶降昧貯積病(Lysosomalstoragedisorders,LSD)是一類由于缺陷型水解酶導(dǎo)致細胞中糖鞘脂、糖原或粘多糖累積所引起的常染色體隱性疾病。LSD的實例包括但不限于戈謝病(Gaucherdisease)(Beutler等人，77^3f由A0/f'cwflfA/o/ecw/flr5asesZ)/s^oye，第8版，2001Scriver等人編輯，3635-3668頁，McGraw-Hill,紐約)、Gm-神經(jīng)節(jié)苷脂貯積病(同上，3775-3810頁)、巖藻糖脊貯積病(77^^^似60/&做</^/0/""/"1*丑肪^<//"A^7te</Z>&ewe1995.Scriver,C.R.，Beaudet，A.L.，Sly，W.S.和Valle，D.編輯，2529-2561頁，McGraw-Hill,紐約)、粘多糖貯積病(同上，3421-3452頁)、龐倍氏癥(同上，3389-3420頁)、胡爾勒-沙伊病(Hurler-Scheiedisease)(Weismann等人，1970;169,72-74)、A型和B型尼曼-皮克病(r/reAfeto6o/!'c朋d5fl5^sZ)/5^ose，第8版,2001.Scriver等人編輯，3589-3610頁，McGraw-Hill,紐約)和法布里病(同上，3733-3774頁)。其他包括異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、庫夫斯病(成人型神經(jīng)元脂質(zhì)脂褐質(zhì)沉積病)和腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良。每種LSD與特定的由一個或多個突變所引起的缺陷型水解酶有關(guān)，所述的一個或多個突變導(dǎo)致該酶合成后在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中構(gòu)象不穩(wěn)定，因此，成為降解的靶標而不是通過高爾基體運輸?shù)饺苊阁w中的天然場所。幾種LSD具有顯著的神經(jīng)病學受累情況。例如，戈謝病是最常見的LSD，其與患者細胞、尤其是單核細胞和巨噬細胞中的糖鞘脂(GSL)累積有關(guān)。這種異常的GSL增加產(chǎn)生于溶酶體酶酸性p-葡糖苷酶(Gba;葡糖腦苷脂酶)的遺傳缺陷(突變)，酸性P-葡糖苷酶是一種可以分解GSL葡萄糖神經(jīng)酰胺(GluCer)的溶酶體水解酶。根據(jù)神經(jīng)病學受累情況和罹病度，該疾病分為三種臨床類型(Cox等人，g/Afed2001;94:399-402)。2型戈謝病是最罕見且最嚴重的類型，它與急性神經(jīng)源性疾病的早期發(fā)病有關(guān)。神經(jīng)元型戈謝病的典型特征是水平凝視異常?；颊甙l(fā)展為進行性腦病和錐體外系癥狀，例如強直和帕金森樣運動(帕金森綜合征)。大多數(shù)2型戈謝病患者在童年早期死于神經(jīng)退化導(dǎo)致的呼吸暫?；蛘`吸。3型戈謝病也具有神經(jīng)病學受累情況，不過比2型的程度要輕。3型患者具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，包括運動失調(diào)(共濟失調(diào))、發(fā)作、眼肌癱瘓、癲癇和癡呆。3型的一個亞類3c型，伴有肝脾肺大、角膜渾濁、進行性共濟失調(diào)和癡呆以及心瓣膜和主動脈4艮釣化。其他有神經(jīng)病學受累情況的溶酶體貯積病包括與P-半乳糖苷酶突變有關(guān)并導(dǎo)致神經(jīng)元脂沉積的G脆神經(jīng)節(jié)苷脂貯積?。慌c己糖胺酶A突變有關(guān)并導(dǎo)致神經(jīng)元脂沉積的GM2神經(jīng)節(jié)苷脂貯積病(泰-薩病)；與鞘磷脂酶突變有關(guān)并導(dǎo)致神經(jīng)元脂沉積的尼曼-皮克??；(克拉貝病)半乳糖腦苷脂酶腦白質(zhì)營養(yǎng)不良；和與溶酶體蛋白酶突變有關(guān)并導(dǎo)致神經(jīng)元脂沉積的神經(jīng)元蠟樣質(zhì)脂褐質(zhì)沉積病。異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良是芳基硫酸酯酶A酶缺陷，且患者的癥狀包括進行性運動障礙、發(fā)作、認知障礙，除胃腸紊亂外，還有精神分裂癥和精神病問題。庫夫斯病(成人型神經(jīng)元脂質(zhì)脂褐質(zhì)沉積病)表現(xiàn)為精神病癥狀和發(fā)作。腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良是一種特征5特異性藥理剩呂近期，特異性藥理伴侶策略已經(jīng)發(fā)展到挽救不穩(wěn)定的突變蛋白質(zhì)，使之免于推測的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)或其他細胞蛋白質(zhì)降解/處理系統(tǒng)的降解。在特別的實施方案中，該范例的變化策略使用特異性地結(jié)合與特定溶酶體紊亂有關(guān)的缺陷型溶酶體酶的小分子可逆性抑制劑，所述抑制劑在ER內(nèi)穩(wěn)定突變酶并"陪伴"該突變酶以使其退出ER。出人意料地發(fā)現(xiàn)所述抑制劑可在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中在酶合成和折疊期間特異性結(jié)合該酶，但在其天然場所與該酶解離，從而修復(fù)其活性。缺少伴侶時，突變的酶蛋白質(zhì)在ER中不恰當折疊(Ishii等人，J5Zoc臉肌丑/o/^戸.及"O附柳.1996;220:812-815)，妨礙其成熟為終產(chǎn)品，并且隨后在ER中降解。這些特異性伴侶稱為特異性藥理伴侶(或活性位點特異性伴侶，其中所述伴侶是酶的竟爭性抑制劑)。術(shù)語"活性位點特異性伴侶"是從最初的利用野生型和突變的溶酶體酶研究發(fā)展來的。酶的催化部分，即酶與其底物結(jié)合和相互作用的部分，通常稱為"活性位點"。利用酶的可逆竟爭性抑制劑(即與底物竟爭結(jié)合催化中心的酶抑制劑)來誘導(dǎo)錯誤折疊的溶酶體酶采取穩(wěn)定分子構(gòu)象的反直覺策略，最初是才艮據(jù)一些竟爭性抑制劑在生物合成期間結(jié)合催化中心并穩(wěn)定酶的能力而假定的。因此，在體內(nèi)ER中新生酶的折疊期間可實現(xiàn)任何穩(wěn)定作用，尤其對具有折疊缺陷的突變酶，這將是有利的，因為這將阻止內(nèi)源ER"伴侶"結(jié)合錯誤折疊的多肽并將其作為降解靶。而且，竟爭性抑制劑是"可逆的"，因為一旦酶到達溶酶體它就與酶解離，在這里抑制劑竟爭不過天然底物。參與LSD的約15種酶的特異性伴侶策略已經(jīng)在授予Fan等人的美國專利號6,274,597、6,583,158、6,589,964和6,599,919中描述和例證，它們?nèi)囊氡疚淖鳛閰⒖?。例如，半乳糖的小分子衍生物l-脫氧半乳糖野尻霉素(DGJ)，是突變的法布里酶a-半乳糖苷酶A(a-GalA)有效的竟爭性抑制劑，有效地增加人突變a-GalA(R301Q)在中性pH下的體外穩(wěn)定性，并增強從R301Q或Q279E突變的法布里患者建立的^^巴母細胞中突變酶的活性。而且，對過表達突變(R301Q)a-GalA的轉(zhuǎn)基因小鼠口服給予DGJ大大升高了主要器官中的酶活性(Fan等人，Af^/.1999;5:112-115)。已描述了利用另外的亞氨基糖，異法戈明(isofagomine)(IFG)及其衍生物從戈謝患者細胞中Gba的相似挽救，描述于授予Fan等人的美國專利6，916，829，和利用其他特異于Gba的化合物(描述于未決的美國專利申請系列號10/988,428和10/988,427，兩者均于2004年11月12日提交)。il^本貯積病酶突變和神經(jīng)病學奮亂G6"和解^^^A病最近已經(jīng)發(fā)現(xiàn)溶酶體酶突變除LSD外還和神經(jīng)病學紊亂之間有聯(lián)系。作為一個實例，Gba基因突變和帕金森氏病之間存在充分確立的聯(lián)系。在一項研究中發(fā)現(xiàn)，一組患有罕有的、早期發(fā)病的、對治療有抵抗性的帕金森綜合征的17名患者的至少一個等位基因具有Gba錯義突變，包括N370S的純合和雜合個體，N370S是通常與l型非神經(jīng)元型疾病相關(guān)的突變(Tayebi等人，ilfo/.M^toA.2003;79;104-109)。在另一項研究中，評價了99名患有特發(fā)性帕金森氏病的德系猶太人群的6個Gba突變(N370S、L444P、84GG、V394L和R496H)。31名帕金森患者有l(wèi)或2個突變的Gba等位基因其中23人是N370S雜合型；3人是N370S純合型；4人是84GG雜合型；1人是R496H雜合型(Aharon-Peretz等人，iVew/2004;351:1972-77)。突變N370S等位基因的發(fā)生頻率是1573名正常受試者發(fā)生頻率的5倍，而84GG的發(fā)生頻率是正常受試者發(fā)生頻率的21倍。在帕金森氏病患者中，攜帶Gba突變的患者也比非攜帶患者年齡小。這項研究表明，Gba突變的雜合性可能使德系猶太人易患帕金森氏病。帕金森氏病和戈謝病也共享一些病理學特征，包括神經(jīng)元損失、星形膠質(zhì)增生和在海馬神經(jīng)元出現(xiàn)細胞毒性雷維小體樣a-突觸核蛋白包涵體(CA2-4區(qū))。新近出版物描述了所有三種類型戈謝病的神經(jīng)病學癥狀(Wong等人，iV"/.Afeto^/.2004;38:192-207)。發(fā)現(xiàn)所有三種類型戈謝病患者的大腦皮層3和5、海馬CA2-4區(qū)和4b層異常。神經(jīng)元損失僅僅在2和3型患者中是明顯的，而1型患者出現(xiàn)星形膠質(zhì)增生(Woiig等人，上述)?；?型戈謝病和帕金森綜合征/癡呆的兩個患者海馬CA2-4神經(jīng)元顯示a-突觸核蛋白陽性的包涵體，一個患者具有腦千型和皮層型雷維小體，一個具有顯著的黑質(zhì)神經(jīng)元的神經(jīng)元損失(Wong等人，上述)?？傊?，全部4個帕金森綜合征和癡呆患者具有海馬CA2-4神經(jīng)膠質(zhì)增生和神經(jīng)元耗竭、神經(jīng)膠質(zhì)增生和黑質(zhì)中的腦干型雷維小體。幾個鼠模型也表明Gba和帕金森氏病之間的這種聯(lián)系。Gba的體外最佳水解酶活力需要鞘脂激活蛋白(saposin)C，一種衍生自鞘脂激活蛋白原(prosaposin)的激活蛋白。表達低水平(野生型的4-45%)鞘脂激活蛋白原i和鞘脂激活蛋白(PS-NA)轉(zhuǎn)基因小鼠，與具有特定Gba點突變(V394L/V394L或D409H/D409H)的小鼠回交后，具有幾個類似于PD表型的CNS表型，包括步態(tài)共濟失調(diào)、震顫、跌倒程度的震顫、和神經(jīng)源性膀胱(Sun等人，/丄—W及"2005.46(10):2102-13)。上面描述的特異性藥理伴侶工作建立了修復(fù)突變酶(構(gòu)象突變)的功能，足以減少乃至消除LSD中毒性量脂質(zhì)底物增加的能力。然而，并不清楚該方法可影響雜合個體，或根據(jù)當前標準沒有診斷患有LSD但由于突變的影響而具有罹患神經(jīng)病學狀況或紊亂風險的純合突變個體，或診斷有溶酶體貯積病但具有除了或不同于構(gòu)象突變的使蛋白質(zhì)無功能突變的個體。由于毒性功能獲得、病理性功能損失、或者其組合，所有的這些群體都有罹患神經(jīng)病學紊亂的風險。因此，本領(lǐng)域依然需要能夠鑒定致病因素并解決這些患者群體中此類突變的后果。發(fā)明概述本發(fā)明提供一種用于治療個體神經(jīng)紊亂的方法，其中該神經(jīng)病學紊亂與溶酶體酶編碼基因的突變有關(guān)，通過施用有效量的特異性藥理伴侶以治療所述神經(jīng)病學紊亂。在一個實施方案中，個體是突變純合型的。在另一個實施方案中，個體是突變半合子型的、雜合型的或者復(fù)合雜合型的。在一個實施方案中，突變導(dǎo)致酶成為構(gòu)象突變體。在具體的實施方案中，其中伴侶增加突變酶從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的運輸，且有或者沒有伴隨地修復(fù)酶活性。在另一個實施方案中，突變導(dǎo)致另外的細胞物質(zhì)(例如脂質(zhì))或另外的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段(例如a-突觸核蛋白)的量增加或聚集。在本發(fā)明的具體實施方案中，溶酶體酶是葡糖腦苷脂酶，并且神經(jīng)紊亂是帕金森氏病或帕金森綜合征。在另一個具體實施方案中，帕金森氏病是早期發(fā)病的帕金森氏病。在本發(fā)明的一些實施方案中，特異性藥理伴侶是溶酶體酶的抑制劑，>且所述抑制劑是可逆性或竟爭性抑制劑或兩者兼是。在具體的實施方案中，葡糖腦苷脂酶的藥理伴侶是異法戈明或者(5R，6R，7S，8S)-5-羥甲基-2-辛烷基-5，6，7，8-四氫咪唑并[l，2-a吡啶-6，7,8-三醇。本發(fā)明也提供一種用于診斷與溶酶體酶突變有關(guān)的神經(jīng)紊亂的方法，通過篩選顯示出一個或多個溶酶體酶突變的神經(jīng)病學癥狀的個體。在一個實施方案中，突變導(dǎo)致酶成為構(gòu)象突變體。在另一個實施方案中，通過與健康個體生物樣品相比確定個體生物樣品中降低的酶活性進行篩選。在具體的實施方案中，神經(jīng)紊亂診斷為帕金森綜合征或帕金森氏病。附圖簡述圖1.圖1顯示用特異性藥理伴侶異法戈明處理的L444P轉(zhuǎn)基因小鼠腦中的Gba活性水平(lA)。也顯示在洗脫和再處理周期之后腦中的Gba活性水平(1B)。圖2A-N.圖2顯示利用lysotracker⑧紅對戈謝病成纖維細胞(2A)和正常成纖維細胞(2B)中的溶酶體熒光染色。也對正常成纖維細胞(2C)和戈謝病成纖維細胞(2D)進行了溶酶體蛋白質(zhì)LAMP-1染色。圖2E-F顯示戈謝病成纖維細胞中雙重Gba和LAMP-l染色的疊加。也顯示用特異性藥理伴倡異法戈明(2G-H)和特異性藥理伴侶C-苯曱基-異法戈明(2I-J)處理的戈謝病細胞雙重疊加(LAMP-1和&ba)。最后，圖2K-N顯示僅Gba染色的戈謝病細胞。對照戈謝病細胞僅用第二抗體染色(2K)，或者未處理(2L)，或者用異法戈明(2M)或C-苯曱基-異法戈明(2N)處理。圖3A-I.圖3顯示戈謝病細胞(3D-I)和正常成纖維細胞(3A-C)的熒光染色，用于表明多聚泛素化蛋白質(zhì)(PUP)(3A,3D，3G)和Gba(3B，3E，3H)的存在及兩者的疊加(3C，3F，31)。圖4.圖4顯示人酸性P-葡糖苷酶、也稱為葡糖腦苷脂酶或Gba的編碼基因(GenBank登錄號J03059;SEQIDNO:1)。圖5.圖5顯示野生型的人Gba蛋白質(zhì)。Gba蛋白質(zhì)由536個氨基酸組成，GenBank登錄號J03059(SEQIDNO:2)。圖6.圖6顯示位于Gba基因下游約16kb的Gba同源假基因(GenBank登錄號Ml6328;SEQIDNO:3)。圖7.圖7顯示Gba同源假基因編碼的多肽(SEQIDNO:4)。詳述本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)存在于個體但沒有診斷為溶酶體貯積病的神經(jīng)病學紊亂可能與溶酶體酶的突變有聯(lián)系。因此，本發(fā)明特異性藥理伴倡例如ASSC，可改善關(guān)聯(lián)神經(jīng)病學危險因素、狀況或紊亂的與溶酶體酶突變有關(guān)的功能獲得和功能損失病狀。伴侶可以以充分的水平"i秀導(dǎo)突變蛋白質(zhì)適當?shù)倪\輸，以抑制甚至達到預(yù)防與由錯誤折疊的突變蛋白質(zhì)增加(即功能獲得)有關(guān)的毒性累積，進而能夠影響神經(jīng)功能。有些情況下突變僅僅削弱蛋白質(zhì)的折疊和到天然細胞場所的運輸，而不是，例如削弱蛋白質(zhì)催化或其他活性的突變體，或是無義突變，伴侶也可修復(fù)突變蛋白質(zhì)的活性，從而解決與蛋白質(zhì)功能損失(例如底物累積乃至由于底物累積導(dǎo)致的其他毒性蛋白質(zhì)或片段的聚集)有關(guān)的病狀。定義^即常具有本領(lǐng)域的常規(guī)含義。下文或說明書別處論述了某些術(shù)語，以對專業(yè)人員在描述本發(fā)明組合物和方法及如何制備和使用方面提供補充指導(dǎo)。術(shù)語"戈謝病"包括基于表型表現(xiàn)的l型、2型和3型及其中間類型和亞群。"神經(jīng)紊亂"表示任何與神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞缺陷有關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)或周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)疾病，包括但不限于神經(jīng)元損失、神經(jīng)元退化、神經(jīng)元脫髓鞘、神經(jīng)膠質(zhì)增生(即星形膠質(zhì)增生)、或者異常蛋白質(zhì)或者毒素(例如P-淀粉樣蛋白或oc-突觸核蛋白)的神經(jīng)元或神經(jīng)元外累積。神經(jīng)病學紊亂可是慢性的或急性的。典型的神經(jīng)病學紊亂包括但不限于戈謝i病及其他LSD:包括法布里病、泰-薩病、龐倍氏癥和粘多糖貯積病；帕金森氏病；阿爾茨海默氏??；肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS);多發(fā)性硬化癥(MS);亨廷頓病；Fredrich共濟失調(diào)；輕度認知損傷；和運動障礙(包括共濟失調(diào)、大腦性麻痹、舞蹈手足徐動癥、肌張力障礙、圖雷特綜合癥、核黃疰)；震顫紊亂、腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(包括腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、卡納萬病、亞歷山大病、家族性中葉性硬化)；神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積?。幻毠軘U張性共濟失調(diào)；和雷特綜合癥。該術(shù)語也包括腦血管事件例如中風和缺血性疾病發(fā)作。如本文使用的，術(shù)語"神經(jīng)紊亂"也包括處于罹患神經(jīng)紊亂、疾病或狀況風險的人和已診斷為神經(jīng)紊亂、疾病或狀況的人。"與溶酶體酶突變有關(guān)的神經(jīng)紊亂"表示任何與不患有或不處于罹患神經(jīng)紊亂風險的個體(即健康個體)相比，當在患神經(jīng)紊亂個體中評估時也存在所述酶編碼基因突變的神經(jīng)素亂。在具體實施方案中，與Gba(戈i射病)突變體有關(guān)的神經(jīng)紊亂是帕金森病或帕金森綜合征。術(shù)語"人Gba基因"表示酸性P-葡糖苷酶、也稱為葡糖腦苷脂酶或Gba的編碼基因。Gba基因位于1號染色體的q21，并含有11個外顯子(GenBank登錄號J03059;SEQIDNO:1)。還有位于Gba基因下游約16kb的Gba同源假基因(GenBank登錄號M16328;SEQIDNO:3)。"人Gba"蛋白質(zhì)表示野生型人Gba蛋白質(zhì)。Gba蛋白質(zhì)由536個氨基酸組成，GenBank登錄號J03059(SEQIDNO:2)。上述假基因編碼的多肽如SEQIDNO:4所示。如本文使用的，術(shù)語"藥理伴侶"或有時稱作"特異性藥理伴侶"("SPC")表示與蛋白質(zhì)例如溶酶體酶(例如Gba)特異性結(jié)合的分子，并具有一個或多個以下作用(i)增強蛋白質(zhì)穩(wěn)定分子構(gòu)象的形成；(ii)誘導(dǎo)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到另外細胞場所的蛋白質(zhì)運輸，優(yōu)選天然細胞場所，即阻止蛋白質(zhì)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的降解；(iii)阻止錯誤折疊蛋白質(zhì)的聚集；(iv)修復(fù)或增強蛋白質(zhì)至少部分野生型功能、穩(wěn)定性和/或活性；和/或改善含蛋白質(zhì)細胞的表型或功能。因此，蛋白質(zhì)的藥理伴侶是這樣的分子，其與蛋白質(zhì)結(jié)合導(dǎo)>致該蛋白質(zhì)的恰當折疊、運輸、無聚集和活性。如本文使用的，該術(shù)語不表示內(nèi)源伴侶諸如BiP，或者對多種蛋白質(zhì)具有非特異伴侶活性的非特異性物質(zhì)，如往往稱為"化學伴侶"的甘油、二甲亞砜或重水(參見Sato等人，祝oc/^附丑/o^/^^爿"".1988;126(2):756-62;Welch等人，Ce〃5^e^做</C/r"/7efwies11996;1(2》109-115;Welch等人，/ow"fl/<>/必,》ewcg"/cs5&we附6fYmM1997;29(5):491-502;美國專利5,900,360;美國專利6,270,954和美國專利6，541，195)。如本文使用的，術(shù)語"特異性結(jié)合，，表示藥理伴侶和特定蛋白質(zhì)的相互作用，具體地，與直接參與接觸藥理伴侶的蛋白質(zhì)氨基酸殘基相互作用。與靶蛋白例如Gba特異性結(jié)合的化合物，意指與Gba結(jié)合并對Gba發(fā)揮藥理伴倡效果，而不是針對一類相關(guān)或不相關(guān)蛋白質(zhì)。與任何給定的藥理伴侶相互作用的蛋白質(zhì)氨基酸殘基可在或不在該蛋白質(zhì)的"活性位點"內(nèi)。特異性結(jié)合可通過常規(guī)結(jié)合試驗或通過結(jié)構(gòu)研究鑒定，例如共結(jié)晶、核磁共振(NMR)等等。術(shù)語"野生型蛋白質(zhì)"表示編碼功能性蛋白質(zhì)的核苷酸序列，和上述核苷酸序列編碼的多肽序列，以及其他編碼功能性多肽(具有如上述的多肽序列同樣的功能特性和結(jié)合親和性)的核苷酸序列，例如正常個體中的等位變體，能夠?qū)崿F(xiàn)ER中的功能性構(gòu)象，實現(xiàn)細胞內(nèi)的適當定位，并顯示野生型活性(例如GluCer水解)。如本文使用的，術(shù)語"突變蛋白質(zhì)，，表示含遺傳突變的基因翻譯的多肽，該遺傳突變導(dǎo)致改變的氨基酸序列。在一個實施方案中，當與野生型蛋白質(zhì)相比時，突變體導(dǎo)致蛋白質(zhì)在正常地存在于ER的條件下不能形成天然構(gòu)象，或顯示出與野生型蛋白質(zhì)相比降低的穩(wěn)定性或活性。本文述及的這種突變類型為"構(gòu)象突變"，并且?guī)в羞@種突變的蛋白質(zhì)為"構(gòu)象突變體"。無法達到該構(gòu)象導(dǎo)致蛋白質(zhì)被降解或聚集，而不是通過蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中的正常途徑轉(zhuǎn)運到細胞中的天然場所或轉(zhuǎn)運至胞外環(huán)境。在另一個實施方案中，蛋白質(zhì)具有除了或不同于構(gòu)象變體外的其他突變，其能夠翻譯，由此所有或部分蛋白質(zhì)能夠ER累積(蛋白質(zhì)可或不保持野生型活性)。在一些實施方案中，突變可發(fā)生在蛋白質(zhì)編碼基因的非編碼部分以致引起蛋白質(zhì)的低效率表達，例如影響轉(zhuǎn)錄效率、剪接效率、mRNA穩(wěn)定性等等的突變。通過增強蛋白質(zhì)野生型和構(gòu)象突變變體的表達水平，施用藥理伴侶可改善由這種低效蛋白質(zhì)表達產(chǎn)生的缺陷。其他突變可導(dǎo)致降低的酶活性或更迅速的轉(zhuǎn)換。與神經(jīng)元病相關(guān)的Gba突變的具體實施方案包括但不限于N370S、L444P、K198T、D409H、R496H、V39化、84GG和R329C。雜合的Gba突變表示基因型中有一個是野生型等位基因并且一個是突變型等位基因，例如N370S/wt。雜合的Gba突變也表示基因型中有兩個突變的等位基因，分別具有不同的突變，例如N370S/L444P。該術(shù)語也包括突變/無效基因型，即N370S/無效。當表示其他溶酶體酶中的雜合突變時該定義也是適用的。純合的Gba突變表示基因型中有兩個突變Gba等位基因，其中突變是相同的，例如N370S/N370S。當表示其他溶酶體酶中的純合突變時該定義也是適用的。術(shù)語"使恰當?shù)臉?gòu)象穩(wěn)定"表示藥理伴侶誘導(dǎo)或使突變蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定的能力，所述構(gòu)象與野生型對應(yīng)物的構(gòu)象在功能上相同。術(shù)語"功能上相同"意指雖然可能在構(gòu)象上有孩i小的變化(幾乎所有的蛋白質(zhì)在它們的生理狀態(tài)下都顯示出一些構(gòu)象上的靈活性)，但構(gòu)象靈活性不會導(dǎo)致(l)蛋白質(zhì)聚集，(2)通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的降解途徑消除，(3)削弱蛋白質(zhì)功能，例如Gba活性，和/或(4)細胞內(nèi)不恰當?shù)霓D(zhuǎn)運，例如定位到溶酶體，程度與野生型蛋白質(zhì)相比更大或更小。術(shù)語"穩(wěn)定的分子構(gòu)象"表示蛋白質(zhì)即Gba的構(gòu)象，通過特異性藥理伴侶誘導(dǎo)，以致在細胞中提供至少部分的野生型功能。例如，突變蛋白質(zhì)穩(wěn)定的分子構(gòu)象使蛋白質(zhì)從ER釋放并運輸?shù)教烊患毎麍鏊?，如野生型Gba一樣(例如溶酶體)，而不是錯誤折疊然后被降解。另外，突變蛋白質(zhì)的穩(wěn)定的分子構(gòu)象可能也具有完全的或部分活性，例如GluCer水解。然而，穩(wěn)>定的分子構(gòu)象無需具有野生型蛋白質(zhì)的所有功能性特征。術(shù)語"野生型活性"表示細胞中蛋白質(zhì)如Gba的正常生理功能。例如Gba活性包括折疊并從ER運輸?shù)饺苊阁w，有或者沒有伴隨的水解底物(如GluCer或4-甲基傘形酮(4-MU))的能力。這種功能性可通過任何已知確定這類蛋白質(zhì)功能性的手段來檢驗。某些檢驗可評價蛋白質(zhì)的屬性，其可能或不能相當于它的實際體內(nèi)功能，然而是蛋白質(zhì)功能性的總替代，并且在該檢驗中的野生型行為是本發(fā)明蛋白質(zhì)折疊挽救或增強技術(shù)的可接受結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明，一種這樣的活性是突變蛋白質(zhì)的適當轉(zhuǎn)運，例如Gba從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到天然細胞場所例如溶酶體或到胞外環(huán)境的轉(zhuǎn)運。術(shù)語"內(nèi)源表達"表示個體細胞中蛋白質(zhì)的正常生理表達，所述個體不患有或懷疑患有CNS疾病或與蛋白質(zhì)的缺失、過表達或其他缺陷相關(guān)的紊亂，例如核酸或多肽序列中抑制其表達、活性或穩(wěn)定性的缺陷。該術(shù)語也表示蛋白質(zhì)在正常表達該蛋白質(zhì)的細胞類型中表達，而不包括其中蛋白質(zhì)不在健康個體中表達的細胞或細胞類型如腫瘤中的表達。如本文使用的，術(shù)語"增強表達"或"提高表達，，表示相對于細胞中(優(yōu)選相同的細胞類型或同樣的細胞，例如早期的細胞)不與蛋白質(zhì)特異性藥理伴侶接觸的表達，增加細胞中與蛋白質(zhì)特異性藥理伴倡接觸的采取功能性構(gòu)象多肽的量。上述術(shù)語的另外意思指相對于細胞中不與蛋白質(zhì)特異性藥理伴倡接觸的野生型對應(yīng)物的轉(zhuǎn)運效率(優(yōu)選同樣的細胞，例如早期細胞，或相同的細胞類型)，增加細胞中與蛋白質(zhì)特異性藥理伴侶接觸的來自ER的多肽的轉(zhuǎn)運效率。如本文使用的，術(shù)語"轉(zhuǎn)運效率"表示從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運突變蛋白質(zhì)到其細胞內(nèi)天然場所、到細胞內(nèi)另外的場所、到細胞膜或到胞外環(huán)境的能力。酶的"竟爭性抑制劑，，表示結(jié)構(gòu)上類似酶底物的化學結(jié)構(gòu)和分子幾何學的化合物，其以與底物在大致相同的位置結(jié)合酶。因此，抑制劑與底物分子竟爭相同的活性位點，因此增加Km。如果底物分子充足可置換抑制劑時，竟爭性抑制通常是可逆的，即竟爭性抑制劑能夠可逆結(jié)合。因此，〖酶抑制的量取決于抑制劑濃度、底物濃度和抑制劑與底物對活性位點的相對親和性。當抑制劑遠離活性位點之處結(jié)合時發(fā)生非經(jīng)典的竟爭性抑制，51起酶的構(gòu)象變化以致底物不能再與其結(jié)合。在非經(jīng)典的竟爭性抑制中，底物在活性位點的結(jié)合阻止抑制劑在不同位點的結(jié)合，反之亦然。這包括變構(gòu)抑制。酶的"線性混合型抑制劑"是一種允許底物結(jié)合但降低其親和性的竟爭性抑制劑，因此Km增加，而Vmax降低。"非竟爭性抑制劑，，表示與酶形成強的鍵，并且不能通過加入過量底物置換的化合物，即非竟爭性抑制劑是不可逆的。非竟爭性抑制劑可在酶或蛋白質(zhì)活性位點處、附近或遠處結(jié)合，并且就酶而言，對Km沒有影響但降低Vmax。反竟爭性抑制表示抑制劑僅結(jié)合酶-底物(ES)復(fù)合物的情況。當抑制劑結(jié)合時酶變得無活性。這不同于可在無底物時結(jié)合酶的非經(jīng)典竟爭性抑制劑。術(shù)語"Vmax"表示酶催化反應(yīng)的最大起始速度，即在飽和底物水平。術(shù)語"Km"是達到V^Vmax所需的底物濃度。"應(yīng)答者"是診斷患有與溶酶體酶突變有關(guān)的神經(jīng)紊亂并且根據(jù)本文要求保護的方法治療顯示出改善、緩解或預(yù)防一種或多種臨床癥狀，或者改善或逆轉(zhuǎn)一個或多個替代的臨床標記物的個體。作為一個實例，患有帕金森氏病(具有伴行的Gba突變)的個體"應(yīng)答者"是顯示出改善、緩解或預(yù)防一種或多種臨床癥狀，或者改善或逆轉(zhuǎn)一個或多個替代的臨床標記物的人，包括但不限于神經(jīng)元損失、星形膠質(zhì)增生、和在CA2-3神經(jīng)元出現(xiàn)神經(jīng)元內(nèi)雷維小體樣ot-突觸核蛋白包涵體。術(shù)語"治療有效劑量，，和"有效量"表示足以導(dǎo)致治療反應(yīng)的特異性藥理伴侶的量。治療反應(yīng)可以是使用者(例如臨床醫(yī)師)認為對療法有有效反應(yīng)的任何反應(yīng)，例如通過癥狀和替代的臨床標記物評定。因此，治療反應(yīng)通常是疾病或紊亂(例如神經(jīng)紊亂)一個或多個癥狀的改善。短語"可藥用的"表示當施用于人時是生理上可耐受的并且通常不會產(chǎn)生不利反應(yīng)的分子實體和組合物。優(yōu)選，如本文使用的，術(shù)語"可藥用的"指經(jīng)聯(lián)邦或州政府管理機構(gòu)批準的或在美國藥典或其他普遍認可的藥典列出用于動物，更特別是人。術(shù)語"載體"表示與化合物一起給藥的稀釋劑、佐劑、賦形劑或運載體。這類藥物載體可以是無菌的液體，如水或油。優(yōu)選使用水或水性溶液、鹽溶液和葡萄糖水性溶液和甘油溶液作為載體，尤其是可注射溶液。E.W.Martin在"Remington'sPharmaceuticalSciences"第18版或其他版本中描述了適合的藥用載體。術(shù)語"約"和"大約"通常應(yīng)當指鑒于測量性質(zhì)或精確度所測量的量的可接受的誤差程度。通常，示例性誤差程度在給定數(shù)值或數(shù)值范圍的20%以內(nèi)，優(yōu)選10%以內(nèi)，更優(yōu)選5%以內(nèi)?？蛇x的，并且尤其在生物學系統(tǒng)中，術(shù)語"約，，和"大約"可指在給定數(shù)值的數(shù)量級內(nèi)的數(shù)值，優(yōu)選5倍以內(nèi)，更優(yōu)選2倍以內(nèi)。除非另有說明，本文所給的數(shù)字量均是近似值，這意味著當沒有明確說明時可推斷具有術(shù)語"約，，或"大約"的含義。分子生物學定義根據(jù)本發(fā)明，可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學、微生物學和重組DNA技術(shù)。這類技術(shù)在文獻中有詳盡解釋。參見例如5Vwi^w^/^故A在Ma"^Jf泡，M9fec"/"rCfo"/wg:/4丄"6w"to/jA/a"wa/，第2版(1989)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,紐約(本文稱為"Sambrook等A^1989");Z)A^Cto"/yig:JiVflrtfctf"/;/wwK^，第I和n巻(D.N.Glover編輯，1985);O一"Sj;"lte/s(M.J.Gait編輯，1984);AMe/c雄6W^fea細[B.D.Hames&S.J.ffiggins編^(1985)；TranscriptionAndTranslation[B.D.Hames&S.J.ffiggins編輯，1984；爿w/附o/CW/Cwft"w[RI.Freshney編輯，(1986)；//w附oMife^/Ce/fe爿im/五"gwies;[ERLPress,(1986)；B.Perbal，爿iVacifcfl/(7wJcfea朋/hg(1984);F.M.Ausubel等(編輯)，Cwre",/MfecwtorM/(9gy，JohnWUey&Sons,Inc.(1994)。如本文使用的，術(shù)語"分離的"意味著所提到的材料是從其正常發(fā)現(xiàn)的環(huán)境中移出的。因而，分離的生物材料能夠不含細胞組分，即發(fā)現(xiàn)或生'產(chǎn)該材料的細胞的組分。在核酸分子的情況下，分離的核酸包括PCR產(chǎn)物、分離的mRNA、cDNA或限制片段。在另一個實施方案中，分離的核酸優(yōu)選從在可發(fā)現(xiàn)核酸的染色體中切下，更優(yōu)選其不再與非調(diào)節(jié)性、非編碼區(qū)或與其他基因連接，所述非調(diào)節(jié)性、非編碼區(qū)或與其他基因位于在見于染色體中時分離的核酸分子所含有的基因的上游或下游。在又一個實施方案中，分離的核酸缺少一個或多個內(nèi)含子。分離的核酸分子包括插入質(zhì)粒、粘粒、人工染色體等中的序列。因此，在一個具體實施方案中，重組核酸是一種分離的核酸。分離的蛋白質(zhì)可以與其他細胞中與之結(jié)合的蛋白質(zhì)或核酸或此二者結(jié)合，或者如果它是一種膜結(jié)合蛋白質(zhì)時與細胞膜結(jié)合。分離的細胞器、細胞或組織在其發(fā)現(xiàn)的生物體中自其解剖位點移出。分離的材料可是但無須是純化的。本文使用的術(shù)語"純化的"表示已經(jīng)在減少或消除無關(guān)材料即雜質(zhì)的條件下分離的材料，如Gba核酸或多肽。例如，純化的蛋白質(zhì)優(yōu)選基本上不含有其他在細胞中與之結(jié)合的蛋白質(zhì)或核酸。如本文使用的，術(shù)語"基本上不含"可操作地用在材料的分析性檢測環(huán)境中。優(yōu)選地，基本上不含雜質(zhì)的純化材料的純度是至少50%，更優(yōu)選至少90%，進而更優(yōu)選至少99%?？梢酝ㄟ^色i普法、凝膠電泳、免疫測定、組成分析、生物測定和本領(lǐng)域已知的其他方法對純度進行評估。術(shù)語"宿主細胞"意指以任何方式選擇、修飾、轉(zhuǎn)化、生長、使用或操作的任何生物的任何細胞，用于通過該細胞產(chǎn)生物質(zhì)，例如由該細胞表達基因、DNA或RNA序列、蛋白質(zhì)或酶。根據(jù)本發(fā)明，修飾宿主細胞以表達突變型或野生型溶酶體酶核酸和多肽。宿主細胞可進一步用于篩選或其他測定。"重組DNA分子"是進行了分子生物學操作的DNA分子。用于本發(fā)明的宿主細胞的實例是HEK293細胞、COS細胞和CHO細胞。本文的多核苷酸可在兩側(cè)有天然調(diào)控(表達控制)序列，或可與異源序列相連，包括啟動子、內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)及其他核糖體結(jié)合位點序列、增強子、應(yīng)答元件、抑制子、信號序列、聚腺苷酸序列、內(nèi)含子、5，-和3，-非編碼區(qū)等等。也可通過本領(lǐng)域已知的多種方式4務(wù)飾核酸。這樣修飾的非窮舉的實例包括甲基化、"加帽"、利用類似物取代一個或多個自然存在的核苷酸、和諸如核苷酸內(nèi)修飾，例如，不帶電荷的連接(如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)和帶電荷的連接(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)。多核苷酸可包含一個或多個附加的共價連接的部分，例如，蛋白質(zhì)(如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L-賴氨酸等)、嵌入劑(如吖啶、補骨脂素等)、螯合劑(如金屬、放射性金屬、鐵、氧化的金屬等)和烷化劑。多核苷酸可由形成曱基或乙基磷酸三酯或者烷基氨基磷酸酯連接衍生而來。而且，本文的多核苷酸也可直接或間接由能夠提供可檢測信號的標記修飾。標記的實例包括放射性同位素、熒光分子、生物素等。"編碼序列"或"編碼"表達產(chǎn)物如RNA或多肽的序列，是當表達時導(dǎo)致RNA或多肽產(chǎn)生的核苷酸序列，例如Gba核苷酸序列編碼Gba多肽(蛋白質(zhì))的氨基酸序列。蛋白質(zhì)的編碼序列可包括起始密碼子(通常是ATG)和終止密碼子。術(shù)語"基因"，也稱為"結(jié)構(gòu)基因，'指編碼或相應(yīng)于包含構(gòu)成全部或部分一個或多個溶酶體蛋白質(zhì)的特定氨基酸序列的DNA序列，并且可能或可能不包括調(diào)控DNA序列，例如決定如在何種條件下表達基因的啟動子序列。當用于從核酸序列生產(chǎn)氨基酸序列的情況時，術(shù)語"表達"指允許或?qū)е禄蚧駾NA序列中的信息顯現(xiàn)出來，例如通過激活參與相應(yīng)Gba基因或DNA序列轉(zhuǎn)錄和翻譯的細胞功能來生產(chǎn)Gba蛋白質(zhì)。在細胞中或由細胞表達的DNA序列形成"表達產(chǎn)物"例如Gba蛋白質(zhì)。表達產(chǎn)物本身，例如所得的蛋白質(zhì)，也可表述為是由細胞"表達"的。表達產(chǎn)物可表征為胞內(nèi)的、胞外的或分泌的。根據(jù)本發(fā)明，蛋白質(zhì)在神經(jīng)元中細胞內(nèi)表達。術(shù)語"胞內(nèi)的"指細胞內(nèi)的東西。術(shù)語"胞外的，，指細胞外的東西。如果在細胞外表現(xiàn)出顯著量，則物質(zhì)是通過細胞從細胞上或細胞內(nèi)某處"分泌的"。術(shù)語"異源的"表示非天然組合出現(xiàn)的元件組合。例如，異源的DNA，表示非天然位于細胞或細胞染色體位點的DNA。優(yōu)選，異源DNA包括細胞的外源基因。異源表達調(diào)控元件是與不同于天然有效連接的基因有效連接的元件。在本發(fā)明的上下文中，編碼目的蛋白質(zhì)的基因?qū)τ谄溆糜诳寺』虮磉_而插入的載體DNA是異源的，并且對于包含上述載體的表達該基因的宿主細胞是異源的，例如大腸桿菌細胞。術(shù)語"轉(zhuǎn)化"表示從周圍介質(zhì)中將DNA即編碼溶酶體酶多肽的核酸引入宿主細胞的過程。術(shù)語"轉(zhuǎn)導(dǎo)"表示將DNA即編碼Gba多肽的核酸引入到原核宿主細胞中，例如通過細菌病毒或噬菌體引入原核宿主細胞。接受并表達所引入的DNA或RNA的原核或真核宿主細胞已經(jīng)被"轉(zhuǎn)化"或"轉(zhuǎn)導(dǎo)"，并且是"轉(zhuǎn)化體"或"克隆"。引入宿主細胞的DNA或RNA可來自任何來源，包括與宿主細胞相同屬或種的細胞、或不同屬或種的細胞、或合成序列。術(shù)語"工程重組細胞"表示經(jīng)操作以表達或過表達目的核酸即Gba多肽編碼核酸的任何原核或真核細胞，通過任何適當?shù)姆椒▽崿F(xiàn)，包括轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)。該術(shù)語也包括細胞中核酸的內(nèi)源活化，該細胞通常不表達或以次佳水平表達所述基因產(chǎn)物。術(shù)語"轉(zhuǎn)染"指向細胞中引入"外來"(即外部的或胞外的)核酸。"外來"核酸包括引入宿主細胞的基因、DNA或RNA序列，以便使宿主細胞復(fù)制該DNA,并表達所引入的基因或序列，從而產(chǎn)生期望的物質(zhì)，通常是所引入基因或序列編碼的蛋白質(zhì)或酶。所引入的基因即編碼Gba多肽的核酸或序列，也可稱為"克隆的"基因或序列，可以包括調(diào)節(jié)或控制序列，諸如起始序列、終止序列、啟動子序列、信號序列、分泌序列或細胞遺傳機器所使用的其他序列。基因或序列可以包括非功能序列或者無已知功能的序列。所引入的DNA或者作為染色體外元件，或通過染色體整合入接受并表達所引入的DNA或RNA的宿主細胞中。取決于所使用的宿主細胞，使用適合于此類細胞的標準技術(shù)進行轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染。如上述Sambrook等人1989中第1.82節(jié)描述的，使用氯化鈣的鈣處理通常用于含實體細胞壁屏障的細菌細胞。用于轉(zhuǎn)化的另一個方法如lChung和Miller(7V"c/"c1988，16:3580)描述的寸吏用聚乙二醇/DMSO。又一個方法是使用稱為電穿孔的技術(shù)。另外，對于使用病毒載體的情況，宿主細胞可通過包含目的基因的病毒感染。術(shù)語"載體"、"克隆載體"和"表達載體"指DNA或RNA序列(例如Gba基因)可以通過其被引入到宿主細胞中以轉(zhuǎn)化宿主并促進所引入序列的表達(例如轉(zhuǎn)錄和翻譯)的運栽體。載體包括質(zhì)粒、噬菌體、病毒等；這些在下文更詳細"i寸論。載體通常包含可傳遞因子的DNA，外源DNA插入其中。將DNA區(qū)段插入另一DNA區(qū)段的常規(guī)方法包括利用稱為限制性內(nèi)切酶的酶在稱為限制性位點的特異位點(特異的核苷酸組)切割DNA。"表達盒"表示編碼表達產(chǎn)物的DNA編碼序列或DNA區(qū)段，可在規(guī)定的限制性位點插入載體。設(shè)計表達盒限制性位點，以確保以正確的閱讀框插入表達盒。通常，在載體DNA的一個或多個限制性位點插入外來DNA，然后通過載體與可傳遞的載體DNA—起攜帶入宿主細胞。具有插入或附加DNA的DNA區(qū)段或序列如表達載體也稱為"DNA構(gòu)建體"。載體的常見類型是"質(zhì)粒"，其通常是雙鏈DNA的自容式分子，通常為細菌來源，其可容易地接受附加的(外來的)DNA并可容易地引入適當?shù)乃拗骷毎?。質(zhì)粒載體往往包含編碼DNA和啟動子DNA,并具有一個或多個適于插入外來DNA的限制性位點。編碼DNA是編碼特定蛋白質(zhì)或酶的特定氨基酸序列的DNA序列。啟動子DNA是起始、調(diào)節(jié)或以其他方式介導(dǎo)或控制編碼DNA表達的DNA序列。啟動子DNA和編碼DNA可來自相同或不同的基因，并且可來自相同或不同的生物。許多載體，包括質(zhì)粒和真菌載體，已被描述用于多種真核和原核宿主中的復(fù)制和/或表達。非窮舉的實例包括pKK質(zhì)粒(Clonetech)、pUC質(zhì)粒、pET質(zhì)粒(Novagen，Inc"Madison，WI)、pRSET或pREP質(zhì)粒(Invitrogen,SanDiego，CA)、或pMAL質(zhì)粒(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA)、pCXN和很多合適的宿主細胞，使用本文公開或引用或相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法。重組克隆載體往往包括一個或多個用于克隆或表達的復(fù)制系統(tǒng)、一個或多個用于宿主中選擇的標記例如抗生素抗性、和一個或多個表達盒。很多宿主/表達載體組合(即表達系統(tǒng))可應(yīng)用于目的蛋白質(zhì)的表達。有用的表達載體，例如，可由染色體區(qū)段、非染色體和合成DNA序列組成。合適的載體包括已知的細菌質(zhì)粒，例如大腸桿菌質(zhì)粒colEl、pCRl、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX(Smith等人，Gene67:31-40，1988)、pMB9和它們的衍生物，質(zhì)粒如RP4;謹菌體DNA，例如噬菌體l的眾多衍生物例如NM989，及其他噬菌體DNA，例如M13和絲狀單鏈噬菌體DNA;酵母質(zhì)粒如2m質(zhì)?；蚱溲苌铮粊碓从谫|(zhì)粒和噬菌體DNA組合的載體，如已被修飾使用噬菌體DNA或其他表達控制序列的質(zhì)粒；等等。另外的通用表達系統(tǒng)使用昆蟲宿主細胞和桿狀病毒載體?？缮藤彽挠糜诓溉閯游锛毎牡湫捅磉_載體包括pMEP4、pCEP4、pLXSN、PXT1、pcDNA3系列、pcDNA4系列、pCMV-Script、pCMV-標簽及其他基于CMV的載體、pVP22、pVAXl、pUB6。為進行哺乳動物細胞的轉(zhuǎn)染，病毒載體包括腺相關(guān)病毒載體、痘病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。哺乳動物表達載體是本領(lǐng)域常規(guī)和公知的。宿主細胞也可固有地含有目的多肽如Gba。對于異源多肽如Gba,將異源核酸(例如cDNA)相配地插入可復(fù)制的載體，在適當?shù)膯幼诱{(diào)控下在培養(yǎng)基中表達。正如上述所指出的，許多載體都可用于該目的，并且合適載體的選擇主要取決于插入載體的核酸大小和轉(zhuǎn)化該載體的特定宿主細胞。每個載體取決于其功能(DNA擴增或DNA表達)和與其相容的特定宿主細胞而包含不同的組件。用于細菌轉(zhuǎn)化的載體組件通常包括但不限于下列的一個或多個信號序列、復(fù)制起點、一個或多個標記基因和啟動子。編碼Gba多肽的DNA不僅可直接表達，而且也可與另外的多肽融合表達，優(yōu)選信號序列或其他在成熟多肽N-末端具有特異性切割位點的多肽。通常，信號序列可以是載體的一個組件，或可以是插入載體的多肽DNA的一部分。選擇的異源信號序列應(yīng)當可被宿主細胞識別和加工(即通過信號肽酶切割)。對于細菌宿主細胞不識別和加工的天然多肽信號序列，該信號序列由選擇的細菌信號序列代替，例如選自堿性礴酸酶、青霉素酶、lpp或熱穩(wěn)定的腸毒素II前導(dǎo)肽。表達和克隆載體都包含使載體在一種或多種選擇的宿主細胞中復(fù)制的核酸序列。通常，在克隆載體中，該序列是使載體獨立于宿主染色體DNA復(fù)制并且包含復(fù)制起點或自主復(fù)制序列的序列。對于多種細菌這樣的序列為大家所熟知。質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點適于大多數(shù)革蘭氏陰性細菌。通常表達和克隆載體也包含選擇基因，也稱為可選擇標記。該基因編有轉(zhuǎn)化含選擇基因載體的宿主細胞不會在該培養(yǎng)基上存活。通常選擇基因編碼如下的蛋白質(zhì)(a)賦予對抗生素或其他毒素的抗性，例如氨千青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四環(huán)素；(b)補償營養(yǎng)缺陷；或(c)提供從復(fù)合培養(yǎng)基中不能獲得的關(guān)鍵養(yǎng)分。選擇方案的一個實例利用藥物阻止宿主細胞的生長。那些成功轉(zhuǎn)化異源基因的細胞產(chǎn)生賦予抗藥性的蛋白質(zhì)，因此幸免于選擇方案。碼目的多肽的核酸有效連接。"啟動子序列"是能夠在細胞中結(jié)合RNA聚合酶的DNA調(diào)控區(qū)，并且起始下游(3，方向)編碼序列的轉(zhuǎn)錄。為了定義本發(fā)明，啟動子序列在其3，末端以轉(zhuǎn)錄起始位點為界，并且上游(5，方向)延伸至包括以高于背景的可檢測水平起始轉(zhuǎn)錄所必需的最小數(shù)目的堿基或元件。在啟動子序列內(nèi)會發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄起始位點和負責結(jié)合RNA聚合酶的蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(共有序列)。編碼序列"處于"細胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列的"控制下"或與之"有效連接"，此時RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄編碼序列為mRNA，然后mRNA經(jīng)RNA剪接(如果包含內(nèi)含子)并且被翻譯為編碼序列編碼的蛋白質(zhì)。包含一個或多個上述所列組件的適當載體的構(gòu)建使用標準連接技術(shù)。切割、加尾和再連接分離的質(zhì)粒或DNA片段，以期望的形式產(chǎn)生所需質(zhì)粒。為了分析以確認所構(gòu)建質(zhì)粒的正確序列，用連接混合物轉(zhuǎn)化細菌菌株，并在適用的情況下，通過氨千青霉素或四環(huán)素抗性篩選成功的轉(zhuǎn)化體。制備從轉(zhuǎn)化體獲得的質(zhì)粒，通過限制性內(nèi)切酶消化分析，和/或通過Sanger等人，iVw7Vfl議&丄f/5^.1977，74:5463-5467或Messing等人，7V"cfefc爿c她1981，9:309的方法測序，或通iiMaxam等人的方法(Afe欲rwfe￡>^;附^狄1980,65:499)。利用以上描述的表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，并在為所用啟動子酌情改變的常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)?；瘜W定義術(shù)語"烷基"表示直鏈或支鏈的d-C2。烴基，其僅由碳和氫原子組成，不含不飽和度，通過單鍵與分子其余部分連接，例如甲基、乙基、正丙基、l-甲基乙基(異丙基)、正丁基、正戊基、l，l-二甲基乙基(叔丁基)。本文所使用的烷基優(yōu)選d-Q烷基。術(shù)語"烯基"表示含有至少一個碳-碳雙鍵的C2-Qo脂族烴基，并且其可以是直鏈或支鏈的，例如乙烯基、l-丙烯基、2-丙烯基(烯丙基)、異丙烯基、2-甲基-l-丙烯基、l-丁烯基、2-丁烯基。術(shù)語"環(huán)烷基"表示不飽和的非芳族單環(huán)或多環(huán)的烴環(huán)系，例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基。多環(huán)環(huán)烷基的實例包括全氯萘基、金剛烷基和降水片基(norbornyl)橋連的環(huán)狀基團或螺二環(huán)基團，例如螺(4，4)壬-2-基。術(shù)語"環(huán)烷基烷基"表示直接與如上所定義的烷基連接的如上所定義的環(huán)烷基，這導(dǎo)致穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，例如環(huán)丙基甲基、環(huán)丁基乙基、環(huán)戊基乙基。術(shù)語"烷基醚"表示具有至少一個摻入烷基鏈的氧的如上所定義的烷基或環(huán)烷基基團，例如甲乙醚、二乙醚、四氫呋喃。術(shù)語"烷基胺"表示具有至少一個氮原子的如上所定義的烷基或環(huán)烷基基團，例如正丁胺和四氫5惡嗪。術(shù)語"芳基"表示具有約6至約14個碳原子的芳族原子團，例如苯基、萘基、四氫萘基、茚滿基、聯(lián)苯基。術(shù)語"芳基烷基"表示如上所定義的芳基直接鍵合到如上所定義的烷基，例如-(:112<:6115和-<:2114<:6115。術(shù)語"雜環(huán)"表示穩(wěn)定的由碳原子和一至五個選自氮、磷、氧和硫的雜原子組成的3-至15-元環(huán)原子團。對于本發(fā)明的目的，雜環(huán)原子團可以是單環(huán)、二環(huán)或三環(huán)環(huán)系，其可以包括稠合、橋連或螺環(huán)系，雜環(huán)中的氮、磷、碳、氧或硫原子可以任選地被氧化為各種氧化態(tài)。另外，氮原子可以任選地被季銨化；環(huán)原子團可以是部分或完全飽和的(即，雜芳族的或雜芳基芳族的)。這類雜環(huán)原子團的實例包括但不限于氮雜環(huán)丁烷基、吖t基、苯并間二氧雜環(huán)戊烯基、苯并二巧惡烷基、苯并呋喃基、呻唑基、噌啉基、二氧戊環(huán)基、吲溱基、萘咬基、全氫氮雜萆基、吩溱基、吩瘞溱基、吩噁溱基、酞溱基、吡咬基、蝶咬基、噤呤基、喹唑啉基、喹喔啉基、喹啉基、異會啉基、四唑基、，朱唑基、四氫異奮啉基(tetrahydroisouinolyl)、哌^!^基、哌嗪基、2-氧代p底溱基、2-氧代哌咬基、2-氧代吡咯烷基、2-氧代氮雜萆基、氮雜萆基、吡咯基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡溱基、嘧咬基、峻溱基、噁唑基、噁唑啉基、噍唑烷基、三唑基、茚滿基、異噍唑基、異喁唑烷基、嗎啉基、噻唑基、噻唑啉基、瘞峻烷基、異噻唑基、奎寧環(huán)基、異瘞唑烷基、吲咮基、異吲哚基、丐l咮基、異吲哚基、八氫吲味基、八氫異吲咮基、喹啉基、異會啉基、十氫異全啉基、苯并咪唑基、噻二唑基、苯并吡喃基、苯并噻唑基、苯并惡唑基、呋喃基、四氫呋喃基、四氫吡喃基、噻吩基、苯并噻吩基、硫嗎啉基、硫嗎啉基亞砜、硫嗎啉基砜、二氧磷雜環(huán)戊烷基、巧惡二唑基、苯并二氫吡喃基、異苯并二氫吡喃基。雜環(huán)原子團可以在任何導(dǎo)致穩(wěn)定結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的雜原子或碳原子上與主結(jié)構(gòu)連接。術(shù)語"雜芳基"表示雜環(huán)中的環(huán)是芳族的。術(shù)語"雜芳基烷基"表示直接與烷基鍵合的如上所定義的雜芳基環(huán)原子團。雜芳基烷基原子團可以在任何導(dǎo)致穩(wěn)定結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的烷基碳原子上與主結(jié)構(gòu)連接。術(shù)語"雜環(huán)基烷基"表示如上所定義的雜環(huán)原子團。雜環(huán)基烷基環(huán)原子團可以在任何導(dǎo)致穩(wěn)定結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的雜原子或碳原子上與主結(jié)構(gòu)連接。術(shù)語"雜環(huán)基烷基"表示直接與烷基鍵合的如上所定義的雜環(huán)原子團。連接。土'元土'、np'、'元土'、一"取代的烷基"、"取代的烯基"、"取代的炔基"、"取代的環(huán)炕基"、"取代的環(huán)烷基烷基"、"取代的環(huán)烯基"、"取代的芳基烷基"、"取代的芳基"、"取代的雜環(huán)"、"取代的雜芳基環(huán)"、"取代的雜芳基烷基"或"取代的雜環(huán)基烷基環(huán)，，中的取代基可以是相同或不同的，有一個或多個選自下組的基團氫、羥基、卣素、羧基、氰基、氨基、硝基、氧代基(=0)、硫代基(-S)或任選地被取代的選自以下的基團烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、雜芳基烷基、雜環(huán)、-COORx、-C(0)Rx、-C(S)RX、-C(0)NRxRy、-C(0)ONRxRy、-NRxCONRyRz、-N(Rx)SORy、-N(Rx)S02Ry、辨-N(R"R3)、-NRxC(0)ORy、-NRxRy、-NRxC(0)Ry、NRxC(S)Ry、-NRxC(S)NRyRz、SONRxRy、S02NRxRy、ORx、-ORxC(0)NRyRz、-ORxC(0)ORy、-OC(O)RX、-OC(0)NRxRy、-RxNRyRz、-RxRyRz、-RXCF3、-RxNRyC(0)Rz、-RxORy、-RxC(0)ORy、-RxC(0)NRyRz、-RxC(0)Rx、-RxOC(0)Ry、-SRX、-SORx、-S02Rx、-ON02，其中以上各基團中的RX、Ry和RZ可以是氫原子、取代或未取代的烷基、卣代烷基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的環(huán)烷基烷基、取代或未取代的雜環(huán)、取代或未取代的雜環(huán)基烷基、取代或未取代的雜芳基或者取代或未取代的雜芳基烷基。毒性功能獲得在一個特別的實施方案中，本發(fā)明涉及利用溶酶體酶特異性藥理伴侶以提高恰當?shù)牡鞍踪|(zhì)運輸水平并降低突變酶的累積水平。其依次可用于治療與酶突變有關(guān)的神經(jīng)病學狀況，包括種種形式的溶酶體貯積病，其中一個或兩個等位基因上的突變產(chǎn)生構(gòu)象突變酶，但也具有功能性結(jié)構(gòu)域突變，廢除了酶活性。本文的實施方案通過特異性藥理伴侶對突變Gba的作用舉例說明，該Gba突變發(fā)現(xiàn)于無功能性Gba存在的戈謝病的神經(jīng)病學形式。該伴侶增加從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運輸Gba蛋白質(zhì)的水平，并恢復(fù)突變蛋白質(zhì)的正確泛素化。該作用不能從現(xiàn)有的對蛋白質(zhì)功能ASSC拯救的工作中預(yù)見到。CNS中蛋白質(zhì)聚集如突變Gba累積是特別可怕的，因為神經(jīng)元不能在由于與毒性累積有關(guān)的神經(jīng)元應(yīng)激形成的神經(jīng)退化或細胞凋亡后再生。因此，純合或雜合型突變的存在足以引起神經(jīng)元中突變蛋白質(zhì)聚集或累積和細胞應(yīng)激，最終導(dǎo)致細胞死亡。眾多報道已公開CNS中的蛋白質(zhì)聚集與病狀相關(guān)聯(lián)。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明基于這樣的概念，即溶酶體貯積病中CNS病狀及其他與溶酶體酶突變有關(guān)的神經(jīng)紊亂，可部分地通過神經(jīng)元中突變的錯誤折疊酶的毒性累積進行解釋，而特異性藥理伴倡方法可逆轉(zhuǎn)這種效應(yīng)。毒性效應(yīng)也依賴于蛋白質(zhì)的功能，突變對蛋白質(zhì)的功能和穩(wěn)定性的影響，以及蛋白質(zhì)功能的損失或降低的害處是否甚于或不及蛋白質(zhì)累積和/或聚集的毒性影響。因此，使用特異性藥理伴侶增加來自ER蛋白質(zhì)的運輸可通過降低該蛋白質(zhì)累積/聚集的毒性作用而減輕疾病病狀，甚至無需恢復(fù)蛋白質(zhì)功能。由此可見特異性藥理伴侶可潛在地用來治療任何蛋白質(zhì)毒性累積和/或蛋白質(zhì)聚集為疾病病理重要病因的疾病，包括與神經(jīng)退化疾病相關(guān)，特別是有神經(jīng)病學受累情況的溶酶體貯積病如戈謝病，及其他神經(jīng)病學危險因素、紊亂或與溶酶體酶突變有關(guān)的狀況，如帕金森氏病。如上文所指出的那樣，可能與功能障礙的溶酶體酶有關(guān)并可通過藥理伴侶治療的其他神經(jīng)疾病類型為阿爾茨海默病、肌萎縮性側(cè)索硬化、卡納萬病、克羅伊茨費爾特-雅各布病、亨廷頓病、多發(fā)性硬化癥、皮克病和脊髓小腦萎縮癥。因此，增加從ER運輸?shù)耐蛔兠?，?或提高酶活性的治療方法有益于減輕與溶酶體貯積病有關(guān)的神經(jīng)元致病作用或與溶酶體酶突變相關(guān)的其他神經(jīng)疾病。甚至在沒有提高酶活性(即恢復(fù)功能損失)和降低底物累積的情況下，突變酶的適當?shù)倪\輸對神經(jīng)元也具有有利的影響，例如(i)減輕對正常蛋白質(zhì)泛素/蛋白酶體降解途徑的細胞應(yīng)激；或(ii)降低由ER應(yīng)激所虧1起的解折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)，因而改善病狀例如具有Gba突變的帕金森氏患者的a-突觸核蛋白聚集。以下直接提供這些作用的證據(jù)。細胞應(yīng)激已明確確定細胞中大量錯誤折疊的蛋白質(zhì)累積或聚集導(dǎo)致細胞應(yīng)激。該應(yīng)激往往與細胞"應(yīng)激"蛋白質(zhì)一一多聚泛素的量增加有關(guān)系。泛素-蛋白質(zhì)綴合物已揭示泛素是許多神經(jīng)退化疾病所特有的絲狀包涵體的組件，表明這類疾病過程中的激活或常見的神經(jīng)元反應(yīng)(Lowe等人，A^WY/m^o/々，/;/A^WY^iV/.79";16:281-91)。例如，遺傳研究，包括與家族性帕金森氏病(包括a-突觸核蛋白)有關(guān)的基因中突變的鑒別，和在帕金森氏病散發(fā)病例的少量多巴胺能黑質(zhì)神經(jīng)元中蛋白質(zhì)原性胞漿包涵體的存在，已表明泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和異常蛋白質(zhì)降解的重要功用(Betarbet等人，五jc/;7Ve歸/.2005;191Suppll:S17-27)。另外，體內(nèi)和體外研究已將聚集的a-突觸核蛋白和氧化應(yīng)激與受損的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和帕金森氏病發(fā)病機理關(guān)聯(lián)在一起。而且，已在散發(fā)性帕金森氏病患者的黑質(zhì)部分致密層中鑒別出伴有潛在的細胞毒性異常蛋白質(zhì)累積和聚集的26/20S蛋白酶體的結(jié)構(gòu)和功能缺陷(McKnaught等人，爿"wA^"/.2003;53Suppl3:S73-84)。具體地，引起蛋白質(zhì)錯誤折疊和抵抗蛋白酶體降解的a-突觸核蛋白的突變導(dǎo)致家族性帕金森氏病。因而，蛋白質(zhì)處理方面的缺陷似乎是散發(fā)性和不同家族性PD的共同因素。從添加蛋白酶體抑制劑與誘導(dǎo)蛋白質(zhì)錯誤折疊物質(zhì)組合到多巴胺能神經(jīng)元培養(yǎng)物的試驗中得到相同的結(jié)論(Mytilineou等人，/iVe"m/7>"附附.2004;111(10-11):1237-51)。當兩者組合時，占優(yōu)勢的多巴胺神經(jīng)元丟失和細胞死亡明顯增加。更進一步地，已報道在一些溶酶體j^積病包括戈謝病患者細胞中發(fā)現(xiàn)泛素化蛋白質(zhì)的聚集體(Asmarina等人，/.祝oc&肌2003;增刊l;摘要編號P3.7-08)。這些細胞與泛素/蛋白酶體途徑相關(guān)的基因也顯示出改變的基因表達模式。對于伴有CNS受累情況的LSD神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)混亂的另一個學說是歸因于累積的酶抑制泛素/蛋白酶體途徑(Rocca等人，Afo/ec"/flr5/otogv6/CW/.2001;12:1293-1301)。例如，已發(fā)現(xiàn)與a-突觸核蛋白聚集有關(guān)的毒性機制之一M生在許多神經(jīng)退化過程中的蛋白酶體抑制作用。具體地，表明聚集的a-突觸核蛋白通過與蛋白酶體的亞基S6，相互作用來抑制蛋白酶體功能(Snyder等人，/A^/A^"尸仍"2004;24(3):425畫42)。在帕金森氏病受試者的腦中以及在沒有E3泛素連接酶二乙嗪(parkin)和部分泛素蛋白酶體系統(tǒng)的個體和動物腦中蛋白酶體功能降低。蛋白質(zhì)聚集和相關(guān)的蛋白酶體抑制也已與炎癥相聯(lián)系(Li等人，/說0c/re肌CW/祝o/.2003;35:547-552)。已提出分子伴侶和損壞的/變性的/錯誤折疊的蛋白質(zhì)間的不平衡導(dǎo)致后者的累積，取決于不平衡的嚴重程度可導(dǎo)致衰老、蛋白酶體的抑制(導(dǎo)致細胞凋亡)或壞死(Soti等人，^g/"gCW/.2003;2:39-45)。這些假說稱為"毒性蛋白質(zhì)積累假說"。因為認為a-突觸核蛋白單體通過蛋白酶體降解并且寡聚物的形成是濃度依賴性的，這可導(dǎo)致a-突觸核蛋白的累積和寡聚作用。突變Gba和a-突觸核蛋白兩者的累積(后者由于Gba活性損失所致)都將加重對蛋白酶體的影響，并且缺陷型Gba也可削弱溶酶體自體吞噬反應(yīng)的任何增加，自體吞噬反應(yīng)是為了補償?shù)鞍酌阁w降解途徑的缺陷而發(fā)生的。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激除了以上引證的討論，ER腔中錯誤折疊蛋白質(zhì)的持續(xù)累積引起ER應(yīng)激反應(yīng)，其依次引起"解折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)"(UPR)。UPR是由蛋白質(zhì)合成抑制作用《1起的細胞應(yīng)激反應(yīng)的質(zhì)量控制，例如通過氧化應(yīng)激、或ER中不能折疊的突變蛋白質(zhì)的滯留。若沒有該反應(yīng)，ER將會變得充滿可通過細胞凋亡導(dǎo)致細胞死亡的錯誤折疊的不穩(wěn)定蛋白質(zhì)(Gow等人，7Ve歸層ec由M^/.2003;4:73-94)。也已表明ER中Gba與蘭尼堿(Rhyanodine)受體相互作用干擾Ca"動態(tài)平衡，由于胞液中Ca"的增加而導(dǎo)致削弱蛋白質(zhì)折疊和UPR、ER應(yīng)激誘發(fā)的細胞凋亡和線粒體指導(dǎo)的細胞死亡(Korkotian等人，/5《WCAe附.1999.274(31):21673-8;Lloyd國Evans等人，/J5/o/C7^附.2003.278(26):23594-9;Pelled等人，7Ve"w&》/"/s.2005.18(1):83-8)。自體吞噬除了降解脂質(zhì)，溶酶體也負責降解聚集的蛋白質(zhì)(下面進一步論述)。該過程稱為自體吞噬，通過此胞內(nèi)整體降解過程，部分細胞質(zhì)被遞送到溶酶體以被溶酶體酶降解。這樣的酶包括切割肽鍵的蛋白酶(組織蛋白酶)、除去共價結(jié)合磷酸的磷酸酶、切割DNA/RNA的核酸酶、切割脂質(zhì)分子的脂肪酶及糖類切割酶。聚集的蛋白質(zhì)包括突變的溶酶體酶，可引起導(dǎo)致神經(jīng)元中持久的退行性病變的顯著自體吞噬反應(yīng)的活化。許多CNS紊亂包括肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)的神經(jīng)元顯示不規(guī)則的嚢泡運輸和自體吞謹反應(yīng)。過度的自體吞噬-溶酶體空泡形成有可能可引起神經(jīng)元死亡。自體吞噬反應(yīng)的過度激活，特別是組合累積的突變蛋白質(zhì)對作為補償機制的蛋白酶體途徑的抑制作用，是有關(guān)累積的突變體溶酶體酶和神經(jīng)退行性變特別是阿爾茨海默氏病之間聯(lián)系的一個假說。病理性功能損失除了修復(fù)溶酶體酶的恰當運輸，特異性藥理伴侶對突變體酶活性的修復(fù)對持有一個或兩個等位基因不穩(wěn)定突變的患者是有利的，由于不充足的折疊合運輸所述突變降低天然場所(如溶酶體)中功能性酶(例如Gba)的量。甚至小量的功能損失即可導(dǎo)致病狀諸如底物累積或聚集，其可導(dǎo)致其他病理性聚集體的產(chǎn)生。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于改善與突變?nèi)苊阁w酶蛋白質(zhì)有關(guān)的神經(jīng)紊亂的方法，該方法通過提高酶的降低活性實現(xiàn)，其依次將(i)提高底物、聚集的蛋白質(zhì)或片段的溶酶體降解；(ii)降低神經(jīng)元細胞凋亡或壞死；和(iii)阻止細胞膜中磷脂"平衡"的改變(直接在下面論述)。假定對戈謝病中神經(jīng)元損失或神經(jīng)病的可能性說明可通過與突變有關(guān)的Gba活性損失來解釋?；钚該p失引起缺陷Gba的細胞中諸如GluCer的神經(jīng)酰胺累積。這些已顯示由于胞內(nèi)釣的增加和釣-介導(dǎo)的細胞死亡的靈敏度增加在培養(yǎng)的海馬CA2-4神經(jīng)元細胞中引起細胞凋亡。多巴胺能神經(jīng)元也已顯示在神經(jīng)酰胺-誘導(dǎo)損傷后遭受細胞凋亡。第二，已在致死的無效等位基因戈謝病小鼠的器官中發(fā)現(xiàn)高水平的毒性化合物葡糖鞘氨醇，其也是Gba的底物。葡糖鞘氨醇也在所有三種戈謝病類型患者的組織中升高。不過，使用目前的檢測方法只在伴有神經(jīng)元受累情況的患者腦中水平提高(Sidransky，Mo/.i^e似^/.2004;83:6-15)，使用目前的方法不能檢測出的小量累積仍可影響蛋白質(zhì)折疊以及通過影響脂我成分削弱蛋白質(zhì)運輸(下文論述)。第三，膜磷脂內(nèi)容物影響細胞中Gba的活性。也就是說，帶負電荷的磷脂提高Gba活性，而帶正電荷的砩脂諸如磷脂酰膽堿(PC)卻不能。因此，在戈謝病中降低Gba的機制激活參與PC合成的酶，從而提高PC，可引起Gba進一步的減少(Wong等人，上述)。另外，升高的神經(jīng)酰胺可阻礙a-突觸核蛋白的軸突運輸，有利于聚集和雷維小體形成。推測神經(jīng)元發(fā)揮功能需要a-突觸核蛋白。由于a-突觸核蛋白結(jié)合PC不足，主要由PC組成的軸突運輸嚢泡不能與由酸性磷脂組成的嚢泡一樣有效(Woiig等人，上述)。另外，正如以上討論的，溶酶體通過自體吞噬參與清除涉及眾多CNS紊亂的聚集體。自體吞噬在神經(jīng)元中有特別重大的意義，因為甚至在沒有任何疾病-相關(guān)的突變蛋白質(zhì)的情況下自體吞噬的損失導(dǎo)致神經(jīng)退行性變(Hara等人，2V"似m2006年4月19日在線公開)。在氧化應(yīng)激期間發(fā)生溶酶體自體吞噬系統(tǒng)的誘導(dǎo)，以致力于保護性地消除胞內(nèi)組分的改變(Kiffm等人，^w"Vjdflf及e^xS/gw"/.2006;8(1-2):152-62)。a-突觸核蛋白寡聚體作為一個實例。一個研究小組報道了人腦勻漿的溶酶體中含葡糖苷酰鞘氨醇的神經(jīng)節(jié)苷脂和a-突觸核蛋白之間的相互作用(Schlossmacher等人，A^w￡>ig/MW.2005;352:730)。在患有帕金森氏病的戈謝病患者中，Gba與a-突觸核蛋白共定位于雷維小體(Wong等人，Afo/.Me似60/.2004;38:192-207)。這些結(jié)果支持發(fā)生在溶酶體內(nèi)的a-突觸核蛋白的加工，并且提供帕金森氏病中降低的Gba活性和突觸核蛋白病變(synucleinopathy)之間的生化聯(lián)系。另外，自體吞噬對消除來自胞質(zhì)區(qū)室的聚集形式的突變亨廷頓蛋白(huntingtin)和共計失調(diào)I型蛋白(ataxin-l)是必不可少的(Iwata等人，7Vflrf^c^5WSA2005;102(37):13135-40)。自體吞噬在清除來自肌萎縮性側(cè)索硬化、阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷頓病及其他多聚谷氨酸擴展紊亂細胞中的蛋白質(zhì)聚集體方面也起到重要的作用(Meriin等人，//0;/^WAc附/fl.2005;21(5):403-19)。因而，溶酶體水解酶的缺陷將對蛋白質(zhì)毒性累積(包括累積的溶酶體蛋白質(zhì)本身)的自體吞噬反應(yīng)產(chǎn)生不利的影響。底物累積和胞吞運輸缺陷細胞底物的累積，如溶酶體疾病中的神經(jīng)鞘脂類和膽固醇，特別是那些涉及CNS的神經(jīng)鞘脂類和膽固醇，與蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的胞吞運輸混亂有關(guān)。這可由于rab(腦中的ras)蛋白質(zhì)的混亂發(fā)生，rab蛋白質(zhì)定位于分離的亞細胞區(qū)室并與蛋白質(zhì)運輸有關(guān)的膜結(jié)合蛋白質(zhì)。rab混亂通過膜結(jié)合蛋白質(zhì)進入"脂我，，導(dǎo)致隔絕。脂莪是富含神經(jīng)鞘脂類(鞘磷脂和磷脂酰膽堿)和膽固醇的膜微域。它們已表明為多種細胞事件，包括信號傳導(dǎo)和膜運輸中提供平臺。特別地，脂莪穩(wěn)定ER膜內(nèi)GPI-錨定蛋白質(zhì)的結(jié)合，直接參與蛋白質(zhì)構(gòu)象以及指導(dǎo)脂質(zhì)或脂質(zhì)相關(guān)蛋白質(zhì)通過吞飲泡進入細胞的合適區(qū)室。因此，由于脂質(zhì)水解酶活性的降低在例如溶酶體貯積病中吞々欠泡和溶酶體膜內(nèi)的脂幾累積可改變胞內(nèi)糖鞘脂(已是累積的)和i^v細胞的脂質(zhì)相關(guān)蛋白質(zhì)的分選(Pagano等人，i^i7w7>ww及5Vc丄0m/^丑"/5^2003;358:885-91)。近來有關(guān)粘多糖(MPS)的發(fā)現(xiàn)支持該錯誤-分選假說，其中證實兩種不同累積的底物即GM2和GM3神經(jīng)節(jié)苷脂在相同神經(jīng)元中累積，卻一向位于不同的細胞質(zhì)嚢泡群中(McGlynn等人，G附/;7Ve"ra/.2004;480:415-26)。這些作者假定個體神經(jīng)元間的共隔絕表明在組成、運輸和/或脂筏組分再循環(huán)方面缺陷的存在導(dǎo)致在MPS紊亂中闡明神經(jīng)元^U能障礙的新機制產(chǎn)生。對戈謝病小鼠模型的研究也表明降低的Gba活性通常干擾糖鞘脂分解代謝，導(dǎo)致更復(fù)雜類型(神經(jīng)節(jié)苷脂)的累積。神經(jīng)節(jié)苷脂的累積可導(dǎo)致人的肌張力障礙和帕金森綜合征(Roze等人，Move附e"rZ)&onjfera.2005;20(10):1366-1369)。累積GM2神經(jīng)節(jié)苷脂的小鼠模型也累積ot-突觸核蛋白(Suzuki等人，A^iwre/wW.2003;14(4):551-4)。這種神經(jīng)節(jié)苷脂的累積也可導(dǎo)致oc-突觸核蛋白累積和通過UPR途徑導(dǎo)致神經(jīng)元死亡(Lee等人，/5"/C7^附.2002.277(1):671-8)。此外，如上所述，表明神經(jīng)鞘脂類可對a-突觸核蛋白聚集體的形成起種子作用。這些神經(jīng)毒性的機制是脂質(zhì)累積的結(jié)果，可部分闡明戈謝病的神經(jīng)病理學，因為在Gba活性和戈謝病嚴重程度之間有弱的相關(guān)性。該相關(guān)性區(qū)分三種主要疾病類型(I-III)，雖然在個體類型中存在重疊，且相關(guān)性微弱。雜合的正常Gba患者不經(jīng)歷顯著的脂質(zhì)累積，因為通過正常的等位基因產(chǎn)生一些量的活性Gba。然而，甚至少量的GluCer累積可干擾ER鉤的動態(tài)平衡并削弱蛋白質(zhì)折疊(如上所述)，或甚至可能通過一些機制使a-突觸核蛋白聚集。考慮到上述，根據(jù)本發(fā)明特異性藥理伴侶的用途對于酶替代療法(ERT)和底物降低療法(SRT)是有利的，因為前者必須通過導(dǎo)管直接施用入腦，并且因為兩者都不解決突變體溶酶體酶本身即突變Gba的毒性累積問題。因此，相比可降低突變蛋白質(zhì)累積、或者提高和/或修復(fù)蛋白質(zhì)功能(從而降低底物累積)或兩者兼而有之的療法，這些療法是低效的。突變體溶酶體酶類和特異性藥理伴倡下面是列出溶酶體酶和特異性藥理伴侶的表格，對于那些可用于治療具有酶突變個體的溶酶體酶，所述個體具有作為結(jié)果發(fā)生的神經(jīng)病學狀況或紊亂，或處于發(fā)展為神經(jīng)病學狀況或紊亂的風險中。<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>酸性a-巖藻糖苷酶l-脫氧巖藻糖野尻霉素GenBank登錄號NM—000147P-homofuconojirimycin2，5-亞氨基-l，2，5-三脫氧-L-葡萄糖醇2，5-脫氧-2，5-亞氨基-D-果糖醇2，5-亞氨基-l,2，5-三脫氧-D-阿卓糖醇a-N-乙酰氨基葡糖苷酶1，2-雙脫氧-2-]\-乙酰胺基-野尻霉素GenBank登錄號U40846a-N-乙酰氨基半乳糖苷酶1，2-雙脫氧-2-N-乙酰胺基-半乳糖野尻GenBank登錄號M62783霉素P-氨基己糖苷酶A2-N-乙酰氨基-異法戈明GenBank登錄號NM_0005201，2-乙酰胺基-野尻霉素irngstsiin卩-氨基己糖苷酶B2-N-乙酰胺基-異法戈明GenBank登錄號NM—0005211，2-雙脫氧-2-乙酰胺基-野尻霉素imgstaina-L-艾杜糖醛酸酶1-脫氧艾杜糖野尻霉素GenBank登錄號NM—0002032-羧基-3，4，5-三脫氧哌啶P-葡萄糖醛酸酶4-羧基-異法戈明GenBank登錄號NM—0001812-羧基-3，4，5-三脫氧哌啶唾液酸酶2，6-雙脫氧-2，6，亞氨基-唾液酸GenBank登錄號U84246制唾液酸酶素艾杜糖醛酸硫酸酯酶2,5-脫水甘露醇-6-硫酸鹽GenBank登錄號AF_011889酸性神經(jīng)磷脂酶脫甲丙咪漆，磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸GenBank登錄號M59916在一個具體實施方案中，下面是本發(fā)明預(yù)期的一些特異性藥理伴侶，可用于治療Gba突變的神經(jīng)病學危險因素、狀況或紊亂。也舉例說明了Gba34突變，預(yù)期通過伴侶"拯救"。(^fl吏^r在至少一個等位基因上(雜合子)的Gba點突變N370S的存在幾乎普遍與l型戈謝病有關(guān)(Cox，上述)。N370S純合型比Gba無效/N370S雜合型(N370S/無效)有較輕的表型，可能由于純合子的殘留Gba活性。事實上，一些N370S/N370S患者在其整個生命的大部分時間都是無癥狀的，然而卻可能處于發(fā)展為神經(jīng)紊亂如帕金森氏病的危險之中。在這種情況下，Gba突變將是帕金森氏病的危險因素。與l型戈謝病有關(guān)的其他點突變包括84GG、R496H、Q350X和H162P(Orvisky等人，i7"/mm3/"似^".2002;495，19(4):458-9)。另外，剪接位點突變IVS10+2T—G和IVS10+2T—A也與I型戈謝病有關(guān)(Orvisky，上述)。神經(jīng)元病2型戈謝病與主要產(chǎn)生兩個氨基酸取代L444P和A456P的突變有關(guān)。L444P純合型也通常與3型戈謝病有關(guān)，雖然該突變已經(jīng)在所有三種疾病類型的患者中鑒別。其他與2型和3型神經(jīng)元病戈謝病有關(guān)的點突變包括D409H(純合子)和V349L和D409V(雜合子)。D409H純合型的患者顯示出除神經(jīng)病學受累情況外的獨特表型包括腦積水及心瓣膜和主動脈鉤化。后兩種點突變V349L和D409V導(dǎo)致催化缺陷型的Gba。其他在2型或3型疾病中鑒別的突變是K198E、K198T、Y205C、F251L、1402F和剪接位點突變IVS10+2T—A(Orvisky等人，上述；和Lewin等人，Mo/Ge""M"fl6.2004;81(1):70-3)。缺乏任何Gba活性的患者和敲除小鼠由于脫水在出生后不久死亡，因為神經(jīng)酰胺對皮膚皮的完整性是必不可少的(Liu等人，7V"汰爿cfl^.t/5^.1998;95:2503-08)。G^i^伴/g異法戈明(IFG;(3R，4R，5R)-5-(羥甲基)-3，4-哌啶二醇)表示具有如下結(jié)構(gòu)的化合物IFG具有C6fibN03的分子式和147.17的分子量。授予Sierks等人的美國利5，863，卯3進一步描述了該化合物。C-苯甲基-IFG表示具有如下結(jié)構(gòu)的化合物其他Gba的伴侶包括均在2004年ll月12日提交的未決美國公開申請2005/0130972和2005/0137223及對應(yīng)的PdV/^告號WO2005/046611和WO2005/046612中描述的葡糖咪喳、多聚環(huán)己烷基(polycyclohexanyl)和羥基哌啶衍生物，并且本文引用作為參考。葡糖咪唑和衍生物以如下的化學結(jié)構(gòu)為代表其中B選自氫、羥基、乙酰氨基和鹵素；任選存在的Ri和I^是短的柔性連接基團，其線性長度(linearlength)為約6A至約12A，優(yōu)選約9A。Ri和I^也可以獨立地選自CrC6取代或未取代的烷基，其任選地被一個或多個選自NH、NHCOO、NHCONH、NHCSO、NHCSNH、CONH、NHCO、NR3、O、S、S(0)加和陽S(0)mNR3的部分所間斷；CVC6取代或未取代的烯基，其任選地被一個或多個選自NH、NHCOO、NHCONH、NHCSO、NHCSNH、CONH、NHCO、NR3、O、S、S(0)m和-S(0)mNRS的部分所間斷；CVC6取代或未取代的炔基，其任選地被一個或多個選自NH、NHCOO、NHCONH、NHCSO、NHCSNH、CONH、NHCO、NR3、O、S、S(0)m和-S(0)mNR3的部分所間斷，其中m是l或2，且RS每次出現(xiàn)時獨立地選自氫、取代或未取代的烷基；取代或未取代的烯基；取代或未取代的炔基；取代或未取代的環(huán)烷基；取代或未取代的環(huán)烯基；取代或未取代的芳基；取代或未取代的芳基烷基；取代或未取代的雜芳基；取代或未取代的雜環(huán)基；取代或未取代的雜環(huán)基烷基；取代或未取代的雜芳基烷基；及其可藥用的鹽和前體藥物。此外，如果R、I^或RM^各自不是氫，則R^i;或R、I可以是氫。Rs表示氫、羥基或羥曱基；1^和I是親脂基團，選自C3-Cu取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基；取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的環(huán)烯基；取代或未取代的芳基；取代或未取代的芳基烷基；取代或未取代的雜芳基；取代或未取代的雜環(huán)基；取代或未取代的雜環(huán)烷基；取代或未取代的雜芳基烷基。在具體實施方案中，GIZ化合物包括(5R，6R，7S，8S)-5-羥甲基-2-辛基-5，6，7，8-四氫咪唑并[1，2-3吡啶-6，7，8-三醇和(511，611，78，88)-5-羥曱基-2-(3，3-二甲基丁基)-5，6，7，8-四氫咪唑并[l，2-a吡啶-6，7，8-三醇?？紤]用于本發(fā)明的聚羥基環(huán)烷基(polyhydroxykycloalkyl)(PHCA)衍生物包括如下化學結(jié)構(gòu)式所代表的化合物其中B選自氫、羥基、N-乙酰氨基或鹵素。Ri每次出現(xiàn)時獨立地選自氫；取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的環(huán)烯基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的雜芳基、取代或未取代的雜環(huán)基、取代或未取代的雜環(huán)基烷基、取代或未取代的雜芳基烷基、-C(0)RS和-S(0)mR3，其中m是l或2，且R"每次出現(xiàn)時獨立地選自氫、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基；取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的環(huán)烯基；取代或未取代的芳基；取代或未取代的芳基烷基；取代或未取代的雜芳基；取代或未取代的雜環(huán)基；取代或未取代的雜環(huán)基烷基；取代或未取代的雜芳基烷基，并且-C(0)連接于d-C6取代或未取代的烷基。任選存在的I^是短的柔性連接基團，其線性長度為約6A至約12A,優(yōu)選約9A。！^也可以選自CrC6取代或未取代的烷基，其任選地被一個或多個選自NH、NHCOO、NHCONH、NHCSO、NHCSNH、CONH、NHCO、nr3、o、s、s(o)m和-s(o、NR3的部分所間斷；<:2-<:6取代或未取代的烯基，其任選地凈皮一個或多個選自NH、NHCOO、NHCONH、NHCSO、NHCSNH、CONH、NHCO、NR3、O、S、S(0)加和-S(0)加NR3的部分所間斷；CrC6取代或未取代的炔基，其任選地被一個或多個選自NH、NHC00、NHCONH、NHCSO、NHCSNH、CONH、NHCO、NR3、O、S、S(0)m和-S(0)mNR"的部分所間斷，其中m是l或2，且只3每次出現(xiàn)時獨立地選自氫、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基；取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的環(huán)烯基；取代或未取代的芳基；取代或未取代的芳基烷基；取代或未取代的雜芳基；取代或未取代的雜環(huán)基；取代或未取代的雜環(huán)基烷基；取代或未取代的雜芳基烷基，并且-C(O)連接于d-C6取代或未取代的烷基；及其可藥用的鹽和前體藥物。L是親脂基團，選自CVd2取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基；取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的環(huán)烯基；取代或未取代的芳基；取代或未取代的芳基烷基；取代或未取代的雜芳基；取代或未取代的雜環(huán)基；取代或未取代的雜環(huán)烷基；取代或未取代的雜芳基烷基?？紤]用于本發(fā)明的Gba突變的羥基哌啶衍生物以如下的化學結(jié)構(gòu)為代表其中A代表碳或氮；B是氫、羥基、N-乙酰胺或鹵素;W是氫；取代或未取代的烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、芳基、芳基烷基、雜芳基、雜環(huán)基、雜環(huán)基烷基或雜芳基烷基；-C(0)RS或-S(0)mR3。優(yōu)選地，Ri包括H或具有l(wèi)-12個碳原子的有機部分；W是任選的短的柔性連接基團，其線性長度為約6A至約12A?；蛘?，Rz是d-C6的取代或未取代的烷基、烯基或炔基，其任選地被一個或多個選自下組的部分所間斷NH、NHCOO、NHCONH、NHCSO、NHCSNH、CONH、NHCO、NR3、O、S、S(0)》-S(0)mNR3;113是氫，或者取代或未取代的烷基、烯基；炔基；環(huán)烷基、環(huán)烯基；芳基；芳基烷基；雜芳基；雜環(huán)基；雜環(huán)基烷基；或雜芳基烷基。優(yōu)選地，'ie包括H或者具有l(wèi)-12個碳原子或者更優(yōu)選地l-6個碳原子的有機部分。m是l或2，和RS是氫、羥基或羥曱基。L是具有l(wèi)-12個碳原子的親脂基團，其包括取代或未取代的烷基、烯基、炔基；環(huán)烷基、環(huán)烯基；芳基；芳基烷基；雜芳基；雜環(huán)基；雜環(huán)烷基；或雜芳基烷基。在具體實施方案，考慮用于本發(fā)明的羥基哌啶化合物包括但不限于如下(3R，4R，5R，6S/6R)-5-(羥甲基)-6-正丁基-3,4-二羥基哌啶；(3R，4R，5R，6S/6R)-5-(羥甲基)-6-正己基-3,4-二羥基哌夂；(3R，4R，5R，6S/6R)-5-(羥曱基)-6-正庚基-3,4-二羥基p底"定；(3R,4R，5R,6S/6R)-5-(羥甲基)-6-正辛基-3，4-二羥基哌咬；(3R，4R，5R,6S/6R)-5-(羥甲基)-6-正壬基-3，4-二羥基哌啶；(3R，4R，5R，6S/6R)-5-(羥甲基)-6-節(jié)基-3，4-二羥基哌啶。授予Fan等人的美國專利6,599,919描述了Gba的其他伴倡，包括calystegineA3、calystegineA5、calysteginecalystegineB2、calystegineB3、calystegineB4、calystegined、N-methyl-calystegineB2、DMDP、DAB、栗精胺、1-脫氧野尻霉素、N-丁基-l-脫氧野尻霉素、1-脫氧野尻霉素亞硫酸氫鹽、N-丁基-異法戈明、N-(3-環(huán)己基丙基)-異法戈明、N-(3-苯丙基)-異法戈明和N-[(2E，6Z，10Z)-3，7，ll-三曱基十二碳三烯基j-異法戈明.K。在下述另一個具體實施方案中是特異性藥理伴侶包括l-脫氧野尻霉素(DNJ;1，5-亞氨基-l，5-雙脫氧-D-葡萄糖醇-CASNo.19130-96-2)及衍生物，它們可用來治療溶酶體酶a-葡糖苷酶(Gaa)突變的神經(jīng)病學危險因素、狀況或紊亂。典型的Gaa突變包括如下D645E(Lin等人，Z/^"-鄉(xiāng)Mf"(7"oJ^w五rZeKYMe^r"/ZffZ似.1996;37(2):115國21);D645H(Lin等人，5&c^附5^p/^s及esCb附附"".199517;208(2):886畫93);R224W、S619R和R660H(New等人，尸e^^A^"ra/.2003;29(4):284-7);T1064C和C2104T(Montalvo等人，Afo/G朋dAfeto6.2004;81(3):203-8);D645N和L卯1Q(Kroos等人，Afe"ra附Mscw/"&wy/.2004;14(6):371-4);G219R、E262K、M408V(Fernandez-Hojas等人，A^"/wm附cw/Z)/wn/.2002;12(2):159-66);G309R(Kroos等人，C//G^"".1998;53(5):379國82);D645N、G448S、R672W和R672Q(Huie等人，5&c/^附5/ojp/i^/esawiw".1998;27;244(3):921-7);P545L(Hermans等人，孖m附Mo/1994;3(12):2213畫8);C647W(Huie等人，Huie等人，好"附Mo/Ge"".1994;3(7):1081-7);G643R(Hermans等人，1993;2(4):268畫73);M318T(Zhong等人，v4附/7/"附(7朋C1991;49(3):635畫45);E521K(Hermans等人，5&c/^附丑^p/^siesOwi附"".1991;179(2):919-26);W481R(Raben等人，Hw柳Af"加.1999;13(1):83-4);及L552P和G549R(未公開數(shù)據(jù))。剪接突變體包括IVS1AS、T>G、-13和IVS8+1G〉A(chǔ))。典型的a-葡糖苷酶伴侶以如下的化學結(jié)構(gòu)為代表Ri是H或者含l-12個碳原子的直鏈或支鏈的烷基、環(huán)烷基、烯基、烷基醚或烷基胺，含5-12個環(huán)原子的芳基、烷基芳基、雜芳基、或雜芳基烷基，其中RJ壬選地由一個或多個OH、-COOH、-Cl、-F、-CF3、-OCF3、其中:-0-C(-0)N-N-(烷基)2取代；和R^Ua;含l-9個碳原子的直鏈或支鏈的烷基、環(huán)烷基、烯基或烷基醚，或含5-12個碳原子的芳基，其中R2^i^地由-OH、-COOH、-CF3、-OCF3或雜環(huán)取代；其中R,和R2中至少一個不是H，或其可藥用的鹽。特別的，酸性a-葡糖苷酶的伴侶包括但不限于N-甲基-DNJ，、N-乙基-DNJ、N-丙基-DNJ、N-丁基-DNJ、N-戊基-DNJ、N-己基-DNJ、N-庚基-DNJ、N-辛基-DNJ、N-壬基-DNJ、N-甲基環(huán)丙基-DNJ和N-甲基環(huán)戊基-DNJ。除了氮取代的DNJ衍生物，其他作為Gaa有用伴侶的DNJ衍生物，包括N-苯甲基取代的DNJ衍生物和具有連接到鄰近于環(huán)氮原子的C-1碳的取代基的衍生物也是本發(fā)明優(yōu)選的化合物。這樣的化合物描述于2006年5月17日提交的共同擁有的未決申請序號11/—，一。在又一個實施方案中，優(yōu)選的用于治療與另一溶酶體酶a-半乳糖苷酶((x-GalA)中雜合突變有關(guān)的神經(jīng)紊亂的伴侶以如下的化學結(jié)構(gòu)為代表其中Ri和Rr表示H、OH、或1-12碳的烷基、羥基烷基或烷氧基基團；R2和R2,獨立i44示H、LH、或N-乙酰胺基基團，或1-12碳的烷基；R4和R4獨立:Kk^示H、OH;R^和R6獨立i^示H、CH20H、CH3或COOH;R7表示H或OH;Ro表示H、甲基、或者含9-12個碳原子的直鏈或支鏈飽和或不飽和的碳鏈，任選地由苯基、羥基或環(huán)己基基團取代。在一個具體的實施方案中，伴侶是l-脫氧野尻霉素。與法布里病有關(guān)的a-GalA突變的實例包括R301Q、L166V、A156V、G272S和M2961。測定累積蛋白質(zhì)的檢測和運輸可以檢測和/或觀察ER中的蛋白質(zhì)累積，并表示為與ER定居蛋白質(zhì)如BiP共定位的管泡中核周定位的分布圖。這些蛋白質(zhì)也在它們的天然場所細胞內(nèi)如細胞表面或者在另外的細胞區(qū)室如溶酶體中降低或不存在。可利用與胞質(zhì)蛋白質(zhì)相似的共定位方法檢測細胞質(zhì)中蛋白質(zhì)的累積。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知檢測受損的溶酶體酶運輸?shù)姆椒?。例如，對于高爾基體中N-和O-糖基化的蛋白質(zhì)，利用放射性標記蛋白質(zhì)的代謝性標記脈沖追蹤，結(jié)合糖苷酶處理和免疫沉淀反應(yīng)，可用于檢測所述蛋白質(zhì)是否在高爾基體中進行完全的糖基化作用，或者它們是否保持在ER中而不是為了進一步糖基化作用運輸?shù)礁郀柣w。直觀檢測蛋白質(zhì)細胞定位的靈敏方法也包括利用熒光蛋白質(zhì)或萸光抗體的熒光顯微鏡檢。為了評價細胞樣品，可利用熒光抗體檢測蛋白質(zhì)。為了在操作的或工程化的細胞中進行檢測，目的蛋白質(zhì)可在轉(zhuǎn)染前標記有諸如綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)、青色熒光蛋白質(zhì)、黃色熒光蛋白質(zhì)(YFP)和紅色熒光蛋白質(zhì)，繼以多色和延時顯微鏡檢及電子顯微鏡檢，以研究固定細胞和活細胞中所述蛋白質(zhì)的命運。對于在蛋白質(zhì)運輸中利用熒光成像的綜述，參見Watson等人，^^Z^"gDC/v/^v.2005;57(1):43-61)。對于胞內(nèi)蛋白質(zhì)共定位的利用共焦顯微鏡檢的描述，參見Miyashita等人，Afe欲o必Mo/必^/.2004;261:399-410。另外，利用抗體的雙重標記試驗，例如LAMP-l或LysoTracke^對溶酶體(紅色)(或特異于溶酶體的其他染色或標記，如熒光量子點，級聯(lián)藍色葡聚糖(Cascadebluedextran))，以及溶酶體酶(綠色)，綠色/紅色重疊比率(共定位)可用于測量溶酶體酶的改變，例如運輸?shù)饺苊阁w的酶(提高的綠色/紅色比率意指更多的酶運輸?shù)饺苊阁w)。具有正常胞吞途徑的正常健康細胞將產(chǎn)生更多的焚光。也參見實施例2，下文。熒光相關(guān)光鐠學(FCS)是能夠進行單分子和實時分辨的超靈敏和非侵入性的檢測方法(Vukojevic等人，CMAfo/h/e5W.2005;62(5):535-50)。SPFI(單粒子熒光成像)利用高靈敏度的熒光以顯現(xiàn)那些已選擇性地標記有小熒光粒子的個體分子(Cherry等人，丑&cAe附5Vc7>wi5.2003;31(Pt5):1028-31)。對于脂我內(nèi)蛋白質(zhì)的定位，參見Latif等人，五/wfocr/^fo砂.2003;144(11):4725-8)。對于活細胞成像的綜述，參見Hariguchi，CW/5i)r""F""".2002;27(5):333-4)。熒光共振能量傳遞(FRET)顯微鏡檢也用來研究生理條件下蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和定4立(Periasamy，0/^.2001;6(3):287-91)。在優(yōu)選的實施方案中，個體中帶Gba突變的oc-突觸核蛋白的檢測可利用ELISA或western印記分析進行。LCMS/MS方法和/或TLC可用來監(jiān)測GluCer水平(底物累積)。響應(yīng)于用抑制劑和/或伴侶對動物的處理，cc-突觸核蛋白水平和寡聚體/單體比率的先體外后體內(nèi)(exv/w)監(jiān)測，可利用腦切片測定來評定。泛素化測定另外，確定泛素-溶酶體酶綴合物存在和定位的測定可用來評估突變以及響應(yīng)伴侶處理的毒性功能獲得。利用免疫組織化學或免疫熒光來定位這些綴合物的形態(tài)學研究是靈敏的檢測方法。參見實施例3，下文。如上所指出的那樣，與非應(yīng)激細胞相比低水平泛素化蛋白質(zhì)的存在可指示明蛋白酶體功能的抑制。作為另一個實例，稱為AlphaScreen(Perkin-Elmer)的方法可用于檢測泛素化蛋白質(zhì)。在該模型中，GST-UbcH5a融合蛋白質(zhì)的GST部分是利用生物素-泛素(bio-Ub)進行泛素化的。在通過E1使泛素激活之后，在有ATP參與的情況下，轉(zhuǎn)移bio-Ub到UbcH5a。在該反應(yīng)中，UbcH5a作為載體以轉(zhuǎn)移bio-Ub至其標記的GST部分。隨后通過抗-GST受體和鏈霉親和素捕獲成為生物素化和泛素化的蛋白質(zhì)。供體珠導(dǎo)致信號生成。在沒有泛素化的情況下沒有信號生成。另外，用于多種E3泛素連接酶和E2綴合酶活性測量的高通量測定可用于確定蛋白質(zhì)泛素化的增減(MesoScaleDiscovery,Gaithersburg，MD)。UPR反應(yīng)ER應(yīng)激可通過測定參與UPR的基因和基因編碼的蛋白質(zhì)的表達水平來鑒定。這樣的基因和蛋白質(zhì)包括上述的那些，在UPR早期階段上調(diào)的Grp78/BiP、Grp94和orp150。參與ER應(yīng)激的其他蛋白質(zhì)包括在經(jīng)受持續(xù)ER應(yīng)激的細胞中上調(diào)的IRE1、PERK、ATF6和XBP1。此外，延長的細胞應(yīng)激導(dǎo)致細胞凋亡，并從而上調(diào)jun激酶(JNK)及胱天蛋白酶(caspase)3、9和12。本發(fā)明考慮毒性蛋白質(zhì)或者底物累積或聚集患者與健康個體間上述指示基因和/或蛋白質(zhì)表達水平的比較。在另一個實施方案中，本發(fā)明也考慮評價特異性藥理伴侶在應(yīng)激細胞中的效果，以確定用于減輕由毒性功能獲得聚集體所引起細胞應(yīng)激反應(yīng)。作為陽性對照，ER應(yīng)激誘導(dǎo)劑諸如衣霉素、二硫蘇糖醇(DTT)、乳胞素(lacatcystin)和過氧化物可用于引起ER中解折疊蛋白質(zhì)的累積。衣霉素抑制N-連接的糖基化，而二硫蘇糖醇阻止二硫鍵形成。乳胞素是蛋白酶體抑制劑。應(yīng)激舒緩劑如蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)己酰亞胺(cyclohexamide)，可在應(yīng)激細胞中評價伴侶化合物時用作為陽性對照。通過^L陣列分析測定包括基因表達的表達水平。這可利用例如包含這類基因的AffymetrixU133基因芯片集(人類基因組)(Affymetrix，SantaClara,CA)完成。另夕卜，他人已使用該技術(shù)。例如，在6-羥基多巴胺(6-OHDA)處理后多時點收集RNA，進行微陣列分析，與數(shù)據(jù)篩選和聚類技術(shù)結(jié)合，以確定細胞應(yīng)激基因的不同的功能性亞群(Holtz等人，^wri0jdrf做fc在ie^jc2005;7:639-648)。6-OHDA是已顯示引起與細胞應(yīng)激和UPR有關(guān)的翻譯改變的帕金森氏病模擬物。細胞凋亡另外，如上所述，通過UPR不能消除的延長的持久內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激還可以導(dǎo)致神經(jīng)元細胞中的細胞程序性死亡，例如細胞凋亡。對于體外評價，神經(jīng)元細胞系如hNT2(ATCC保藏號#CRL-10742)、Hs68(#CRL-1636)、HCN-1A(#CRL-10442)、SK-N-FI(#CRL-2142)、SK誦N-DZ(#CRL國2149)、SK-N-SH(弁HTB-11)或NT2/D1(#CRL-1973),或者已在體外分化為神經(jīng)元的胚胎干細胞或神經(jīng)干細胞(參見，例如Laeng等人的US2003/0013192;及Yan等人，5te附2005;23:781-90)，可利用突變Gba轉(zhuǎn)染并用于細胞凋亡評價。因此，凋亡細胞的數(shù)目可利用例如凋亡早期指示物胱天蛋白酶3的熒光底物類似物測量?？衫帽绢I(lǐng)域的眾多方法檢測細胞凋亡，包括熒光激活細胞分選(FACS)，和/或利用熒光板讀出器(例如高通量的96孔板)。對于后者，可確定細胞凋亡或細胞死亡陽性的細胞百分比，或者相對于蛋白質(zhì)濃度可測量熒光強度。細胞/細胞器形態(tài)學神經(jīng)元的形態(tài)學異?？捎赏蛔兊鞍踪|(zhì)累積引起，并可利用形態(tài)測量分析評價。例如，轉(zhuǎn)染了tau-GFP的神經(jīng)元中神經(jīng)元形態(tài)學改變包括非對稱現(xiàn)象、前和后投射區(qū)軸突數(shù)目的減少、異常的軸突束、軸突氣泡及降低的末端分支。細胞形態(tài)學的其他改變包括聚集、細胞大小(細胞面積或細胞密度)、polymegathism(細胞大小的變化如平均細胞面積變異系數(shù))、多形性(細胞形狀的變化如六角形細胞的百分比或細胞形狀變異系數(shù))、細胞周長、平均細胞邊長、細胞形狀等等?？衫酶鶕?jù)Ventimiglia等人，/7VeMmyd臉欲o必.1995;57:63-6;和Wu等人,C微6ra/0>自.2004;14:543-54(高通量分析)描述的方法進行定量的形態(tài)測量分析，和利用圖4象分析軟件如ImagePro-Plus軟件來評價形態(tài)學。還可以通過評價細胞器形態(tài)檢測細胞/ER應(yīng)激。例如，與野生型CYOOO生產(chǎn)的釀酒酵母細胞中ER形態(tài)和膜增殖相比，CY028-表達的釀酒酵母中UPR顯示為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的異常形態(tài)并且為廣泛的膜增殖(Sagt等人，々，p/^/fl"</￡>iv//wwwew6i/Mfcra^fo^y.2002;68:2155-2160)。而且，特異的形態(tài)學指示物可與個體的聚集疾病有關(guān)。例如，在戈謝病中，巨噬細胞溶酶體中脂質(zhì)的累積導(dǎo)致活化的巨噬細胞不同的形態(tài)表征。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣存儲ER應(yīng)激也可通過測量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔和胞液中釣的水平探測，也可通過測定鉤調(diào)控蛋白質(zhì)如SERCA2b的水平檢測，SERCA2b是遍在的調(diào)節(jié)胞內(nèi)4丐存儲的釣-ATPase。作為對照，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可通過鉤耗竭誘導(dǎo)，使用例如毒胡蘿卜素。蛋白酶體功能蛋白酶體功能是對蛋白質(zhì)或底物累積的一種細胞反應(yīng)，可根據(jù)Glas等人(A^"re.1998;392:618-622)的方法測量。在活動物體內(nèi)通過成像對26S蛋白酶體功能的評價已利用生物發(fā)光成像泛素-熒光素酶報告基因?qū)崿F(xiàn)(luker等人，A^似"M^f/c/"e.2003.9，969-973)。蛋白酶體的分離和測定描迷于Craiu等人，JBC。用于蛋白酶體分離的試劑盒是市場上可買到的，例如來自Calbiochem(Cat.No.539176)。該試劑盒可用于從細胞提取物中分離蛋白酶體亞基，以研究它們的功能和與其他蛋白質(zhì)的相互作用。蛋白酶體亞基可通過將珠子直接上樣于SDS-PAGE凝膠上并利用亞基特異性抗體的免疫印跡法鑒定。可選地，與珠子結(jié)合的蛋白酶體可用于利用蛋白酶體底物的蛋白水解測定。細胞生長和運輸?shù)膒H測定細胞中蛋白質(zhì)的運輸沿pH梯度發(fā)生(即，ERpH約7.0、高爾基體卩11約6.2-7.0、高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)pH約6.0、早和晚吞飲泡pH約6.5、溶酶體pH約4.5)。在一些溶酶體貯積病中，運輸、溶酶體/吞飲泡形態(tài)和管腔(luminal)pH也遭到破壞(Ivleva等人，1991;2:398-402;Futerman和vanMeer，泡b扁O//胸.2004;5:554-65)，并且吞飲泡中升高的pH已表明促進從吞^E:泡到高爾基體嚢泡運輸?shù)哪孓D(zhuǎn)(vanWert等人，1995，上述)?？蓽y量接觸pH范圍條件的細胞(例如野生型、未經(jīng)處理的患者細胞和伴侶處理的患者細胞)的生長速率，并利用熒光板讀出器比較。細胞凋亡和細胞死亡測定(如上所述)還可以用來測定細胞存活力的pH敏感性?？蛇x地，溶酶體pH和pH對運輸?shù)挠绊懣衫霉步癸@樣吏鏡評價。通過細胞胞飲的pH敏感的熒光探針可用于測量溶酶體和吞飲泡中的pH范圍(即在pH5.0時熒光素是紅色，而在pH5.5到6.5時是藍色到綠色)?？杀容^野生型和經(jīng)伴侶處理及未經(jīng)處理的患者細胞中的溶酶體形態(tài)和pH。該測定可與平板讀出器測定并行運行，以測定pH敏感性。另外，到溶酶體的酶運輸可利用如上所述的雙重標記實驗在不同pH的細胞中評價。接觸多種pH條件的細胞(野生型、經(jīng)伴侶處理的和未經(jīng)處理的患者細胞)的內(nèi)吞作用速率可利用量子點(Quantumdots)或藍色葡聚糖(DextranBlue)測量。另夕卜，描述利用熒光脂質(zhì)類似物的測定(BODIPY-LacCer、-GMl神經(jīng)節(jié)苷脂等等)描述于Pagano，尸似/7>"朋5.2003;358-885-91。酶活性利用如上所述的蛋白質(zhì)定位測定，除了鑒定伴侶對聚集和/或運輸?shù)男Ч?，還可以利用生物化學測定來測定是否蛋白質(zhì)是功能性的，并且一旦它們已與伴侶一起離開ER進入例如溶酶體中，可用來評估修復(fù)功能的效果。活性測定通常設(shè)計成能測量在測試物質(zhì)存在或不存在時靶蛋白的活性。這類測定將取決于特定的蛋白質(zhì)。例如，蛋白質(zhì)是酶時，利用底物的胞內(nèi)酶活性測定是本領(lǐng)域常規(guī)的可用來評估酶活性。酶活性的先體外后體內(nèi)和體內(nèi)評價可利用正常動物和疾病狀態(tài)諸如下'文描述的動物模型執(zhí)行。診斷方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供一種用于診斷與溶酶體酶突變有關(guān)的危險因素、狀況或神經(jīng)紊亂的方法。因為發(fā)生在LSD患者中的神經(jīng)病學效應(yīng)可存在于其他神經(jīng)紊亂中，有溶酶體酶突變卻沒有診斷為LSD的人可能未得到有效治療。一個實例是有Gba基因雜合突變的個體，該個體處于發(fā)展的風險中或已經(jīng)發(fā)展為帕金森綜合征或帕金森氏病。其他可能與突變?nèi)苊阁w酶有關(guān)的典型神經(jīng)病學癥狀包括神經(jīng)退行性變、神經(jīng)病學退行、發(fā)作、失明、眼球運動紊亂、強直(spacisticity)、癡呆；發(fā)育延遲；神經(jīng)肌肉癥狀、周圍神經(jīng)病(神經(jīng)性疼痛)、肢端感覺異常、長時記憶損傷、腦血管事件如腦血管的事件(中風、暫時性缺血性發(fā)作)及吞咽困難。本領(lǐng)域熟知鑒定溶酶體酶突變的方法，并且包括比較來自生物樣品的溶酶體酶的酶活性，所述生物樣品來自顯示神經(jīng)病學癥狀的個體或處于發(fā)展為神經(jīng)病學癥狀風險的個體(如LSD攜帶者或LSD個體的親人)。在分子水平(即核苷酸或氨基酸改變)鑒定突變的方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，如PCR擴增繼之以測序、單鏈構(gòu)象多形性(SSCP)或?qū)τ诖髽颖纠肈NA孩史卩車歹'J(Tennis等人，Ciwicer^p^fe附^/ogv丑/o附tf尸^^s"在/V^vert^.2006;15:80-85)。特異性藥理伴侶的劑型、劑量和給藥本發(fā)明提供的特異性藥理伴侶可以以允許系統(tǒng)給藥的劑型施用，因為所述化合物需要穿過血腦屏障以發(fā)揮對神經(jīng)元細胞的作用。在一個實施方案中，特異性藥理伴侶是作為單一療法施用的，雖然考慮其他劑型，但優(yōu)選口服劑型(下文進一步描述)。在一個實施方案中，考慮劑量給藥方案應(yīng)該是可在治療個體血漿中提供化合物的周期性峰值水平。其他實施方案可在血漿中要求化合物的恒定穩(wěn)定水平。這可通過分開劑量的日常給藥或控制_釋放劑型或通過持續(xù)-釋放劑型的低頻率給藥獲得。下面詳細介紹特異性藥理伴倡的劑型、劑量和給藥。劑型特異性藥理伴侶可以以適于任何給藥途徑的形式來施用，包括例如以片劑或膠嚢或液體形式口服，或者以無菌水溶液形式注射。當特異性藥理伴侶配制為口服劑型施用時，可通過常規(guī)方法采用可藥用的賦形劑來制備片劑或者膠囊，所述賦形劑諸如粘合劑(例如預(yù)膠化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素);填充劑(例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鉤);潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石或硅質(zhì))；崩解劑(例如馬鈴薯淀粉或羥基乙酸淀粉鈉)；或者潤濕劑(例如月桂基硫酸鈉)。片劑可采用本領(lǐng)域公知的方法進行包衣。用于口服給藥的液體制品可采取例如溶液、糖漿劑或混懸劑的形式，或者它們以使用前用水或其他適當?shù)倪\載體構(gòu)造的干燥產(chǎn)品存在。這樣的液體制品可通過常規(guī)方法采用可藥用的添加劑來制備，諸如助懸劑(例如山梨糖醇糖漿、纖維素衍生物或可食用的氫化脂肪)；乳化劑(例如卵磷脂或阿拉伯膠)；非水性運載體(例如杏仁油、油性酯、乙醇或分餾植物油)；以及防腐劑(例如對羥基苯甲酸甲酯或?qū)谆郊姿岜セ蛏嚼嫠?。制品也可酌情包含緩沖鹽、調(diào)味劑、著色劑和甜味劑?？诜o藥制品可適宜地配制成控釋或緩釋特異性藥理伴侶。特異性藥理伴侶適于非經(jīng)腸/可注射使用的藥用劑型通常包括無菌的可注射溶液或分散劑的無菌散劑。在所有情況下，劑型必須是無菌的，并且必須是達到容易注射程度的流體。在生產(chǎn)和貯存條件下必須是穩(wěn)定的，并且必須在不受微生物例如細菌和真菌的污染作用下保存。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和聚乙二醇等等)，其適宜的混合物和植物油?？梢岳缤ㄟ^使用包衣如卵磷脂，在介軟劑情況下通過維持所需的粒徑和通過使用表面活性劑來維持適當?shù)牧鲃有浴？梢酝ㄟ^多種抗細菌劑和抗真菌劑來實現(xiàn)防止微生物的作用，例如對羥基苯曱酸酯、氯丁醇、苯酚、苯甲醇、山梨酸等等。在很多情況下，可合理的包含等滲劑，i例如糖或氯化鈉。可以通過在組合物中使用延遲吸收劑例如單硬脂酸鋁和明膠來實現(xiàn)可注射組合物的延長吸收。無菌的可注射溶液是這樣制備的，將所需量的特異性藥理伴侶加入所需的上文列舉的多種其他成分的合適溶劑中，然后過濾或最終滅菌。通常，分散劑是這樣制備的，將多種滅菌的活性成分加入無菌的運載體中，所述無菌運載體包含基本分散介質(zhì)和所需的來自上文列舉的其他成分。在用于制備無菌可注射溶液的無菌散劑的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍千燥技術(shù)，該技術(shù)從前面無菌濾過的溶液產(chǎn)生活性成分加任何額外期望成分的散劑。劑型可以包含賦形劑?？梢园趧┬椭械目伤幱觅x形劑有緩沖劑，例如檸檬酸鹽緩沖劑、磷酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖劑和碳酸氬鹽緩沖劑；氨基酸；脲；醇；抗壞血酸；磷脂；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、膠原和明膠；鹽，例如EDTA或EGTA和氯化鈉；脂質(zhì)體；聚乙烯吡咯烷酮；糖，例如葡聚糖、甘露醇、山梨醇和甘油；丙二醇和聚乙二醇(例如PEG-4000PEG-6000);甘油；甘氨酸或其他氨基酸；和脂質(zhì)。用于劑型的緩沖系統(tǒng)包含檸檬酸鹽、乙酸鹽、碳酸氫鹽和礴酸鹽緩沖液。磷酸鹽緩沖液是優(yōu)選的實施方案。劑型還可以包含非離子型洗滌劑。優(yōu)選非離子型洗滌劑包括聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯80、TritonX畫IOO、TritonX-114、NonidetP-40、辛烷基ct-葡糖苷、辛烷基P-葡糖苷、Brij35、Pluronic和吐溫20。給藥特異性藥理伴侶的給藥途徑可是口服的(優(yōu)選)或胃腸外的，包括靜脈內(nèi)、皮下、動脈內(nèi)、J^M內(nèi)、眼用、肌內(nèi)、經(jīng)口、直腸、陰道、眶內(nèi)、腦內(nèi)、皮內(nèi)、顱內(nèi)、脊柱內(nèi)、心室內(nèi)、鞘內(nèi)、腦池內(nèi)、嚢內(nèi)、肺內(nèi)、鼻內(nèi)、經(jīng)粘膜、透皮或通過吸入給藥。上述特異性藥理伴侶胃腸外劑型的給藥可以是周期性濃注，或者通過靜脈內(nèi)或JM內(nèi)從貯庫施用，所述貯庫是外部(例如靜脈注射袋)或者內(nèi)部(例如生物可消化的植入物)。參見例如美國專利號4，407，957和5，798，113，各文獻都引入本文作為參考。肺內(nèi)遞藥方法和裝置描述于例如美國專利號5,654,007、5，780，014和5，814，607,各文獻都引入本文作為參考。其他有用的胃腸外的遞藥系統(tǒng)包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物微粒、滲透泵、可植入輸注系統(tǒng)、泵遞藥、形成膠嚢的細胞遞藥(encapsulatedcelldelivery)、脂質(zhì)體遞藥、針頭遞藥注射、無針注射、噴霧器、霧化器、電穿孔和透皮貼劑。美國專利號5，879，327、5,520,639、5，846，233和5，704，911描述了無針注射器裝置，以上文獻的說明書引入本文作為參考。如上所述的任何劑型可采用這些方法來施用。皮下注射有允許自我給藥的優(yōu)點，同時與靜脈給藥相比也會導(dǎo)致延長的血漿半衰期。而且，為患者方便而設(shè)計了多種裝置，例如可重填充的注射筆和無針噴射裝置，可用于本文所述的本發(fā)明的劑型。劑量本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)個案為J^確定拯救內(nèi)源突變Gba的特異性藥理伴侶的有效量?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的普通方法獲得替代蛋白質(zhì)和特異性藥理伴侶的藥代動力學和藥效學數(shù)據(jù)，例如半衰期(t^)、峰值血漿濃度(Cmax)、達到峰值血漿濃度的時間(U、按曲線下面積(AUC)測量的暴露量和組織分布，以及特異性藥理伴侶/Gba結(jié)合的數(shù)據(jù)(親合常數(shù)、結(jié)合及解離常數(shù)和化合價)，以確定使替代蛋白質(zhì)穩(wěn)定但不抑制其活性，從而產(chǎn)生治療作用所需的相容量。從細胞培養(yǎng)物測定或者動物研究中獲得的數(shù)據(jù)可用來配制供人和非人動物使用的治療劑量范圍。用于本發(fā)明治療方法的化合物劑量優(yōu)選位于包括EDso濃度(測試群體的50%有效)的循環(huán)濃度范圍內(nèi)，但幾乎沒有或沒有毒性。用于任何治療的特定劑量可在一定范圍內(nèi)改變，取決于因素例如所使用的特定劑型、使用的給藥途徑、個體(例如患者)的狀況等等。治療有效量可以最初從細胞培養(yǎng)物測定中估算，并在動物模型中公式化以達到包括IC幼的循環(huán)濃度范圍?；衔锏腎Cs。濃度是達到癥狀的半數(shù)最大抑制的濃度(例如從細胞培養(yǎng)物測定中確定)。然后使用這些信息可以更準確地確定用在特定個體，例如人類患者中的合適劑量?？梢酝ㄟ^諸如高效液相色譜法(HPLC)或氣相色i普法等技術(shù)在個體例如患者中按照常規(guī)方法測定血漿中的化合物。組合物的毒性和治療功效可通過規(guī)范化的藥學方法確定，例如在細胞培養(yǎng)物測定或者使用試驗動物以確定LD5。和EDso。^toDso和ED5o^本領(lǐng)域熟知的，分別表示對群體的50%致死和對群體的50%治療有效的化合物劑量。毒性和治療作用之間的劑量比稱為治療指數(shù)，并且可表示為LDso/EDso之比。優(yōu)選顯示出大治療指數(shù)的特異性藥理伴侶。特異性藥理伴侶的最佳濃度根據(jù)使重組蛋白質(zhì)例如Gba在體內(nèi)、在組織或者循環(huán)中穩(wěn)定并誘導(dǎo)適當構(gòu)象而所需的量確定，不會持續(xù)阻止其活性或特異性藥理伴侶在組織或者循環(huán)中的生物利用度及特異性藥理伴侶在組織或者循環(huán)中的代謝。例如，若特異性藥理伴侶是酶抑制劑，則該抑制劑的濃度可通過計算酶特異性伴侶的ICs。值確定?？紤]化合物的生物利用度和代謝，然后以酶活性的作用為根據(jù)計算約為ICso值或者略高于ICso值的濃度，例如提高所施用酶的酶活性的量或者延長酶活性所需的抑制劑的量。例如，用于Gba酶的化合物異法戈明的IC5。值是0.04pM,表明它是一種有效的抑制劑。組合藥物治療用于治療患有與溶酶體酶突變有關(guān)的CNS紊亂患者的特異性藥理伴侶可組合使用治療CNS紊亂使用的其他藥物。例如，對于患有帕金森氏病的患者，諸如多巴胺受體激動劑、抗膽堿能藥、COMT抑制劑、單胺氧化酶B抑制劑。典型的物質(zhì)包括但不限于左旋多巴(Sinemet⑧；Merck)、Parlodel(溴麥角環(huán)肽曱磺酸鹽；Novartis);Permax⑧(甲磺酸培高利特；EliLilly);Requip(鹽酸羅匹尼羅(ropiniroleHC1)、Mirapex⑧(鹽酸普拉克索(pramipexoledihydrochloride));Cogetin(甲磺酸苯扎托品)；Artane㊣(鹽酸苯海索(trihexyphenidylHC1));美國Cyanamid);金剛烷胺(鹽酸金剛烷胺；DuPontMerck);和Eldepryl逸(SomersetPharmaceuticals)。基因療法的組合治療盡管基因療法在美國治療法中尚末獲得批準，但很多遺傳性紊亂的基因療法(先體外后體內(nèi)和直接轉(zhuǎn)移法)正在研究之中。本發(fā)明也考慮使用特異性藥理伴侶組合基因療法以置換神經(jīng)系統(tǒng)疾病中有缺陷的Gba基因。這樣的組合通過提高體內(nèi)治療性Gba的表達水平將提高基因療法的效力，因為除了提高突變酶的折疊和加工外，特異性藥理伴侶已表明提高野生型或者構(gòu)象型穩(wěn)定對應(yīng)物的折疊和加工(參見，例如授予Fan等人的美國專利6,274,597,實施例3)。Bankiewicz在美國專利6,309,634中描述了用于治療帕金森氏病的基因治療方法。根據(jù)該方法，在體外生產(chǎn)重組腺相關(guān)病毒(rAAV)病毒粒子，其包含編碼芳香族氨基酸脫羧酸(AADC)的核酸序列。另一研究小組最近在帕金森氏病的猴模型中，也通過重組腺相關(guān)病毒載體插入膠質(zhì)細胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)的基因(Eslamboli等人，/A^"msc/.2005;25(4):769-77)。本領(lǐng)域可獲得的任何基因治療的方法都可用于遞送治療的基因。典型的方法描述如下。對于基因治療方法的一般綜述，參見goldspiel等人，clinicalPharmacy1993，12:488-505;Wu和Wu，Biotherapy1991，3:87國95;Tolstoshev，^肌及ev.戶to廳co/.7bjc/co/.1993，32:573-596;Mulligan,5W騰仏1993,260:926-932;^SJVIorgan和Anderson，j"汰Jeu腸c/r柳.1993，62:191-217;May，7757EC好1993，11:155-215?？墒褂玫谋绢I(lǐng)域通常已知的重組DNA技術(shù)的方法描述在Ausubel等人(編輯)，1993，尸wtoco/si"Afo/ec"/",必,》/^y，JohnWUey&Sons,NY;Kriegler，1990，(？e"e7Wi附/er五jc/7rewVw，ALaboratoryManual,StocktonPress,NY;及第12和13章，Dracopoli等人(編輯)，1994，CnyrewfiVotoco/s/"/fw柳朋GewWcs，JohnWiley&Sons,NY;及Colosimo等人，所otec/^!々"^2000，29(2):314畫8，320-2，324。本發(fā)明方法施用的基因可利用本領(lǐng)域已知的普通分子生物學、微生物學和重組DNA技術(shù)分離和純化。例如，編碼耙蛋白的核酸可利用文獻中描述的重組DNA表達分離。參見，例如Sambrook，F(xiàn)ritsch&Maniatis，Mo/ecw/"rC7owiVig:爿Z^60mto/3;Ma廂a/,第二版(1989)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,紐約；Z)iVy4C7ow,Vig..J/Va"/cfl/々/7觸cA，I和II巻(D.N.Glover編輯1985);0//go鼎c/eo齡分w幼^/s(MJ.Gait編輯1984);NucleicAcidHybridization[B.D.Hames&S.J.EHiggins編輯(1985)];7>附￡77》&》"《</Th^/aftow[B.D.Hames&SJ.Higgins編輯(1984)；^w/附"/CW/C"/,""[R.I.Freshney編輯(1986)；/附附oM&ed五"z戸es[IRLPress,(1986)；B.EPerbal，爿Pm"/cff/G^/flfe7bMo/ec"/"raomTig(1984)。只要基因編碼生物活性的蛋白質(zhì)，編碼蛋白質(zhì)的核酸可是全長的或截斷的。然后，鑒定和分離的Gba基因可插入合適的克隆載體。適于基因治療的載體包括病毒、噬菌體、粘粒、質(zhì)粒、真菌載體及其他本領(lǐng)域常用的重組載體，這些已描述的載體用于多種真核和原核宿主的表達，并且可用于基因治療和簡單的蛋白質(zhì)表達。在具體實施方案中，載體是病毒載體。病毒栽體，特別是腺病毒載體可與陽離子親水脂分子l^，如提供增加對靶細胞病毒感染效率的陽離子脂質(zhì)、聚L-賴氨酸(PLL)和二乙氨基乙基葡聚糖(DELAE-葡聚糖)(參見，例如1997年11月20日提交的PCT/US97/21496，此處引用作為參考)。用于本發(fā)明的病毒載體包括來源于牛痘、皰滲病毒、AAV和逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體。特別地，皰瘆病毒，尤其是單純皰療病毒(HSV)，諸如在美國專利號5，672，344中公開的那些(其公開內(nèi)容引入本文作為參考)，尤其可用于將轉(zhuǎn)基因遞送至神經(jīng)元細胞。AAV載體，諸如在美國專利號5，139，941、5,252,479和5，753，500及PCT公開WO97/09441中公開的那些(其公開內(nèi)容引入本文作為參考)也是有用的，因為這些載體整合入宿主染色體，具有載體重復(fù)給藥的最低需要。對于基因治療中病毒載體的綜述，參見McCoimdl等人，仔畫G騰77^.2004;15(11):1022-33;Mccarty等人，^w簡及ev2004;38:819-45;Mali等人，C//".尸/^nmicoA:,""2002;41(12):卯1畫11;Scott等人，7Ve"/wmwc"/Z)/^m/.2002;12Suppll:S23-9。另外，參見美國專利號5，670，488。遞送的基因的編碼序列有效連接于表達調(diào)控序列，例如指導(dǎo)基因表達的啟動子。如本文使用的，短語"有效連接"表示多核苷^/基因與核苷酸的調(diào)控和效應(yīng)序列如啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄和翻譯終止位點及其他信號序列的功能關(guān)系。例如，核酸到啟動子的有效連接表示多核苷酸和啟動子之間的物理和功能關(guān)系，從而通過特異性識別并結(jié)合啟動子的RNA聚合酶從啟動子起始DNA的轉(zhuǎn)錄，并且其中啟動子指導(dǎo)多核苷酸的RNA轉(zhuǎn)錄。在一個具體實施方案中，所使用的載體中編碼序列和任何其他期望序列的側(cè)翼是促進在基因組期望位點同源重組的區(qū)域，從而提供已整合入基因組中核酸分子構(gòu)建體的表達(Koller和Smithies，外wA/ii汰爿cfld5Vif/5L4.1989，86:8932-8935;Zijlstra等人，7V必w^.1989，342:435-438;授予Zarling等人的美國專利號6,244,113;及授予Pati等人的美國專利號6,200,812)?；蜻f送載體遞送入患者可是直接的或者間接的，在直接遞送的情況下患者直接接觸載體或遞送復(fù)合物，在間接遞送的情況下，首先在體外將載體轉(zhuǎn)化細胞，然后移植入患者。這兩種方法分別稱為體內(nèi)和先體外后體內(nèi)的基因治療。直接轉(zhuǎn)移在具體實施方案中，載體直接體內(nèi)施用，進入生物體的細胞并介導(dǎo)基因表達。這可利用本領(lǐng)域已知的和上述討論的任何多種方法實現(xiàn)，例如通過構(gòu)建其作為合適表達載體的一部分并施用以使之成為細胞內(nèi)的，例如通過利用缺陷型的或減毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他病毒載體(參見美國專利號4，980，286)，或通過棵DNA的直接注入，或通過利用微:粒轟擊(例如基因槍；Biolistic，Dupont);或者包被有脂質(zhì)或細胞表面受體或轉(zhuǎn)染劑，在生物高分子中包嚢化(例如聚-P-l-64-N-乙酰葡糖胺多聚糖；參見美國專利號5，635，493)，在脂質(zhì)體、微?；蛭⒛z嚢中包嚢化；通過連接到已知進入細胞核的肽或其他配體上施用；或者通過連接到經(jīng)受受體介導(dǎo)胞吞的配體上施用(參見，例如Wu和Wu，丄肌o/.C7^肌1987，62:4429-4432)，等等。在另一個實施方案中，核酸-配體復(fù)合物可這樣形成，其中配體包含融合病毒肽以干擾吞飲泡，使核酸避免溶酶體降解，或者配體包含陽離子12-mer肽，例如來源于觸角足(antennapedia)的可用于向細胞中傳遞治療性DNA(mi等人，A^/.77^m/，j;.2000，2:339-47)。在又一個實施方案中，核酸可以通過尋靶特異性受體而靶向體內(nèi)，進行細胞特異性吸收和表達(參見，例如PCT申請?zhí)朩O92/06180、WO92/22635、WO92/20316和WO93/14188)。最近，一項稱為磁性轉(zhuǎn)染(magnetofection)的技術(shù)已經(jīng)用于向哺乳動物遞送載體。該技術(shù)將載體結(jié)合至超順磁納米顆粒，在磁場的影響下進行遞送。該應(yīng)用降低了遞送時間并提高載體效力(Scherer等人，7T^m/y;.2002;9:102-9)。下文對載體的描述考慮另外的尋靼和遞送方法學。在具體實施方案中，核酸可以利用脂質(zhì)載體施用。脂質(zhì)載體可以與棵核酸結(jié)合(例如質(zhì)粒DNA)以易于穿過細胞膜。陽離子的、陰離子的或者中性的脂質(zhì)可以用于該目的。然而，優(yōu)選陽離子的脂質(zhì)，因為它們已表明更好的結(jié)合通常帶有負電荷的DNA。陽離子的脂質(zhì)也已表明可介導(dǎo)質(zhì)粒DNA的胞內(nèi)遞送(Feigner和Ringold,7V"似m1989;337:387)。對小鼠的陽離子脂質(zhì)-質(zhì)粒復(fù)合物的靜脈注射表明導(dǎo)致該DNA在肺中表達(Brigham等人，爿肌/A/^i5W.1989;298:278)。也參見，Osaka等人，/1996;85(6):612畫618;San等人，好"附朋T^era/;》1993;4:781-788;Senior等人，i/^c/rew/ctf一&"cto.1991j1070:173-179);Kabanov和Kabanov，B/^wiy"g她Cfe棚.1995;6:7-20;Liu等人，戶/ww7wamillies1.1996;13;Remy等人,丑&co"乂喂她Cfe柳.1994;5:647-654;Behr,J-P"Jtowiy唯flteCAe肌1994;5:382-389;Wyman等人，5&c/^附.1997;36:3008-3017;授予Marshall等人的美國專利號5，939，4011;和授予Scheule等人的美國專利號6，331，524。典型的陽離子脂質(zhì)包括在例如美國專利號5,283,185及美國專利號5，767，099中公開的那些，其公開的內(nèi)容引入本文作為參考。在優(yōu)選的實施方案中，陽離子脂質(zhì)是在美國專利號5，767，099中公開的N4-精胺膽固醇氨基甲酸酯(GL-67)。另外的優(yōu)選脂質(zhì)包括N4-亞精胺膽甾醇氨基甲酸酯(GL-53)和l-(N4-精胺)-2,3-二月桂甘油氨基甲酸酯(GL-89)。優(yōu)選，對于病毒載體的體內(nèi)給藥，合適的免疫抑制處理與病毒載體諸如腺病毒載體聯(lián)合使用，以避免病毒載體和所轉(zhuǎn)染細胞的免疫鈍化。例如，可施用免疫抑制性細胞因子如白細胞介素-12(IL-12)、干擾素-y(IFN-力，或者抗CD4抗體以封閉對病毒載體的體液或細胞免疫反應(yīng)。在那方面，使用工程化以表達最小量抗原的病毒載體是有利的。間才妄轉(zhuǎn)移利用如上所述的任何方法可用編碼野生型蛋白質(zhì)的構(gòu)建體先體外后體內(nèi)工程化體細胞，然后再植入個體。該方法通常描述于授予Selden等人的WO93/09222中。另外，用于基于細胞送遞的專用ImPACT技術(shù)的技術(shù)描述于Payumo等人，C7kOW/^p"Mfl"flf及eto^ies.2002;403S:S228-S242。在這樣的基因治療系統(tǒng)中，從患者取出體細胞(例如成纖維細胞、肝細胞或內(nèi)皮細胞)，體外培養(yǎng)，用治療目的基因轉(zhuǎn)染，表征，然后再引入患者?？墒褂贸跫壖毎?來源于患者或組織并在傳代前工程化)，和次級細胞(在引入體內(nèi)前在體外傳代)及本領(lǐng)域已知的永生化細胞系。對本發(fā)明方法有用的體細胞包括但不限于體細胞諸如成纖維細胞、角質(zhì)細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞、膠質(zhì)細胞、神經(jīng)細胞、血液有形成分、肌細胞、其他可以培養(yǎng)的體細胞及體細胞前體細胞。在優(yōu)選的實施方案中，細胞是成纖維細胞或間質(zhì)干細胞。核酸構(gòu)建體用來轉(zhuǎn)染欲生產(chǎn)編碼產(chǎn)物的初級或次級細胞，所述核酸構(gòu)建體包含外源基因和任選的可選擇標記編碼核酸以及在初級或次級受體細胞中表達外源基因所必需的附加序列。這樣的構(gòu)建體包含但不限于用于該目的的感染性載體，諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰瘆病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、腮腺炎病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒載體。間質(zhì)干細胞(MSC)是在骨髓中產(chǎn)生的非血液生產(chǎn)的干細胞。MSC可進行分化，并增殖為特化的非血液組織。由于其自我更新能力，轉(zhuǎn)染有逆轉(zhuǎn)錄病毒的干細胞是用于治療的優(yōu)良候選物。該能力避免基因治療的重復(fù)給藥。另一個優(yōu)點是如果注射的干細胞到達目標器官然后分化，它們可以在該器官代替損傷或畸形的細胞。作為一個實例，對于戈謝病，正進行試驗用編碼Gba基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)來自個體的體干細胞，然后經(jīng)校正的干細胞返回到患者，在患者體內(nèi)它們在骨髓定居并產(chǎn)生Gba表達細胞如巨噬細胞。伴^這遽當與編碼治療性基因的基因療法組合給藥時，可以根據(jù)如上所述的方法和劑型施用特異性藥理伴倡。與底物抑制劑組合另外，也考慮本發(fā)明的小分子伴侶與如
背景技術(shù)：
描述的其他小分子底物抑制劑的組合。因為甚至輕微減少溶酶體酶活性就可以導(dǎo)致脂質(zhì)累積升高，其可接著改變細胞中磷脂平衡或者啟動導(dǎo)致細胞凋亡的信號事件。典型的底物抑制劑包括抑制神經(jīng)酰胺特異性葡萄糖基轉(zhuǎn)移敏還原糖脂底物)的NB誦DNJ(Miglustat)(Kasperzyk等人，/o"脂/A^"麼Actm/^2004.89:645-653)。實施例通過如下所述的實施例進一步描述本發(fā)明。這些實施例的用途僅僅是說明性的并絕不限制本發(fā)明或任何舉例說明術(shù)語的范圍和含義。同樣地，本發(fā)明不局限于本文描述的任何具體優(yōu)選的實施方案。實際上，本發(fā)明的許多修改和變化對閱讀過該說明書的本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易見的。因此本發(fā)明僅僅由所附的權(quán)利要求書以及相當于授權(quán)權(quán)利要求書的全部范圍所限定。實施例l:用特異性藥理伴侶處理的L444P轉(zhuǎn)基因小鼠腦中Gba活性提高的確定L444P是與2型和3型戈謝病有關(guān)的突變。L444P轉(zhuǎn)基因小鼠(在葡糖神經(jīng)酰胺合成酶無效基礎(chǔ)上純合型的人L444P突變Gba)顯示出腦中Gba活性的缺陷。然而，由于葡糖神經(jīng)酰胺合成酶基因的破壞，這些小鼠沒有顯示出在例如巨噬細胞中GluCer的累積。伴隨的葡糖神經(jīng)酰胺合成酶混亂是必需的，以前因為由于表皮阻滲透性功能削弱使得L444P轉(zhuǎn)基因小鼠在出生3天內(nèi)死亡。在該實驗中，利用異法戈明或C-苯曱基-異法戈明處理L444P轉(zhuǎn)基因,J、鼠，并在第l、3、6和12個月測量替代標記以確定伴倡的效力。另外，也評價了在伴侶處理4周后經(jīng)2周非伴侶處理"洗脫(washout)"周期后的小鼠中替代標記返祖到未經(jīng)處理對照水平的情況。方法掙弄^^理伴估A理在其飲用水中對小鼠施用異法戈明或C-苯曱基異法戈明，不限量。根據(jù)消耗的水體積估算的日劑量約為10mg/kg/天。廯^G6fl活'絲的溯/;t在l、3、6和12個月末時，處死小鼠并評價腦中Gba酶活性的提高。收集新鮮的(利用PBS洗去血液)或從冷凍材料解凍的腦組織。切碎組織，并于冰上在200-500pl的McIlvaine(MI)緩沖液(在0.1M檸檬酸鹽和0.2]\1磷酸鹽緩沖液中的0.25%?；悄懰徕c，0.1%Tritonx-lOO，pH5.2)中勻漿，然后進行10，000xg離心。收集上清并可在該步驟冷凍。將來自腦組織勻漿的約1-10jil上清添加到干凈的96孔平板用于微量BCA蛋白質(zhì)測定(Pierce，cat#—23235)，根據(jù)廠家方案定量總蛋白質(zhì)的量。作為陰性對照，另一個IOjil添加到黑色平板，與10fil2.5mM的Gba活性抑制劑CBE(6.7ml緩沖液中2.7mg牛彌菜醇(Conduritol)B環(huán)氧化物)混合，置于室溫(RT)30分鐘。然后添加Gba底物即50jd的3mM4-甲基傘形酮-P-0-葡糖苷(4-]\111-P-D-葡糖苷；新鮮制備，粉末溶于0.211110]\180，然后利用MI緩沖液定容到合適的體積)，而黑色平板在37*0再孵育1小時。孵育后，添加10nl上清到第二個黑色平板中，與10jil的MI緩沖液和50ji16mM的Gba底物4-MU-P-D-葡糖苷混合，然后在37X:賻育1小時。通過添加70jilpH10.8的0.2M甘氨酸終止反應(yīng)。在平板讀出器(Victor21420多標記計數(shù)器；Wallac)中于F46o條件下讀出平板。利用下列公式確定相對的|3-葡萄糖活性(F柳無CBE-F46o^CBE)/(A5so樣本-A劍緩沖液)基于4-MU標準曲線將F46o讀數(shù)轉(zhuǎn)化為4-MUnmole數(shù)，而基于蛋白質(zhì)標準曲線將A劍轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)mg數(shù)。Gba活性的一個單位定義為l小時釋^L的4曙MU腿ole數(shù)。遂應(yīng)^f《為了確定在停止處理后，以飲用水形式給藥的AT2101對L444P小鼠的作用是否并且什么期限發(fā)生倒退，進行洗脫研究。九個雄性3月齡L444P小鼠的給藥劑量約為10mg/kg/天，給藥4周，以等數(shù)目的未處理小鼠作為對照。在第4周末處死四個處理的和四個未處理的小鼠，并且剩余動物不進一步用異法戈明處理，即在處死前給予它們另外2周正常的飲用水并評價腦中Gba活性。結(jié)果腐^G^fl活^在異法戈明處理僅僅兩周后，觀察到腦中Gba活性顯著增加(圖1A)，這種現(xiàn)象持續(xù)4-12周。值得注意的是，在腦中異法戈明處理導(dǎo)致從未處理小鼠中的約lU/mg增加到2和4周處理后的約4.5U/mg，并在12周后進一步達到約6U/mg(p<0.001)。只要施用伴侶，預(yù)計增加的Gba活性將持續(xù)3、6和12個月。與此類似，兩周后，C-苯曱基異法戈明處理的小鼠也在器官如脾中顯示出顯著增加的Gba活性，并且在肺和腦中傾向于活性增加(數(shù)據(jù)未顯示)。預(yù)計在更一步處理后Gba活性的增加將在其他器官包括腦中觀察到，因為在利用AT2206處理兩周后，在腦中傾向于活性增加(數(shù)據(jù)未顯示)。遂應(yīng)類似于上述，在10mg/kg/天處理4周后，L444P轉(zhuǎn)基因小鼠腦中Gba活性顯著升高(圖lB)。討論這些結(jié)果提供的第一個指示是生理水平的伴侶足以穿過血腦屏障提高腦和外圍器官的Gba活性(例如脾和肝臟)。這是令人驚奇的，因為外圍施用的藥劑為達到在腦中有效往往必須以較高的劑量施用。在低抑制性Gba抑制劑用作伴侶的情況下，在外圍抑制劑的高劑量將抑制突變Gba,由此阻撓如以前表明的提高酶活性的目的。在用IFG處理的猴中獲得了相似的結(jié)果，處理后在CSF中發(fā)現(xiàn)IFG。實施例2:在戈謝病成纖維細胞中破壞的溶SI^:輸?shù)男迯?fù)盡管N370S戈謝病成纖維細胞(來自人類患者)沒有表明在細胞質(zhì)中累積底物(即GluCer)，但這些成纖維細胞與野生型成纖維細胞相比顯示出異常的溶酶體蛋白質(zhì)和Gba染色。利用藥理伴侶異法戈明處理的N370S成纖維細胞增加了見于溶酶體中Gba的量，并且修復(fù)細胞為正常溶酶體染色模式。方法細胞培養(yǎng)在5%C02、于37。C，在具有10%FBS和1。/。青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)N370S成纖維細胞(DMN89.15)。來自健康個體的野生型成纖維細胞系CRL-2097用作對照。將細胞從IOcm平板移入12孔有蓋平板進行傳代培養(yǎng)。利用38ml培養(yǎng)液稀釋來自一個匯合10cm平板的細胞。從10mM儲液(5%二甲亞砜)按下列濃度添加異法戈明或C-苯曱基-異法戈明到12孔平板的各孔C-苯甲基-異法戈明-對照(僅僅第二抗體)；未處理的；0.03jiM;0.1HM;0.3nM;1.0fiM;3.0^M;和IO.OpM。異法戈明-對照(僅僅第二抗體)；未處理的；10nM;30^M;100nM;1載3載和10nM。培養(yǎng)細胞共約6天。固定及染色在PBS中洗滌細胞5分鐘，在3.7。/。多聚甲醛(于PBS)中固定15分鐘，再一次在PBS中洗滌5分鐘，并用0.5。/。皂苷(saponin)透化5分鐘。然后利用含0.1。/。皂苷的PBS洗滌細胞，與新鮮的0.1%硼氬化鈉/0.01%皂苷處理5分鐘，并利用0.;r/。皂苷/l。/。BSA的PBS洗滌3次，每次5分鐘。細胞在具有1%BSA、500jil第一抗Gba抗體(l:200)或抗LAMP-l抗體(1:200;BDPharmingen,Cat.No.555798)的PBS溶液中賻育1小時，根據(jù)廠家說明書利用LysoTracker⑧紅(Cambrex，Rutherford,NJ)對溶酶體染色。孵育后，利用含有0.1。/。皂苷1。/。BSA的PBS洗滌細胞3次，然后與第二抗體溶液(1:500;抗Gba的抗兔AlexaFluor588和抗LAMP-l的抗鼠IgGAlexaFluor594)孵育。將細胞封固于蓋玻片，密封并立即觀察。共焦顯孩史鏡檢利用共焦顯微鏡觀察細胞。設(shè)置紅色和綠色信號通道為6，并利用強度窗優(yōu)化激光功率，并且在余下的實驗中不調(diào)整。在相同的位置分析所有的載玻片并收集所有的圖像沒有任何變焦距、利用20x和60x透鏡、小孔、最佳象素大小，平均掃描2次、并且如上述的所有實驗紅色和綠色信號通道同時探測。在相同的強度顯示全部圖像，并且通過將光標置于最大數(shù)目的細胞上對每個圖像產(chǎn)生紅色+綠色信號通道強度圖。進一步的測量可通過計算紅色(LAMP-1)和綠色(GBA)象素的疊加比率進行。結(jié)果利用LysoTracke,紅染色，與點狀染色模式的正常成纖維細胞相比(圖2B)，匯合5天以上的戈謝病N370S成纖維細胞顯示出顆粒狀溶酶體染色模式(圖2A)。L444P成奸維細胞顯示相似的結(jié)果(未顯示數(shù)據(jù))。N370S和正常的成纖維細胞均顯示溶酶體LAMP-1染色(分別為圖2C、2D)。戈謝病成纖維細胞中顯示更多的LAMP-1。利用30.0jiM異法戈明(AT2201)(圖2G-H)和3.0jdC-苯甲基異法戈明(AT2206)(圖2I-J)處理增加溶酶體中Gba的量，并且與未處理的對照(圖2E-F)相比重建正常溶酶體Gba和LAMP-l的點狀染色模式，如通過雙重染色所顯示的那樣。圖2K-N顯示N370S戈謝病成纖維細胞中Gba染色的改變?nèi)缦?K)-對照(僅僅第二抗體)；(L)-未處理的N"OS成纖維細胞；(M)-30jiM異法戈明；和(N)3jiMC-苯曱基-異法戈明。Gba染色顯示相對未處理的對照在伴侶處理中到溶酶體的定位。L444P戈謝病成纖維細胞獲得相似的結(jié)果(未顯示數(shù)據(jù))。用伴侶處理后正常細胞形態(tài)的改善是由于在ER和/或胞液中很可能為聚集形式的突變Gba量或累積減少。因此，該策略可減輕具有雜合的N370S突變的帕金森氏病患者或者具有缺A的雜合戈謝病患者中的CNS癥狀，實施例3:戈謝病成纖維細胞中利用伴侶處理后多聚泛素化蛋白質(zhì)的增加；蛋白酶體降解途徑的修復(fù)抗多聚泛素化蛋白質(zhì)(PUP)和抗Gba標記的健康人成纖維細胞與來自具有L444PGba突變的戈謝病患者的成纖維細胞和具有N370SGba突變的戈謝病患者的成纖維細胞比較。方法細胞培養(yǎng)在5%C02、于37。C，在具有10%FBS和1。/。PS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)L444P戈謝病成纖維細胞(細胞系GM10915);N370S戈謝病細胞(CRL-2097)。將細胞從IOcm平板移入12孔有無菌蓋的平板對進行傳代培養(yǎng)。按1:6稀釋來自一個匯合T-75搖瓶的N370S細胞，并再培養(yǎng)4天。從IOmM儲液(5%二曱亞砜)按下列濃度添加異法戈明或C-苯甲基-異法戈明到12孔平板的各孔C-苯曱基-異法戈明-未處理的；對照(僅僅第二抗體)；0.03jiM;0.1jiM;0.3jiM;1.0jiM;3.0jiM;和IO.OjiM。異法戈明-未處理的；對照(僅僅第二抗體)；IOjiM;30jiM;100jiM;1載3載和IOnM。固定及染色在PBS中洗滌細胞5分鐘，隨后在新鮮的3.7%多聚曱醛中固定15分鐘。然后在PBS中洗滌細胞一次5分鐘，隨后在0.2%TritonX-100中透化5分鐘。然后再一次在PBS中洗滌5分鐘，并用新鮮的0.1%硼氫化鈉處理5-10分鐘。在染色前利用含有1%BSA的PBS洗滌細胞3次(每次5分鐘)。細胞與500jil如下的第一抗體(利用含有1%BSA的PBS按1:200稀釋)孵育l小時1、泛素化蛋白質(zhì)克隆FK1的小鼠單克隆抗體(AFFINITIResearchProductsCat.No.PW8805)2、市場上可買到的兔抗Gba抗體，例如8E4然后利用含有1%BSA的PBS洗滌細胞三次，隨后利用1:500稀釋的下列第二抗體孵育l小時1、山羊抗小鼠IgM(n鏈)AlexaFluor568(MolecularProbesCat.No.A21043);2、山羊抗兔IgG(H+L)高交叉吸收的AlexaFluor488(MolecularProbesCat.No.A11034)在含有BSA的PBS中洗滌細胞三次，封固，觀察之前在4X:保存。結(jié)果素/蛋白酶體途徑。因此，利用伴侶降低聚集對蛋白酶體介導(dǎo)的降解途徑有積極的作用。討論L444P突變的戈謝病患者具有廣泛的CNS受累情況。這可能是由于人類L444P突變酶比例如N370S更不穩(wěn)定，使它更可能形成蛋白質(zhì)聚集體，并從而抑制泛素/蛋白酶體途徑(Tsuji等人，7V￡>1多/1987;315:570)。很多其他的神經(jīng)變性疾病是由導(dǎo)致泛素化蛋白質(zhì)累積的突變所引起的，并且已有進一步的報道表明蛋白質(zhì)聚集體可直接削弱泛素/蛋白酶體途徑并資導(dǎo)炎癥介質(zhì)的表達(li等人，7Zre/"fe^iflrtfe"o/<5i^c/re附&吵在O//5油欲.2003;35:547-552)。若利用特異性藥理伴侶穩(wěn)定小鼠L444P,通過增加到溶酶體的Gba運輸減輕泛素/蛋白酶體途徑的應(yīng)激，從而延長突變Gba的半衰期一一將其運輸?shù)娜苊阁w，而不是在ER中降解。這解釋了與戈謝病成纖維細胞相比在正常成纖維細胞中增加的PUP染色。其他在臨床上沒有引起明顯CNS癥狀的Gba突變(即N370S)仍可引起ER和胞液中突變蛋白質(zhì)的累積，引發(fā)泛素/蛋白酶體途徑的額外應(yīng)激或者通過降低細胞單泛素化蛋白質(zhì)的能力而破壞神經(jīng)元中的運輸。*****本發(fā)明不限于本文描述的具體實施方案的范圍。實際上，除了本文描述的那些，根據(jù)前述說明書和附圖的本發(fā)明的各種改變對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易見的。這樣的改變落入所附權(quán)利要求書的范圍。應(yīng)進一步理解的是，所有值都是近似值，并且用于說明目的。對于所有目的，本申請通篇引用的專利、專利申請、出版物、產(chǎn)品說明和方案公開的內(nèi)容整體51入本文作為參考。權(quán)利要求1、一種用于治療個體神經(jīng)紊亂的方法，其中神經(jīng)紊亂與溶酶體酶編碼基因的突變相關(guān)，該方法包括對個體施用有效量的結(jié)合溶酶體酶的特異性藥理伴侶。2、權(quán)利要求l的方法，其中個體是純合型的突變。3、權(quán)利要求l的方法，其中個體是半合子型的、雜合型的或者復(fù)合雜合型的突變。4、權(quán)利要求l的方法，其中突變是構(gòu)象突變體。5、權(quán)利要求4的方法，其中伴侶增加突變酶從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的運輸和/或修復(fù)酶活性。6、權(quán)利要求4的方法，其中突變導(dǎo)致其他細胞物質(zhì)的量增加或者聚集。7、權(quán)利要求6的方法，其中細胞物質(zhì)是脂質(zhì)或者其他蛋白質(zhì)。8、權(quán)利要求l的方法，其中溶酶體酶是葡糖腦苷脂酶，而神經(jīng)紊亂是帕金森氏病或帕金森綜合征。9、權(quán)利要求8的方法，其中帕金森氏病是早期發(fā)病的帕金森氏病。10、權(quán)利要求l的方法，其中特異性藥理伴侶是溶酶體酶的抑制劑。11、權(quán)利要求10的方法，其中抑制劑是可逆性抑制劑。12、權(quán)利要求10的方法，其中抑制劑是竟爭性抑制劑。13、權(quán)利要求8的方法，其中特異性藥理伴侶是異法戈明或者(5R，6R，7S，8S)-5-羥甲基-2-辛烷基-5，6，7，8-四氫咪唑并[l，2-al吡啶-6，7，8-三醇。14、權(quán)利要求13的方法，其中個體是雜合型的或者純合型的N370S突變。15、權(quán)利要求13的方法，其中個體是雜合型的84GG突變。16、權(quán)利要求13的方法，其中個體是雜合型的R496H突變。17、一種用于診斷與突變?nèi)苊阁w酶相關(guān)的神經(jīng)紊亂的方法，包括篩選個體，所述個體顯示出一個或多個溶酶體酶突變的神經(jīng)病學癥狀。18、權(quán)利要求17的方法，其中突變是構(gòu)象突變。19、權(quán)利要求17的方法，其中篩選是與健康個體生物樣品相比測定個體生物樣品中降低的酶活性。20、權(quán)利要求17的方法，其中神經(jīng)紊亂是帕金森綜合征或者帕金森氏病。全文摘要本發(fā)明描述的是用于治療患有神經(jīng)病學紊亂個體的方法，該神經(jīng)病學紊亂與溶酶體酶編碼基因的突變有關(guān)。具體地，對個體施用溶酶體酶的特異性藥理伴侶，其增加神經(jīng)細胞中蛋白質(zhì)從ER到溶酶體的運輸，有或者沒有伴隨地增加神經(jīng)細胞中的酶活性。運輸?shù)男迯?fù)減輕細胞應(yīng)激反應(yīng)及其他與突變蛋白質(zhì)累積有關(guān)的毒性。酶活性的修復(fù)減輕底物累積及與脂質(zhì)累積有關(guān)的病狀。在一個具體實施方案中，神經(jīng)病學紊亂是與葡糖腦苷脂酶突變有關(guān)的帕金森氏病或者帕金森綜合征。文檔編號A01N43/40GK101541172SQ200680029226公開日2009年9月23日申請日期2006年6月8日優(yōu)先權(quán)日2005年6月8日發(fā)明者B·烏斯特曼申請人:阿米庫斯治療學公司