專利名稱：防治煙草花葉病毒病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物保護(hù)，尤其涉及一種利用雙鏈RNA干擾技術(shù)防治煙草花葉病毒病的方法。
技術(shù)背景煙草花葉病毒引起的花葉病是煙草、番茄等作物上的花葉病是十分重要的 病害，世界各地發(fā)生普通，損失嚴(yán)重。如在煙草上自苗期至大田期可連續(xù)發(fā)生， 幼苗被侵染后，新葉的葉脈顏色變淺，呈半透明的"明脈癥"，而后形成黃綠相間 的花葉癥；苗期侵染的植株發(fā)育緩慢，幾乎沒(méi)有經(jīng)濟(jì)價(jià)值。大田期植株發(fā)病， 除顯示明脈、花葉癥狀以外，病葉上會(huì)形成皰斑，厚薄不勻；葉形也會(huì)出現(xiàn)各 種畸形，如葉緣反巻、皺縮扭曲.葉緣缺刻或成帶狀。病毒致病功能被認(rèn)為與 衣殼蛋白進(jìn)入葉綠體有關(guān)，衣殼蛋白上個(gè)別氨基酸的改變導(dǎo)致癥狀的較大變異。 煙草花葉病毒寄主范圍廣，屬于世界性分布；自然傳播不需要介體生物，靠植 株間的接觸(或有時(shí)種子)傳播；對(duì)外界環(huán)境的抵抗力強(qiáng)。煙草花葉病毒形態(tài)為 直桿狀，直徑18nm，長(zhǎng)300nm;粒體分子量為40xl06u。 TMV是研究相當(dāng)深 入的植物病毒典型代表，其體外存活期一般在兒個(gè)月以上。在干燥的葉片中可 以存活50多年；鈍化溫度9(TC左右。TMV主要靠病汁液接觸傳播，在農(nóng)事操作中沾染了病株汁液的手或工具通過(guò)接觸煙苗的微傷口侵入。由于病毒的抗逆 力很強(qiáng)，混有病株殘?bào)w的肥料、種子、土壤和帶病的其它寄主植物及野生植物， 甚至烤過(guò)的煙葉、煙末都可以成為病害的初侵染來(lái)源。這些初侵染源或移入大 田的病苗，通過(guò)各種接觸媒介引起再侵染，使病害在田間擴(kuò)展蔓延。目前，煙草花葉病毒的防治主要利用化學(xué)農(nóng)藥和轉(zhuǎn)基因煙草方法。化學(xué)農(nóng) 藥的大量使用使病毒的抗藥性日益明顯，人們不得不加大藥量，這是一種惡性 循環(huán)，結(jié)果造成了高量的農(nóng)藥殘留。殘留的農(nóng)藥不但會(huì)危害煙草使用人員的健 康，而且直接影響了我國(guó)煙草的出口創(chuàng)匯。同樣，雖然轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以高效的 控制病毒病的發(fā)生和發(fā)展，其生物安全性卻引起了國(guó)內(nèi)外專家和政府的高度重 視，轉(zhuǎn)入的基因及其附帶成分具有插入人類基因組的可能性，因此轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品 在大多數(shù)國(guó)家都有法律限制。根據(jù)這些情況，人們必須找到一種更為安全和有 效的抵御植物病毒病的方法。
RNA干擾(RNA interference ,RNAi)是一種古老而保守的生物現(xiàn)象，由21 23個(gè)核苷酸雙鏈siRNA介導(dǎo)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄后基因沉默可以顯著控制病毒的復(fù)制 增殖，達(dá)到防治煙草病毒病的目的。siRNA由較大的雙鏈RNA經(jīng)Dicer酶的降 解產(chǎn)生,然后再以單鏈siRNA為引物以mRNA為模板合成長(zhǎng)dsRNA ,再由Dicer 酶切割形成siRNA，以此反復(fù)進(jìn)行實(shí)現(xiàn)RNAi的放大效應(yīng)。多種蛋白酶參與RNAi 過(guò)程，包括Dicer酶、RDRP、 RDE-1、 Argonaute家族、螺旋酶和核酸酶等。其 中Dicer酶非常重要，一些參與siRNA的形成,而另一些則參與RNA誘導(dǎo)的沉默 復(fù)合體的形成。Dicer酶有l(wèi)個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)域、2個(gè)RNA酶III結(jié)構(gòu)域、2個(gè)dsRNA 結(jié)合域以及1個(gè)PZA結(jié)構(gòu)域，進(jìn)化上很保守,以二聚體的形式起作用，有類似 RNasein酶的活性，被認(rèn)為是RNaseIII家族成員之一。在植物、線蟲、果蠅和哺 乳動(dòng)物體內(nèi)均存在Dicer酶的同源體,這些蛋白結(jié)構(gòu)相似,而且具有相似的生化功 能,提示RNA干擾具有進(jìn)化保守的相似的生化功能。目前，雖然已有多家單位 正在研究如何利用siRNA防治植物病毒病，但是因該RNA化學(xué)合成方法的成本 很高，而且將RNA注射進(jìn)大量的植物體內(nèi)很難實(shí)現(xiàn)，所以其成果難以產(chǎn)業(yè)化。那么，如果人們能夠利用發(fā)酵生產(chǎn)的辦法大量制造siRNA,而且不必將 siRNA注射進(jìn)煙草植株內(nèi)部就可以控制煙草花葉病毒的復(fù)制和增殖，這將是-一 種十分理想的方法。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用雙鏈RNA干擾技術(shù)防治煙草花葉病毒病的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案 一種防治煙草花葉病毒病的 方法，包括以下步驟提取錄煙草花葉病毒的RNA基因組；利用煙草花葉病毒的RNA基因組，反轉(zhuǎn)錄得到煙草花葉病毒運(yùn)動(dòng)蛋白的cDNA;利用PCR技術(shù)分 離煙草花葉病毒運(yùn)動(dòng)蛋白cDNA上150-800bp內(nèi)21-23bp長(zhǎng)的片斷；將上述片段 克隆入可表達(dá)RNA的質(zhì)粒載體；使克隆的片段在缺失RNA酶的大腸桿菌內(nèi)表 達(dá)成RNA;粉碎細(xì)胞，并將其制成濃度為2-20ng/ml懸浮溶液；將懸浮液稀釋 1000倍后噴施于煙草的葉面上。在煙草上的噴施量為10-100 ng/畝。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果本方法生產(chǎn)簡(jiǎn)便、成本低 廉、對(duì)人畜和高等動(dòng)物無(wú)害，適于在煙草上大量施用，具有廣闊的產(chǎn)業(yè)化前景。 制成的懸浮劑克服了可濕性粉劑和乳油劑的缺陷，助劑易于分散，田間施用更 方便，沒(méi)有殘留和環(huán)境污染。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l:利用酚氯仿法提取煙草花葉病毒的RNA基因組；以煙草花葉病毒的基因組RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄得到煙草花葉病毒運(yùn)動(dòng)蛋白的cDNA;利用PCR 技術(shù)分離煙草花葉病毒運(yùn)動(dòng)蛋白cDNA上150-800bp范圍內(nèi)21-23bp長(zhǎng)的片斷； 將得到的上述片段克隆入可表達(dá)RNA的質(zhì)粒載體；使克隆的片段在缺失RNA 酶的大腸桿菌(￡.co/f)內(nèi)表達(dá)成對(duì)應(yīng)的RNA;粉碎表達(dá)有目的RNA的細(xì)胞， 并將其制成懸浮溶液；該溶液中RNA的含量為2-20 n g/ml，光保護(hù)劑芳香族氨 基酸色氨酸占溶液體積的0.01-0.1%，分散劑1-2%,甘油2-5%，無(wú)菌水 96.99-92.9%。分散劑為L(zhǎng)602或LH656。配制時(shí)，依次在粉碎的細(xì)胞中加入甘油、 芳香族氨基酸色氨酸、分散劑和滅菌水，攪拌均勻得到懸浮劑，然后分裝即可。 試劑要避光保存在棕色試劑瓶里，若長(zhǎng)時(shí)間存放需保存在4攝氏度以下。田間 施用時(shí)，將懸浮液稀釋1000倍后，在早晨9點(diǎn)前或下午5點(diǎn)后噴施于煙草的葉 面上，在煙草上的噴施量為10-100 ng/畝。實(shí)施例2:在本實(shí)施例中，懸浮溶液的成份為RNA的含量為5ng/ml，光 保護(hù)劑芳香族氨基酸色氨酸0.05%， L602分散劑1.5%，甘油3.5%，無(wú)菌水 94.95%。其它與實(shí)施例l相同。實(shí)施例3:在本實(shí)施例中，懸浮溶液的成份為RNA的含量為15ng/ml, 光保護(hù)劑芳香族氨基酸色氨酸0.08%， LH656分散劑1.8%，甘油4%，無(wú)菌水 94.72%。其它與實(shí)施例l相同。實(shí)施例4:在本實(shí)施例中，懸浮溶液的成份為RNA的含量為20ng/ml， 光保護(hù)劑芳香族氨基酸色氨酸0.03%， LH656分散劑1.8%，甘油4.5%，無(wú)菌水 94.95%。其它與實(shí)施例1相同。實(shí)施例5:在本實(shí)施例中，懸浮溶液的成份為RNA的含量為2ng/ml，光 保護(hù)劑芳香族氨基酸色氨酸0.07%, L602分散劑1.2%，甘油2.5%，無(wú)菌水 94.72%。其它與實(shí)施例l相同。實(shí)施例6:在本實(shí)施例中，懸浮溶液的成份為RNA的含量為3ng/ml，光 保護(hù)劑芳香族氨基酸色氨酸0.01%， LH656分散劑1%，甘油2%，無(wú)菌水96.99%。 其它與實(shí)施例l相同。實(shí)施例7:在本實(shí)施例中，懸浮溶液的成份為:RNA的含量為12ng/ml， 光保護(hù)劑芳香族氨基酸色氨酸0.1%， L602分散劑2。/。，甘油5%，無(wú)菌水92.9%。
其它與實(shí)施例l相同。實(shí)施例8:在本實(shí)施例中，懸浮溶液的成份為RNA的含量為18ng/ml， 光保護(hù)劑芳香族氨基酸色氨酸0.02%， L602分散劑1.4%，甘油4%,無(wú)菌水 94.95%。其它與實(shí)施例l相同。實(shí)施例9:在本實(shí)施例中，懸浮溶液的成份為RNA的含量為8ng/ml，光 保護(hù)劑芳香族氨基酸色氨酸0.02%，L602分散劑1.7%，甘油3%，無(wú)菌水94.72%。 其它與實(shí)施例l相同。
權(quán)利要求
1. 一種防治煙草花葉病毒病的方法，其特征在于包括以下步驟提取錄煙草花葉病毒的RNA基因組；利用煙草花葉病毒的RNA基因組，反轉(zhuǎn)錄得到煙草花葉病毒運(yùn)動(dòng)蛋白的cDNA；利用PCR技術(shù)分離煙草花葉病毒運(yùn)動(dòng)蛋白cDNA上150-800bp內(nèi)21-23bp長(zhǎng)的片斷；將上述片段克隆入可表達(dá)RNA的質(zhì)粒載體；使克隆的片段在缺失RNA酶的大腸桿菌內(nèi)表達(dá)成RNA；粉碎細(xì)胞，并將其制成濃度為2-20ng/ml懸浮溶液；將懸浮液稀釋1000倍后噴施于煙草的葉面上。
2、 如權(quán)利要求1所述的防治煙草花葉病毒病的方法，其特征在于在煙草 上的噴施量為10-100 ng/畝。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種防治煙草花葉病毒病的方法，包括以下步驟提取錄煙草花葉病毒的RNA基因組；利用煙草花葉病毒的RNA基因組，反轉(zhuǎn)錄得到煙草花葉病毒運(yùn)動(dòng)蛋白的cDNA；利用PCR技術(shù)分離煙草花葉病毒運(yùn)動(dòng)蛋白cDNA上150-800bp內(nèi)21-23bp長(zhǎng)的片斷；將上述片段克隆入可表達(dá)RNA的質(zhì)粒載體；使克隆的片段在缺失RNA酶的大腸桿菌內(nèi)表達(dá)成RNA；粉碎細(xì)胞，并將其制成濃度為2-20ng/ml懸浮溶液；將懸浮液稀釋1000倍后噴施于煙草的葉面上。本方法生產(chǎn)簡(jiǎn)便、成本低廉、對(duì)人畜和高等動(dòng)物無(wú)害，適于在煙草上大量施用。制成的懸浮劑克服了可濕性粉劑和乳油劑的缺陷，助劑易于分散，田間施用更方便，沒(méi)有殘留和環(huán)境污染。
文檔編號(hào)A01N63/00GK101209055SQ20061016000
公開日2008年7月2日 申請(qǐng)日期2006年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月29日
發(fā)明者張小霞, 戚元成, 梁振普, 邱立友, 高玉千 申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)