專利名稱：能產(chǎn)白藜蘆醇的枝孢霉屬內(nèi)生真菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從爬山虎的內(nèi)生真菌中分離到一個(gè)枝孢霉屬真菌-Cladosporium caulis，該真菌含有編碼區(qū)為1179bp的白藜蘆醇合成途徑中關(guān)鍵的芪合酶基因(sts基因)。本發(fā)明還利用基因工程技術(shù)對該菌進(jìn)行了遺傳改良，使得該菌在氧受限制的條件下的代謝和生長速度比非轉(zhuǎn)基因菌有明顯提高。本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
白藜蘆醇(Resveratrol，Res)屬芪類化合物，化學(xué)名為3，4’，5-三羥基-1，2-二苯乙烯(3，4’，5-trihydrolystilbene)，分子式為C14H12O3，相對分子量為228.25，具有順、反兩種結(jié)構(gòu)，反式結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定。白藜蘆醇常與葡萄糖結(jié)合以苷的形式存在，少量以游離態(tài)的形式廣泛存在于葡萄、虎杖、藜蘆、決明子和花生等天然植物或果實(shí)當(dāng)中，到目前為止至少已在21科、31屬的72種植物中發(fā)現(xiàn)了白藜蘆醇。
白藜蘆醇是植物的次生代謝產(chǎn)物，它與黃酮類化合物、呋喃香豆素等多酚類物質(zhì)一道，都經(jīng)由苯丙氨酸途徑由香豆酸等前體在不同酶的催化作用下轉(zhuǎn)化而來。其中，白藜蘆醇是由芪合酶(Stilbene synthase，STS)催化底物丙二酰-CoA和苯丙酰-CoA合成。另外，研究還發(fā)現(xiàn)，芪合酶(STS)催化的反應(yīng)與查耳酮合成酶(chalcone synthase，CHS)催化的反應(yīng)很相似，都催化香豆酰輔酶A與三個(gè)分子的丙二酰輔酶A的縮合反應(yīng)，只不過前者釋放四個(gè)CO2分子，而后者釋放三個(gè)，從而形成了不同的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，得到不同的產(chǎn)物(白藜蘆醇及柚皮素查耳酮)。而STS與CHS的蛋白質(zhì)相似性也達(dá)到約70％(Goodwin等，2000)。
芪合酶基因的植物很多只有在對不良環(huán)境的保護(hù)性反應(yīng)(如機(jī)械損傷、紫外線照射、環(huán)境脅迫等)時(shí)，才能激發(fā)該基因的轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)譯為芪合酶，進(jìn)而瞬時(shí)合成白藜蘆醇。同時(shí)，白藜蘆醇僅存在于少數(shù)可食食物中(如葡萄屬、落花生屬)，且含量甚低，而且受品種、生長條件等影響很大。另外，絕大多數(shù)植物雖含有芪合酶作用的底物，但缺少芪合酶基因。
目前商業(yè)用白藜蘆醇主要以含量相對較高的葡萄皮、葡萄籽和虎杖為原料，采用甲醇、乙醇、乙酸乙酯等作為提取溶劑，用高效液相色譜、硅膠柱層析等方法分離純化得到高含量的白藜蘆醇，但天然的植物中存在的白藜蘆醇畢竟是微量的，并且提取步驟繁多、提取物成分復(fù)雜，必須經(jīng)過分離純化才能得到成品，因此該技術(shù)面臨著資源有限和生產(chǎn)能力小等問題。而化學(xué)合成過程中的催化劑和反應(yīng)試劑對環(huán)境和人體的危害性則大大限制其應(yīng)用。因此，新辟高效的生產(chǎn)途徑，解決日益增高的消費(fèi)需求問題變得十分迫切。
現(xiàn)在主要的研究集中在生物合成白藜蘆醇研究上利用基因工程技術(shù)，控制、改良白藜蘆醇的生物合成途徑來獲得其高產(chǎn)植物株系、利用誘變途徑選育高產(chǎn)細(xì)胞株等方面。但迄今為止，離規(guī)?；墓I(yè)生產(chǎn)要求還很遠(yuǎn)。
內(nèi)生真菌(endophytic fungi)是指那些在其生活史中的某段時(shí)期或全部階段生活在植物組織內(nèi)，對植物組織沒有明顯引起病害癥狀的一類真菌。近年來，國內(nèi)外從多種藥用植物內(nèi)生真菌中篩選出各種生理活性物質(zhì)陸續(xù)見有報(bào)道，內(nèi)生真菌產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)存在極大的多樣性(如抗腫瘤、抗病毒、抗細(xì)菌、抗真菌、抗蟲等物質(zhì))，表明植物內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、功能特殊的次生代謝產(chǎn)物，是新化合物、新藥物的潛在資源，它們在醫(yī)藥、工業(yè)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。
本發(fā)明從爬山虎(Caulis Parthenocissi Tricuspidatae)的內(nèi)生真菌中克隆得到了白藜蘆醇合成的關(guān)鍵酶基因-芪合酶基因(sts)，該基因與爬山虎中sts基因的核酸序列相似性為95.25％，氨基酸序列相似性為97.45％，經(jīng)rDNA的18S序列比對鑒定，該菌為枝孢霉屬(Cladosporium sp.)。HPLC和質(zhì)譜(ESI-MS)分析表明，該菌在離體培養(yǎng)下也能合成與其宿主植物一樣的次生代謝物——白藜蘆醇。此外，這為通過離體大規(guī)模發(fā)酵來生產(chǎn)白藜蘆醇提供了一條新的途徑，也為通過促進(jìn)內(nèi)生真菌的生長，及真菌與宿主植物的相互作用提高白藜蘆醇含量提供新的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及從爬山虎的內(nèi)生真菌中分離到一個(gè)枝孢霉屬真菌-Cladosporium caulis，該真菌含有編碼區(qū)為1179bp的白藜蘆醇合成途徑中關(guān)鍵的芪合酶基因(sts基因)。高效液相色譜法(HPLC)和質(zhì)譜(ESI-MS)分析表明在離體培養(yǎng)的條件下該真菌也能合成白藜蘆醇。之后我們將LeGDP/VHb基因和LeGDP/ipt基因，以及LeGDP/iaaM基因轉(zhuǎn)化該菌株進(jìn)行基因工程改良，結(jié)果發(fā)現(xiàn)攜帶LeGDP/VHb的真菌比非轉(zhuǎn)基因的對照菌在氧受限的條件下的代謝速度和生長量有明顯增加，而LeGDP/ipt基因和LeGDP/iaaM基因則加快了真菌生長速度。本發(fā)明同時(shí)提供了克隆爬山虎內(nèi)生菌sts基因的相關(guān)資料，發(fā)現(xiàn)它與宿主植物的sts基因有很高同源性。但在真菌和植物中該基因的調(diào)控系統(tǒng)差別頗大。此外，本發(fā)明還提出了利用內(nèi)生真菌提高白藜蘆醇產(chǎn)量的方法，包括真菌發(fā)酵的方法和利用真菌促進(jìn)宿主產(chǎn)生白藜蘆醇的方法。
1、爬山虎內(nèi)生真菌的分離鑒定采集新鮮的爬山虎莖段，按常規(guī)無菌操作進(jìn)行表面消毒后取其韌皮部轉(zhuǎn)接到PDA平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3-7天，挑取組織塊周圍長出的單個(gè)菌落的菌絲接到CYM斜面培養(yǎng)基上純化保存。
2、從爬山虎內(nèi)生真菌中克隆芪合酶(sts)基因利用已知的爬山虎(Caulis Parthenocissi Tricuspidatae)中芪合酶基因的相似性區(qū)域，我們設(shè)計(jì)了包括sts基因起始密碼和終止密碼的的一對引物，分別是STSFP和STSRP。利用Plant genome DNA Reagent試劑提取爬山虎內(nèi)生真菌的DNA，用PCR方法擴(kuò)增得到1228bp左右的特異片斷，連接到pMD-18載體上并進(jìn)行測序，表明該基因的完整編碼區(qū)為1179bp(12bp～1192bp)，編碼392個(gè)氨基酸。將測序結(jié)果與其他的序列進(jìn)行相似性比較，發(fā)現(xiàn)爬山虎內(nèi)生真菌中的sts基因與其宿主中相應(yīng)基因有95.25％的相似性，翻譯成氨基酸序列后進(jìn)行相似性比較，兩者的相似性亦有97.45％。在sts的氨基酸序列中包含芪合酶的特異氨基酸殘基片段IPNSAGAIAGN，以及表明芪合酶家族特性的信號序列GVLFGFGPGLT。另外，爬山虎內(nèi)生真菌的芪合酶編碼區(qū)中也存在第164位的半胱氨酸(Cys164)活性中心。
該sts基因的完整編碼區(qū)為1 ATGGCTTCAG TTGAGGAATT TAGAATCGCT CAACGTGCCA AGGGTCCGGC CACCATCCTA61 GCCATTGGCA CTGCTACTCC AGACAACTGC GTCTACCAGT CTGATTACGC TGATTTCTAT121TTCAGAGTCA CAAAGAGCGA GCACATGACT GAGTTGAAGA AGAAGTTCAA TCGCATATGT181GAGAAATCAA TGATCAAGAA GCGTTATATT CATTTGACTG AAAAGATGCT TGAGGAGCAC241CCAAACATTG GTGCTTATAT GGCTCCATCT CTTAACATAC GCCAAGAGAT TATCACTGCC301GAGGTACCCA AGCTTGGTAA AGAAGCAGCA TTGAAGGCTC TAAAAGAGTG GGGCCAACCC361AAGTCCAAGA TCACCCATCT TGTATTTTGT ACAACCTCCG GTGTAGAAAT GCCTGGTGCA421GATTACAAAC TCGCTAATCT CTTAGGGCTT GAAACATCGG TCAGAAGAGT GATGTTGTAC481CATCAAGGGT GCTATGCAGG TGGAACTGTC CTCCGAACTG CTAAGGATCT TGCAGAGAAT541AATGCAGGAG CACGAGTTCT TGTGGTGTGC TCTGAGATCA CTGTTGTCAC ATTCCGTGGA601CCTTCCGAAA CTGCTTTGGA CTCTTTAGTT GGCCAAGCCC TTTTTGGTGA TGGGTCTGCA661GCTGTGATCG TTGGATCAGA TCCAGATATC TCGATTGAAC AACCACTTTT TCAACTCGTC721TCAGCAGCCC AAACATTTAT TCCTAATTCA GCAGGTGCCA TTGCCGGGAA CTTACGTGAG781GTGGGACTCA CATTTCATTT GTGGCCCAAT GTGCCAACTT TAATTTCTGA GAACATAGAG841AAATGCTTGA CTCAGGCTTT TGACCCACTT GGTATTAGCG ATTGGAACTC GTTATTTTGG
901ATTGCTCACC CAGGTGGCCC TGCAATTCTT GATGCGGTTG AAGCAAAACT CAATTTAGAC961AAAAAGAAAC TTGAAGCAAC GAGCCATGTG TTAAGTGAGT ATGGCAACAT GTCAAGTGCA1021 TGTGTGTTGT TTATTTTGGA TGAGATGAGA AAGAAATCAC TTAAGGGGGA GAAGGCCACC1081 ACAGGTGAAG GATTGGATTG GGGAGTATTA TTTGGCTTTG GACCAGGCTT GACTATTGAG1141 ACTGTTGTGT TGCATAGCAT TCCTATGGTT ACAAATTAA3、內(nèi)生真菌中sts基因5’端調(diào)控序列的克隆應(yīng)用一種基于5’RACE技術(shù)的染色體步行技術(shù)，從爬山虎及其內(nèi)生真菌的基因組DNA中克隆了sts基因的5’端調(diào)控序列。其做法是在已知的sts基因5’端280bp左右設(shè)計(jì)引物GSP1，180bp左右處設(shè)計(jì)引物GSP2；第一步先用GSP1做單引物線性擴(kuò)增，用1/10體積的PCR產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳，檢測無特異條帶后進(jìn)行第二步，即用dCTP給上步的PCR產(chǎn)物加尾；第三步則用GSP2和AAP作引物進(jìn)行巢式PCR，其電泳結(jié)果應(yīng)該是均勻的smear狀，切下大于500bp的膠回收、連接并轉(zhuǎn)化DH5a；第四步是轉(zhuǎn)化子的篩選用GSP2和AAP作引物(同時(shí)用AAP和GSP2分別作單引物對照)篩選，挑取較大的且無單引物擴(kuò)增的樣品進(jìn)行測序。該sts基因的部分5’調(diào)控區(qū)為1 ACCCACGAGG AGCATCGTGG AAAAAGAAGA CGTTCCAACC ACGTCTTCAA AGCAAGTGGA61 TTGATGTGAT ACTCCAAGAA TATCAAAGAT ACAGTCTCAG AAGACCAAAG GGCTATTGAG121ACTTTTCAAC AAAGGGTAAT ATCGGGAAAC CTCCTCGGAT TCCATTGCCC AGCTATCTGT181CACTTCATCA AAAGGACAGT AGGAAAGGAA GGTGGCACCT ACAAATGCCA TCATTGCGAT241AAAGGAAAGG CTATCGTTCA AGATGCCTCT GCCGACAGTG GTCCCAAAGA TGGACCCCCA301CCCACGAGGA GCATCGTGGA AAAAGAAGAC GTTCCAACCA CGTCTTCAAA GCAAGTGGAT361TGATGTGATA TCTCCACTGA CGTAAGGGAT GACGCACAAT CCCACTATCC TTCGCCGACG421GATCCTATTT TTACAACAAT TACCAACAAC AACAAACAAC AAACAACATT ACAATTACTA481TTTACAATAA CAATGGACTG TCTAGAGGAT CCGCC4、爬山虎sts基因內(nèi)含子的克隆根據(jù)爬山虎sts基因序列設(shè)計(jì)克隆內(nèi)含子的引物STS-E(上游)5’-CAC TAA GAG CGA GCA CAT GAC TGAG-3’STS-E(下游)5’-ACG AGT TCC AAT CGC TAA TAC CAAG-3’從爬山虎基因組DNA中，我們克隆到了其sts基因361bp的內(nèi)含子，其序列為1 TCTAATTTTA ACATCCTTTG CGTGCATATA ATTGTGTATA CATATGATAA AGCTTTTAGA61 TTCACCTCAG AGTACCGAAA CATCTTTTTC AAGCTTTCTG TGTACTCATT TTTAAATTAA121TACAATGCAT CCGTGACTGA TGCTCAGAGC AGGTGCTCTT TCAATCATAC GGTATAAAGC181CTGGGGTCAT ATCATTAATG TAATAAGTAA TAAGAACAAG CTTTTATATT CTATTAAGAT241GAATCATTTT ATACTCACTG GAACAACAAA AACTATATAC ATATTATTGA GTACTACTTG301TGTTTTACTT GCAATGCCTT GAGCTCACAT ATTACTGTTT TTTAATTCTT ATACAGGTGA361C
5、內(nèi)生真菌合成白藜蘆醇的測定將上述得到的菌株與爬山虎葉片、對照菌株(不含sts基因的菌株)用液體CYM培養(yǎng)基培養(yǎng)10天，取出壓干，再置低溫烘箱中烘烤(40-55℃)過夜。用研棒將其研成細(xì)碎粉末，無水甲醇(1∶40，w/v)過夜浸提，抽濾后的液體再40℃旋轉(zhuǎn)蒸干，殘留物溶于5mL水及10mL乙酸乙酯中。充分混勻并分層后，有機(jī)相蒸干，重溶于0.5mL丙酮中。定量點(diǎn)樣于活化的硅膠板Silufol(UV 254)，板依次用氯仿∶甲醇(25∶1)展層三次。干燥后，在紫外燈下對照標(biāo)準(zhǔn)樣品Rf值確定白藜蘆醇在板上的位置，刮取含有白藜蘆醇的硅膠，再用甲醇溶解硅膠回收白藜蘆醇。抽濾后提取液于40℃真空蒸干，重懸于乙睛。所有操作過程均在嚴(yán)格避光條件下進(jìn)行，以防止白藜蘆醇的氧化或分解。
HPLC(高效液相色譜)和質(zhì)譜(ESI-MS)的分析結(jié)果表明爬山虎的內(nèi)生真菌能產(chǎn)生和宿主植物一樣的次生代謝物——白藜蘆醇。
6、分離出的內(nèi)生真菌的生物學(xué)分類我們以真菌的18SrDNA序列結(jié)合其形態(tài)特征將其分類。參考Wattier(2000)對紅藻(Rhodophyta)總DNA的提取方法，提取真菌的總DNA，并進(jìn)行rDNA的18S序列鑒定。
該18S rDNA片段的序列為1 TTAGCGAAAC TGCGAATGGC TCATTAAATC AGTTATCGTT TATTTGATAG TACCTTACTA61 CATGGATAAC CGTGGTAATT CTAGAGCTAA TACATGCTAA AAACCCCGAC TTCGGAAGGG121GTGTATTTAT TAGATAAAAA ACCAATGCCC TTCGGGGCTC CTTGGTGAAT CATAATAACT181TAACGAATCG CATGGCCCTG CGCCGGCGAT GGTTCATTCA AATTTCTGCC CTATCAACTT241TCGATGGTAG GATAGTGGCC TACCATGGTA TCAACGGGTA ACGGGGAATT AGGGTTCGAC301TCCGGGGAGG GAGCCTGAGA AACGGCTACC ACATCCAAGG AAGGCAGCAG GCGCGCAAAT361TACCCAATCC CGACACGGGG AGGTAGTGAC AATAAATACT GATACAGGGC TCTTTTGGGT421CTTGTAATTG GAATGAGTAC AATTTAAATC CCTTAACGAG GAACAATTGG AGGGCAAGTC481TGGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATTCCAGCTC CAATAGCGTA TATTAAAGTT GTTGCAGTTA541GAAAGCTCGT AGTTGAACCT TGGGCCTGGC TGGCCGGTCC GCCTCACCGC GTGTACTGGT601CCGGCCGGGC CTTTCCTTCT GGGGAACCTC ATGCCCTTCA CTGGGCGTGC TGGGGAACCA661GGACTTTTAC TTTGAAAAAA TTAGAGTGTT CAAAGCAGGC CTTTGCTCGA ATACATTAGC721ATGGAATAAT AGAATAGGAC GTGTGGTTCT ATTTTGTTGG TCTCTAGGAC CGCCGTAATG781ATTAATAGGG ATAGTCGGGG GCATCAGTAT TCAAGCGTCA GAGGTGAAAT TCTTGGATTG841CTTGAAGACT AACTACTGCG AAAGCATTTG CCAAGGATGA AT鑒定結(jié)果這株能產(chǎn)白藜蘆醇的真菌屬于子囊菌門(Asconycota)、座囊菌綱(Dothideomycetes et.)、球腔菌科(Mycosphaerellaceae)、屬(Cladosporium sp.)。
7、分離出的枝孢霉菌的基因工程改良在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，我們將透明顫菌血紅蛋白基因?qū)攵喾N共生真菌的細(xì)胞中如桉樹的淺黃根須腹菌(Rhizopogen luteolus)。提高了這些真菌在低氧條件下的生長速度。從牛糞中分離到的透明顫菌( Vitreoscilla stercoraria)的血紅蛋白提高了限氧條件下細(xì)胞內(nèi)有效氧濃度，因而改變了終端氧化酶的相對活性，促進(jìn)了細(xì)胞中氧傳遞效率。從而促進(jìn)好氧呼吸的效率和生長。在真菌中應(yīng)用使我們采用的啟動(dòng)子是來自香菇的三磷酸甘油醛脫氫酶LeGDP啟動(dòng)子。構(gòu)建了適于在真菌中表達(dá)的質(zhì)粒。接助于電激法，或PEG法，或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將LeGDP驅(qū)動(dòng)下的VHb基因轉(zhuǎn)入了真菌。這些共生真菌(內(nèi)共生和外共生的真菌)，在非共生的條件下依然可以生長，在人工控制的條件下，更便于研究它們的代謝特點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)攜帶LeGDP/VHb的真菌比非轉(zhuǎn)基因的對照菌在氧受限的條件下明顯增加了代謝速度和生長量。
我們曾經(jīng)利用遺傳改良的根際微生物，來改善植物的生長發(fā)育。這種共生的根際微生物與植物有更為密切的關(guān)系。它對植物的營養(yǎng)狀態(tài)的改良和抗逆性的提高已成為共識。內(nèi)生菌的遺傳改良將有利于建立它與宿主植物之間的關(guān)系。在本發(fā)明的一個(gè)類似的實(shí)施方案中，我們將一種生長激素類的基因，即異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因(isopentanyl transferase，ipt)和生長素合成的關(guān)鍵基因LeGDP/iaaM基因?qū)胝婢Ｋ脝?dòng)子也是LeGDP，結(jié)果表明LeGDP/ipt基因轉(zhuǎn)化的真菌在培養(yǎng)條件下，加快了真菌生長速度。iaaM是植物生長素基因，LeGDP/iaaM同樣可以促進(jìn)內(nèi)生菌的生長?？傊梢栽讷@得內(nèi)生菌的基礎(chǔ)上可以進(jìn)行內(nèi)生菌的遺傳改良。
本發(fā)明的有益效果我們在葡萄科植物爬山虎中分離出了能產(chǎn)生白藜蘆醇的內(nèi)生真菌，該真菌為枝孢霉屬，由于含有白藜蘆醇合成途徑的芪合酶，因此在離體培養(yǎng)條件下該真菌能夠產(chǎn)生白藜蘆醇。本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)在于此前還沒有人發(fā)現(xiàn)葡萄科的內(nèi)生真菌在離體培養(yǎng)條件下能夠產(chǎn)生白藜蘆醇，而白藜蘆醇僅存在于少數(shù)植物中并且含量很低，因而要大規(guī)模生產(chǎn)白藜蘆醇很困難。我們分離的這種內(nèi)生真菌不僅在離體條件下能產(chǎn)生白藜蘆醇，而且我們還從分子生物學(xué)的角度證實(shí)了正是由于該真菌含有的芪合酶基因sts使得它能夠產(chǎn)生白藜蘆醇，通過對這種真菌的大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)能夠?yàn)榘邹继J醇的生產(chǎn)開辟一條新的途徑，而且也為通過這種內(nèi)生真菌的遺傳改良(例如導(dǎo)入在低氧條件下促進(jìn)其生長的VHb基因以及促進(jìn)細(xì)胞分裂和生長的ipt基因和iaaM基因)，從而使得內(nèi)生真菌在與宿主植物的相互作用中促進(jìn)植物產(chǎn)生更多的白藜蘆醇。
四、附圖簡要說明


圖1爬山虎中分離真菌的平板圖紅色圓圈標(biāo)記的為本發(fā)明的目的菌株圖2從內(nèi)生真菌中擴(kuò)增的sts基因的電泳中我們的目的條帶擴(kuò)增條帶大小為760bb，電泳帶從左到右編號依次為M，1，2，3，4，5，6，7，8，+，-。M表示分子標(biāo)記Marker，+為正對照，-為負(fù)對照，1-8為不同的爬山虎內(nèi)生真菌的基因組DNA。箭頭標(biāo)記的為本發(fā)明的目的菌中擴(kuò)增出的條帶。
圖3內(nèi)生真菌中白藜蘆醇的HPLC測定圖HPLC的條件如下HPLCAgela Bonchrom-C18，4.6*150mm，5ummobilephaseACN∶H2O(5mmol ammonium formate)＝35∶65flow rate0.6mL/minDetection wavelength＝306nm圖4內(nèi)生真菌中白藜蘆醇的質(zhì)譜(ESI-MS)圖ESI-MS條件如下HPLCAgela Bonchrom-C18，4.6*150mm，5ummobilephaseACN∶H2O(5mmol ammonium formate)＝35∶65flow rate0.6mL/minDetection wavelength＝306nmMSnegative modenebulizer50psidry gas8L/mindry temperature325duscan range150-250skimmer-40v，Cap Exit-92.7vhigh voltage4000v其中(1)圖為白藜蘆醇成品(純度99.99％，購自sigma公司，分子量為228.3)，(2)圖為樣品分子量，(3)圖中箭頭標(biāo)記的為樣品峰圖5是表示真菌表達(dá)載體LeGDP/VHb的構(gòu)建流程的示6是表示真菌表達(dá)載體LeGDP/ipt的構(gòu)建流程的示7是表示真菌表達(dá)載體LeGDP/iaaM的構(gòu)建流程的示8轉(zhuǎn)基因和未轉(zhuǎn)基因菌株生長對比圖LeGPD/ipt基因轉(zhuǎn)化的真菌比未轉(zhuǎn)化的對照組相比在相同時(shí)間和同樣條件下有更大的生長量。
其中CK為未轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨?-5為轉(zhuǎn)基因株系圖9接種于50mlCYM液體培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)基因和未轉(zhuǎn)基因菌株生長量對比圖攜帶LeGPD/iaaM基因的真菌加快了生長速度。左圖為未轉(zhuǎn)基因的對照；中、右分別為轉(zhuǎn)基因的兩個(gè)株系，它們的生長明顯加快
圖10是轉(zhuǎn)LeGPD/VHb基因的真菌在限氧條件下的生長情況中1為未轉(zhuǎn)基因的對照；2-4為轉(zhuǎn)LeGPD/VHb基因的菌株。
五具體實(shí)施例方式所有實(shí)施例中的細(xì)菌培養(yǎng)和DNA操作均參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)室操作指南》(金冬雁等譯，科學(xué)出版社，北京(1993))和《精編分子生物學(xué)指南》(顏?zhàn)臃f等譯，科學(xué)出版社，北京(1998))。分子操作中的工具酶如限制性內(nèi)切酶均購自TaKaLa公司，Promega公司。
實(shí)施例1爬山虎中內(nèi)生真菌的分離將剛采集的爬山虎莖段，用自來水沖洗干凈，瀝干水分，剪成2cm左右的小段，然后按常規(guī)無菌操作進(jìn)行如下表面消毒75％酒精浸泡1分鐘，0.1％升汞浸泡30分鐘，取其韌皮部，接于PDA平板上培養(yǎng)，將接種后4-7天長出的真菌用接種針挑取菌絲轉(zhuǎn)接到CYM斜面培養(yǎng)基上純化，存于4℃?zhèn)溆谩?br> 將分離到的內(nèi)生真菌進(jìn)一步用設(shè)計(jì)好的芪合酶引物(見實(shí)施例2)確定是否含有芪合酶基因。
實(shí)施例2爬山虎內(nèi)生真菌中芪合酶(sts)基因的克隆參考爬山虎中芪合酶基因(sta)設(shè)計(jì)如下引物(由上海生物工程公司合成)STS1(上游引物)5’＞CGG GAT CCG CCA TGG CTT CAG TTG AGAAAT TTA G＜3’，含BamHI位點(diǎn)STS2(下游引物)5’＞GTG AGC TCG AAG GGTAAA CCA TTC TCT TTT AT＜3’，含SacI位點(diǎn)以內(nèi)生真菌的基因組為模板，在50μl的PCR反應(yīng)體系中加入DNA模板2μl，10×PCR buffer(MgCl2)5ul，2.5mM dNTP mix 4ul，引物(10μM)各2.5ul，Taq DNA聚合酶(5U/ul)0.5ul，ddH2O 34ul。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，56℃退火45s，72℃延伸90s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，10℃保溫1min。將PCR產(chǎn)物跑瓊脂糖回收膠，結(jié)果目的條帶與正對照一致，將目的條帶回收，與pMD-18載體連接并測序。
真菌基因組DNA的小量制備提取緩沖液含68mlTEN緩沖液(0.5M NaCl，50mM EDTA，0.1M Tris-HCl，PH 8.0；室溫存放)、6.8ml 20％SDS和125ul蛋白酶K母液(20mg/ml，溶于雙蒸水，-20℃保存)；隨用隨配。
(1)將真菌菌絲接種于CYM液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)5天，取0.1g(濕重)菌絲置于1.5ml的Effendorf管中，液氮冷凍數(shù)秒，用與Effendorf管配套的玻璃研棒將菌絲充分研碎，置冰上，待所有樣品都研磨完后各加入1ml提取緩沖液，劇烈混勻；(2)37℃搖床(200rpm)中溫浴30min；(3)4℃，12,000rpm離心15min，轉(zhuǎn)移上清，冰浴30min；(4)4℃，12,000rpm離心15min，轉(zhuǎn)移上清，用CI抽提蛋白1-2次；(5)加入600ul于-20℃預(yù)冷的異丙醇，4℃，12,000rpm離心15min，棄上清；(6)沉淀用70％乙醇洗滌，置室溫中晾干；(7)每管加入20-40ul雙蒸水溶解。
細(xì)菌質(zhì)粒DNA的制備(1)挑取單菌落接種于含適當(dāng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜；(2)取1.5ml菌液于離心管中，10,000rpm離心30秒；(3)菌體沉淀重懸于100ul溶液I(50mM蔗糖，20mM Tris.Cl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0))中，振蕩混勻并靜置數(shù)分鐘；(4)加入新鮮配置的200ul溶液II(0.2N NaCl，1％SDS)，輕彈混勻，冰上放置3分鐘；(5)加入預(yù)冷的150ul溶液III(60ml 5M KAc，11.5ml冰乙酸，28.5ml無菌水)，輕彈混勻，冰上放置5分鐘；(6)12,000rpm離心5分鐘；(7)取上清液，加入1倍體積的異丙醇，混勻后在冰上放置10分鐘；(8)12,000rpm離心5分鐘，棄去上清后稍微晾干，使之溶于200ul無菌水；(9)加入100ul7.5M醋酸銨，輕輕混勻后在冰上放置10分鐘；于12,000rpm離心5分鐘；(10)取上清液，加入兩倍體積無水乙醇后，于冰上或-20℃放置20分鐘，12,000rpm離心15分鐘；(11)沉淀用70％乙醇清洗，抽干后溶于TE緩沖溶液(10mM Tris.Cl(pH8.0)，1mMEDTA(pH8.0))中。
DNA片段的回收(TIANGEN公司凝膠回收試劑盒)(1)從瓊脂糖凝膠上切下所需DNA片段(體積不要超過100ul)置于小離心管；(2)加入3倍體積的溶膠液PN，50℃水浴10分鐘，其間輕搖小離心管數(shù)次使膠完全溶化；(3)將上一步所得到的溶液加入到吸附柱CA1或CA2中，12000rpm離心1min；；(4)倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中；
(5)向吸附柱中加700ul漂洗液PW，12000rpm離心1min；(6)倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中；(7)向吸附柱中加500ul漂洗液PW，12000rpm離心1min；(8)倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中，12000rpm離心2min，盡量出去漂洗液；(9)將吸附柱放于室溫或50℃溫箱數(shù)分鐘，徹底晾干，以防止殘留的漂洗液影響下一步實(shí)驗(yàn)；(10)將吸附柱放入一個(gè)干凈離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加30ul洗脫緩沖液EB，室溫放置2分鐘；(11)12000rpm離心1min，將離心得到的溶液重新加回到吸附柱中，重復(fù)10步驟。
連接6ul反應(yīng)體系中加入上述回收的DNA溶液2.4ul、pMD-18載體0.6ul、Solution I 3ul，16℃放置4小時(shí)左右。
大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(1)挑取E.coli DH5α單菌落接種于100ml液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600約0.4；(2)冰浴10分鐘，分裝于無菌離心管中，4℃，4,000rpm離心5分鐘收集細(xì)胞；(3)重懸于600ul冰預(yù)冷的0.1M CaCl2中，冰浴30分鐘；(4)4℃，4,000g離心10分鐘收集細(xì)胞。用100ul預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸細(xì)胞，待用。
感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(1)取100ul感受態(tài)細(xì)胞加5ul連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰置30分鐘；(2)于42℃水中熱激90秒，迅速置于冰上冷卻1-2分鐘；(3)加200ul LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)45分鐘至1小時(shí)；(4)均勻涂布于含氨芐青霉素的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。
重組質(zhì)粒的篩選與鑒定a.挑取單菌落，用800ul附加氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)4-6小時(shí)；b.PCR檢測挑取單菌落于含適當(dāng)抗生素的3ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜提取質(zhì)粒DNA。以質(zhì)粒DNA為模板，用特定引物在適當(dāng)條件下做PCR擴(kuò)增反應(yīng)，電泳檢測是否有目的條帶；c.酶切鑒定陽性克隆再用適當(dāng)限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切以進(jìn)一步判斷是否為陽性克隆。
實(shí)施例3真菌的18S鑒定根據(jù)真核生物rDNA的18S保守序列設(shè)計(jì)如下引物18S上游5’-AGCGAAACTG CGAATGGC-3’；18S下游5’-CATCCTTGGC AAATGCTTTC-3’；在50μl的PCR反應(yīng)體系中加入DNA模板2μl，10×PCRbuffer(MgCl2)5ul，2.5mMdNTP mix 4ul，引物(10uM)各2.5ul，Taq DNA聚合酶(5U/ul)0.5ul，ddH2O 34ul。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，10℃保溫1min。將PCR產(chǎn)物跑瓊脂糖回收膠，將目的條帶切下回收，與pMD-18載體連接并測序。
將測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對，并確定該內(nèi)生真菌為子囊菌門(Ascomycota)、座囊菌綱(Dothideomycetes et.)、球腔菌科(Mycosphaerellaceae)、枝孢霉屬(Cladodporium sp.)。
實(shí)施例4爬山虎及其內(nèi)生真菌sts基因5’端調(diào)控序列的克隆本實(shí)驗(yàn)涉及的引物GSP15’-CTTGGCGTATGTTAAGAGATGGAGC-3’GSP25’-CGCTTCTTGATCATTGATTTCTC-3’AAP5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3’AUAP5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’基于5’RACE技術(shù)的染色體步行(1)單引物PCR線性擴(kuò)增用TIANGEN公司的植物基因組提取試劑盒提取爬山虎基因組DNA，以它及其內(nèi)生真菌DNA為模板，用GSP1引物進(jìn)行單引物PCR擴(kuò)增。40μl的PCR反應(yīng)混合液中含有4.0μl 10×PCR buffer，5.0μl 2.5mM dNTPmixture，4.0μg DNA模板，2.0μl 10mM GSP1，25.0μl ddH2O。PCR條件如下94℃預(yù)變性7min后加2.5U的EX TaqE(TaKaRa)；然后按以下條件進(jìn)行25個(gè)循環(huán)94℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸80s。循環(huán)結(jié)束后不再進(jìn)行附加的72℃延伸而直接終止反應(yīng)。取5μlPCR產(chǎn)物走1％瓊脂糖凝膠電泳，確證無非特異的擴(kuò)增條帶后，把余下的PCR產(chǎn)物按照基本實(shí)驗(yàn)方法過柱回收。
(2)單鏈DNA的加尾在0.5ml離心管中加入以下成分5.0μ1 5×tailing buffer；2.5μl2mM dCTP；16.5μl ssDNA sample；24.0μl ddH2O。然后進(jìn)行以下操作94℃3min，置于冰上1min，離心；加入1μl TdT，混勻，37℃10分鐘；65℃加熱10min，離心，冰浴保存。
(3)巢式PCR擴(kuò)增、克隆及測序在冰上，向0.2ml離心管中加入以下成分5μl10×PCR buffer；5.0μl 2.5mM dNTP；2.0μl 10μM GSP2；2.0μl 10μM AAP；5.0μldC-tailed ssDNA；31.0μl ddH2O；PCR條件如下94℃預(yù)變性5min后加2.5U的EXTaqE(TaKaRa)；然后按以下條件進(jìn)行35個(gè)循環(huán)94℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸90s；循環(huán)結(jié)束72℃10min終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物走1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，把500bp-2,000bp區(qū)間的smear膠切下，用TIANGEN公司的凝膠回收試劑盒回收?；厥盏腜CR產(chǎn)物與pMD-18載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α；選取3～4個(gè)含有較長插入片段的陽性克隆進(jìn)行測序。
實(shí)施例5爬山虎內(nèi)生真菌產(chǎn)白藜蘆醇的HPLC檢測(1)將上述得到的菌株與爬山虎葉片、對照菌株(不含sts基因的菌株)用液體CYM培養(yǎng)基培養(yǎng)10天，取出壓干，再置低溫烘箱中烘烤(40-55℃)過夜；(2)用研棒將其研成細(xì)碎粉末，無水甲醇(1∶40，w/v)過夜浸提，抽濾后的液體再40℃旋轉(zhuǎn)蒸干，殘留物溶于5mL水及10mL乙酸乙酯中；(3)充分混勻并分層后，有機(jī)相蒸干，重溶于0.5mL丙酮中；(4)定量點(diǎn)樣于活化的硅膠板Silufol(UV 254)，板依次用氯仿∶甲醇(25∶1)展層三次；(5)干燥后，在紫外燈下對照標(biāo)準(zhǔn)樣品Rf值確定白藜蘆醇在板上的位置，刮取含有白藜蘆醇的硅膠，再用甲醇溶解硅膠回收白藜蘆醇；(6)抽濾后提取液于40℃真空蒸干，重懸于乙睛。
*所有操作過程均在嚴(yán)格避光條件下進(jìn)行，以防止白藜蘆醇的氧化或分解。
(7)HPLC分析適當(dāng)稀釋的薄層層析后的提取液用于上樣，在HPCHEM高效液相色譜儀上用Nucleosil C18色譜柱(4.6mm×150mm，5μ)，以乙睛-水溶液(35∶65)為流動(dòng)相，流速0.6mL/min，在306nm波長下進(jìn)行檢測。
HPLC分析結(jié)果表明在306nm波長處，樣品在7min左右處出現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)樣品一樣的波峰。
實(shí)施例6爬山虎內(nèi)生真菌產(chǎn)白藜蘆醇的電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)分析ESI-MS條件為HPLCAgela Bonchrom-C18，4.6*150mm，5um；MobilephaseCAN∶H2O(5mmol ammonium formate)＝35∶65，flow rate0.6mL/min，Detection wavelength＝306nm。
MSnegative mode，nebulizer50psi，dry gas8L/min，dry temperature325du，scan range150-250，skimmer-40v，Cap Exit-92.7v，high voltage4000v。
結(jié)果如附圖4，在7.9min時(shí)，樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品出現(xiàn)同樣的波峰，且樣品的分子量為226.3，因此，我們可以認(rèn)為此物質(zhì)為我們所需要確定的即白藜蘆醇。
實(shí)施例7真菌表達(dá)載體LeGDP/VHb的構(gòu)建用BamH I+Sac I切下pT-PV上約0.5kb大小的vhb片段代替P1221載體的GUS位置，得到重組質(zhì)粒pLvhb；再從p301-bG1質(zhì)粒中用Spe I切下約5.5kb大小的Tnos-GUS-pLeGPD-bar-P1L-LB片段，將此片段插入到pLvhb的Not I位點(diǎn)間，從而得到LeGDP/VHb表達(dá)載體。
其中，pT-PV和p301-bG1載體由北京大學(xué)蛋白質(zhì)基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存，所涉及的酶是購自promega公司。
實(shí)施例8真菌表達(dá)載體LeGDP/ipt的構(gòu)建在pBI321b的Nco I及SacI位點(diǎn)之間再引入從pT-ipt上切下的0.7kb的ipt片段，得到約8.5kb的中間載體pBI321b-ipt。最后用Hind III+Nco I從載體pL321b中把1.3kb的PLeGPD片段切下來代替pBI321b-ipt載體中Hind III和Nco I間的P35S-35S片段，得到pL321b-ipt即LeGDP/ipt表達(dá)載體。
其中，pBI321b和pT-ipt載體由北京大學(xué)蛋白質(zhì)基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存，所涉及的酶是購自promega公司。
實(shí)施例9真菌表達(dá)載體LeGDP/iaaM的構(gòu)建將pL321b-ipt載體上的ipt片段用從PGEMRT-iaam載體上用Not I和Hind III切下0.6kb的iaam片段代替，即可得到pL321b-ipt載體。
其中，PGEMRT-iaam載體和pL321b-ipt載體是有由北京大學(xué)蛋白質(zhì)基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存，所涉及的酶是購自promega公司。
實(shí)施例10爬山虎內(nèi)生真菌的基因工程改良真菌的培養(yǎng)將真菌接種于CYM固體培養(yǎng)基，26℃培養(yǎng)5天；將活化好的菌種接種于裝有玻璃珠及100mL液體CYM培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，26℃靜止培養(yǎng)4～5d天，每天搖瓶1～2次以打散菌絲。
待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的大量制備與純化(1)將待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的菌種接種于帶氨芐抗性的100mL液體LB培養(yǎng)基中，37℃搖床中培養(yǎng)至對數(shù)生長期；(2)菌體離心收集于50mL離心管中，加8mL溶液I將菌體完全懸起，振蕩混勻；(3)加入新配制的溶液II 8mL，充分混勻，室溫放置至溶液較清；(4)加入8mL溶液III，混勻，室溫放置10min，12000rpm離心5min；(5)上清中加入16mL異丙醇，混勻，12000rpm離心5min，DNA沉淀用1.2mL雙蒸水溶解后平均分裝于2個(gè)Effendorf管中進(jìn)行純化；(6)每個(gè)Eppendorf管中分別加入300μl 7.5MNH4Ac，混勻，-20℃放置10-20min；12000rpm離心5min，取上清，等體積CI抽提后加入600μl異丙醇，12000rpm離心5min；(7)兩管沉淀合在一起，用250μl雙蒸水溶解，加入250μl 5MLiCl(預(yù)冷)，-20℃放置10min，12000rpm離心5min；(8)取上清，加入1mL預(yù)冷乙醇，混勻，12000rpm離心5min；(9)沉淀用300μl雙蒸水溶解后加入300μl PEG溶液(13％PEG8000，1.6M NaCl)，混勻，12000rpm離心10min；(10)沉淀用300μl雙蒸水溶解后加入150μl 7.5M NH4AC，-20℃放置10min，12000rpm離心10min；(11)取上清，加入1mL無水乙醇，12000rpm離心5min，沉淀用70％乙醇洗滌后真空抽干，加入50μl無菌雙蒸水溶解；
(12)用瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒的含量，將質(zhì)粒濃度調(diào)整至1μg/μl(注意無菌操作)，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 真菌原生質(zhì)體的制備(無菌操作)(1)將100mL菌絲培養(yǎng)物用4層紗布過濾，用無菌水沖洗2-3遍，再用吸水紙吸干菌絲；(2)將菌絲轉(zhuǎn)移至15-mL塑料螺口離心管中，加入1mL溶壁酶酶解液(1.5％溶壁酶，0.6M甘露醇，0.1M Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，pH5.6；液氮凍融滅菌后分裝于Eppendorf管中，-20℃保存)，充分混勻后置30℃水浴中酶解，每隔15min將離心管顛倒幾次以促進(jìn)原生質(zhì)體的釋放；(3)在顯微鏡下觀察有大量原生質(zhì)體釋放時(shí)結(jié)束酶解反應(yīng)，加入2mL0.6M甘露醇，混勻倒入裝有0.5cm脫脂棉柱的10mL注射器內(nèi)過濾，濾液收集于1.5mL Eppendorf管中；(4)4000rpm離心5min，棄上清，用1mL 0.6M甘露醇離心洗滌2次，將純化的原生質(zhì)體懸浮于100μl 0.6M甘露醇中。
真菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化和再生(1)將1mL電擊緩沖液(0.6M甘露醇，10mM Na2HPO4-NaH2PO4，pH 7.0)加入純化的原生質(zhì)體(107-108)中，4000rpm離心5min，棄上清；(2)將原生質(zhì)體重懸于200μl電擊緩沖液中，加入10μg待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA，混勻后轉(zhuǎn)入電擊杯，冰浴10min；(3)在電壓1000v、電容25μF、電阻400Ω的條件下施加一次電脈沖，冰浴10min；(4)加入5mL CYM選擇性再生培養(yǎng)基(含0.6M甘露醇，20μg/mL除草劑，1％低熔點(diǎn)瓊脂糖；熔化后保持37～40℃)，混勻，倒入用30mL CYM選擇性再生培養(yǎng)基(含1％瓊脂糖)鋪好的平板上，待上層培養(yǎng)基完全凝固后，將平板用封口膜封好置26℃培養(yǎng)；(5)平板于26℃培養(yǎng)5-7天后，即可見到轉(zhuǎn)化子菌落的再生。
轉(zhuǎn)基因真菌的鑒定(1)真菌的基因組DNA提取參考實(shí)施例2中真菌基因組DNA的小量制備。
(2)轉(zhuǎn)基因真菌的PCR鑒定以真菌的基因組DNA為模板，用PCR擴(kuò)增VHb、ipt和iaaM的方法篩選陽性植株。
(3)轉(zhuǎn)基因真菌的southren檢測是用地高辛標(biāo)記，具體方法請參考分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版487-509頁。
(4)轉(zhuǎn)基因真菌的northern檢測是用地高辛標(biāo)記，具體方法請參考分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版532-552頁。
表1真菌PDA培養(yǎng)基配方

*馬鈴薯提取液稱取馬鈴薯200克，洗凈、去皮、破碎，加入1000ml水，煮沸半小時(shí)，用紗布濾去渣滓即可。
表2真菌CYM固體培養(yǎng)基配方

表3真菌CYM液體培養(yǎng)基配方

六、序列表<110>林忠平<120>能產(chǎn)白藜蘆醇的枝孢霉屬(Cladosporium sp.)內(nèi)生真菌<151>2006-10-24<160>1<210>1<211>1179<212>DNA<213>爬山虎枝孢霉(Cladosporium csulis)<220>
<221>CDS<222>(1)...(1179)<400>1ATGGCTTCAG TTGAGGAATT TAGAATCGCT CAACGTGCCA AGGGTCCGGC CACCATCCTA60GCCATTGGCA CTGCTACTCC AGACAACTGC GTCTACCAGT CTGATTACGC TGATTTCTAT120TTCAGAGTCA CAAAGAGCGA GCACATGACT GAGTTGAAGA AGAAGTTCAA TCGCATATGT180GAGAAATCAA TGATCAAGAA GCGTTATATT CATTTGACTG AAAAGATGCT TGAGGAGCAC240CCAAACATTG GTGCTTATAT GGCTCCATCT CTTAACATAC GCCAAGAGAT TATCACTGCC300GAGGTACCCA AGCTTGGTAA AGAAGCAGCA TTGAAGGCTC TAAAAGAGTG GGGCCAACCC360AAGTCCAAGA TCACCCATCT TGTATTTTGT ACAACCTCCG GTGTAGAAAT GCCTGGTGCA420GATTACAAAC TCGCTAATCT CTTAGGGCTT GAAACATCGG TCAGAAGAGT GATGTTGTAC480CATCAAGGGT GCTATGCAGG TGGAACTGTC CTCCGAACTG CTAAGGATCT TGCAGAGAAT540AATGCAGGAG CACGAGTTCT TGTGGTGTGC TCTGAGATCA CTGTTGTCAC ATTCCGTGGA600CCTTCCGAAA CTGCTTTGGA CTCTTTAGTT GGCCAAGCCC TTTTTGGTGA TGGGTCTGCA660GCTGTGATCG TTGGATCAGA TCCAGATATC TCGATTGAAC AACCACTTTT TCAACTCGTC720TCAGCAGCCC AAACATTTAT TCCTAATTCA GCAGGTGCCA TTGCCGGGAA CTTACGTGAG780GTGGGACTCA CATTTCATTT GTGGCCCAAT GTGCCAACTT TAATTTCTGA GAACATAGAG840AAATGCTTGA CTCAGGCTTT TGACCCACTT GGTATTAGCG ATTGGAACTC GTTATTTTGG900ATTGCTCACC CAGGTGGCCC TGCAATTCTT GATGCGGTTG AAGCAAAACT CAATTTAGAC960AAAAAGAAAC TTGAAGCAAC GAGCCATGTG TTAAGTGAGT ATGGCAACAT GTCAAGTGCA1020TGTGTGTTGT TTATTTTGGA TGAGATGAGA AAGAAATCAC TTAAGGGGGA GAAGGCCACC1080ACAGGTGAAG GATTGGATTG GGGAGTATTA TTTGGCTTTG GACCAGGCTT GACTATTGAG1140ACTGTTGTGT TGCATAGCAT TCCTATGGTT ACAAATTAA 1179<110>林忠平<120>能產(chǎn)白藜蘆醇的枝孢霉屬(Cladosporium sp.)內(nèi)生真菌<151>2006-10-24<160>1<210>1<211>882<212>DNA<213>爬山虎枝孢霉(Cladosporium caulis)<220>
<221>CDS
<222>(1)...(882)<400>1TTAGCGAAAC TGCGAATGGC TCATTAAATC AGTTATCGTT TATTTGATAG TACCTTACTA60CATGGATAAC CGTGGTAATT CTAGAGCTAA TACATGCTAA AAACCCCGAC TTCGGAAGGG120GTGTATTTAT TAGATAAAAA ACCAATGCCC TTCGGGGCTC CTTGGTGAAT CATAATAACT180TAACGAATCG CATGGCCCTG CGCCGGCGAT GGTTCATTCA AATTTCTGCC CTATCAACTT240TCGATGGTAG GATAGTGGCC TACCATGGTA TCAACGGGTA ACGGGGAATT AGGGTTCGAC300TCCGGGGAGG GAGCCTGAGA AACGGCTACC ACATCCAAGG AAGGCAGCAG GCGCGCAAAT360TACCCAATCC CGACACGGGG AGGTAGTGAC AATAAATACT GATACAGGGC TCTTTTGGGT420CTTGTAATTG GAATGAGTAC AATTTAAATC CCTTAACGAG GAACAATTGG AGGGCAAGTC480TGGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATTCCAGCTC CAATAGCGTA TATTAAAGTT GTTGCAGTTA540GAAAGCTCGT AGTTGAACCT TGGGCCTGGC TGGCCGGTCC GCCTCACCGC GTGTACTGGT600CCGGCCGGGC CTTTCCTTCT GGGGAACCTC ATGCCCTTCA CTGGGCGTGC TGGGGAACCA660GGACTTTTAC TTTGAAAAAA TTAGAGTGTT CAAAGCAGGC CTTTGCTCGA ATACATTAGC720ATGGAATAAT AGAATAGGAC GTGTGGTTCT ATTTTGTTGG TCTCTAGGAC CGCCGTAATG780ATTAATAGGG ATAGTCGGGG GCATCAGTAT TCAAGCGTCA GAGGTGAAAT TCTTGGATTG840CTTGAAGACT AACTACTGCG AAAGCATTTG CCAAGGATGA AT 882<110>林忠平<120>能產(chǎn)白藜蘆醇的枝孢霉屬(Cladosporium sp.)內(nèi)生真菌<151>2006-10-24<160>1<210>1<211>515<212>DNA<213>爬山虎枝孢霉(Cladosporium caulis)<220>
<221>promoter<222>(1)...(515)<400>1ACCCACGAGG AGCATCGTGG AAAAAGAAGA CGTTCCAACC ACGTCTTCAA AGCAAGTGGA60TTGATGTGAT ACTCCAAGAA TATCAAAGAT ACAGTCTCAG AAGACCAAAG GGCTATTGAG120ACTTTTCAAC AAAGGGTAAT ATCGGGAAAC CTCCTCGGAT TCCATTGCCC AGCTATCTGT180CACTTCATCA AAAGGACAGT AGGAAAGGAA GGTGGCACCT ACAAATGCCA TCATTGCGAT240AAAGGAAAGG CTATCGTTCA AGATGCCTCT GCCGACAGTG GTCCCAAAGA TGGACCCCCA300CCCACGAGGA GCATCGTGGA AAAAGAAGAC GTTCCAACCA CGTCTTCAAA GCAAGTGGAT360TGATGTGATA TCTCCACTGA CGTAAGGGAT GACGCACAAT CCCACTATCC TTCGCCGACG420GATCCTATTT TTACAACAAT TACCAACAAC AACAAACAAC AAACAACATT ACAATTACTA480TTTACAATAA CAATGGACTG TCTAGAGGAT CCGCC 515<110>林忠平<120>能產(chǎn)白藜蘆醇的枝孢霉屬(Cladosporium sp.)內(nèi)生真菌<151>2006-10-24
<160>1<210>1<211>361<212>DNA<213>爬山虎枝孢霉(Cladosporium caulis)<220>
<221>intron<222>(1)...(361)<400>1TCTAATTTTA ACATCCTTTG CGTGCATATA ATTGTGTATA CATATGATAA AGCTTTTAGA60TTCACCTCAG AGTACCGAAA CATCTTTTTC AAGCTTTCTG TGTACTCATT TTTAAATTAA120TACAATGCAT CCGTGACTGA TGCTCAGAGC AGGTGCTCTT TCAATCATAC GGTATAAAGC180CTGGGGTCAT ATCATTAATG TAATAAGTAA TAAGAACAAG CTTTTATATT CTATTAAGAT240GAATCATTTT ATACTCACTG GAACAACAAA AACTATATAC ATATTATTGA GTACTACTTG300TGTTTTACTT GCAATGCCTT GAGCTCACAT ATTACTGTTT TTTAATTCTT ATACAGGTGA360C361七、專利菌種說明此專利涉及的菌種已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，單位地址中國北京中關(guān)村，該真菌分類名稱為枝孢霉菌(Cladosporium sp.)，保藏代號為PSHEn，保藏編號為CGMCC No.1835，保藏日期為2006年10月12日。
總之，我們在葡萄科植物爬山虎中分離出了能產(chǎn)生白藜蘆醇的內(nèi)生真菌，該真菌為枝孢霉屬，由于含有白藜蘆醇合成途徑的芪合酶，因此在離體培養(yǎng)條件下該真菌能夠產(chǎn)生白藜蘆醇。我們利用高效液相色譜(HPLC)和質(zhì)譜(ESI-MS)分析技術(shù)檢測了其產(chǎn)白藜蘆醇的含量，通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了離體培養(yǎng)的該內(nèi)生真菌也能產(chǎn)生產(chǎn)白藜蘆醇，并將LeGDP/VHb基因和LeGDP/ipt基因，以及LeGDP/iaaM基因轉(zhuǎn)化該菌株進(jìn)行基因工程改良，結(jié)果在氧受限的條件下明顯提高了真菌的代謝速度和生長量。這為通過發(fā)酵培養(yǎng)此真菌來大規(guī)模生產(chǎn)白藜蘆醇開辟了一條新的途徑，也為通過改進(jìn)內(nèi)生真菌與宿主植物的相互作用來提高白藜蘆醇產(chǎn)量提供新的方法。
權(quán)利要求
1.從爬山虎中分離出的一株能產(chǎn)生白藜蘆醇的內(nèi)生真菌，為枝孢霉屬真菌，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記入冊編號CGMCC No.1835。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的真菌，其特征是18S rDNA片段882bp，序列為1 TTAGCGAAAC TGCGAATGGC TCATTAAATC AGTTATCGTT TATTTGATAG TACCTTACTA61 CATGGATAAC CGTGGTAATT CTAGAGCTAA TACATGCTAA AAACCCCGAC TTCGGAAGGG121 GTGTATTTAT TAGATAAAAA ACCAATGCCC TTCGGGGCTC CTTGGTGAAT CATAATAACT181 TAACGAATCG CATGGCCCTG CGCCGGCGAT GGTTCATTCA AATTTCTGCC CTATCAACTT241 TCGATGGTAG GATAGTGGCC TACCATGGTA TCAACGGGTA ACGGGGAATT AGGGTTCGAC301 TCCGGGGAGG GAGCCTGAGA AACGGCTACC ACATCCAAGG AAGGCAGCAG GCGCGCAAAT361 TACCCAATCC CGACACGGGG AGGTAGTGAC AATAAATACT GATACAGGGC TCTTTTGGGT421 CTTGTAATTG GAATGAGTAC AATTTAAATC CCTTAACGAG GAACAATTGG AGGGCAAGTC481 TGGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATTCCAGCTC CAATAGCGTA TATTAAAGTT GTTGCAGTTA541 GAAAGCTCGT AGTTGAACCT TGGGCCTGGC TGGCCGGTCC GCCTCACCGC GTGTACTGGT601 CCGGCCGGGC CTTTCCTTCT GGGGAACCTC ATGCCCTTCA CTGGGCGTGC TGGGGAACCA661 GGACTTTTAC TTTGAAAAAA TTAGAGTGTT CAAAGCAGGC CTTTGCTCGA ATACATTAGC721 ATGGAATAAT AGAATAGGAC GTGTGGTTCT ATTTTGTTGG TCTCTAGGAC CGCCGTAATG781 ATTAATAGGG ATAGTCGGGG GCATCAGTAT TCAAGCGTCA GAGGTGAAAT TCTTGGATTG841 CTTGAAGACT AACTACTGCG AAAGCATTTG CCAAGGATGA AT
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的真菌，其特征是該真菌含有能產(chǎn)生白藜蘆醇的芪合酶基因(sts)。sts基因完整編碼區(qū)為1179bp，序列為1 ATGGCTTCAG TTGAGGAATT TAGAATCGCT CAACGTGCCA AGGGTCCGGC CACCATCCTA61 GCCATTGGCA CTGCTACTCC AGACAACTGC GTCTACCAGT CTGATTACGC TGATTTCTAT121 TTCAGAGTCA CAAAGAGCGA GCACATGACT GAGTTGAAGA AGAAGTTCAA TCGCATATGT181 GAGAAATCAA TGATCAAGAA GCGTTATATT CATTTGACTG AAAAGATGCT TGAGGAGCAC241 CCAAACATTG GTGCTTATAT GGCTCCATCT CTTAACATAC GCCAAGAGAT TATCACTGCC301 GAGGTACCCA AGCTTGGTAA AGAAGCAGCA TTGAAGGCTC TAAAAGAGTG GGGCCAACCC361 AAGTCCAAGA TCACCCATCT TGTATTTTGT ACAACCTCCG GTGTAGAAAT GCCTGGTGCA421 GATTACAAAC TCGCTAATCT CTTAGGGCTT GAAACATCGG TCAGAAGAGT GATGTTGTAC481 CATCAAGGGT GCTATGCAGG TGGAACTGTC CTCCGAACTG CTAAGGATCT TGCAGAGAAT541 AATGCAGGAG CACGAGTTCT TGTGGTGTGC TCTGAGATCA CTGTTGTCAC ATTCCGTGGA601 CCTTCCGAAA CTGCTTTGGA CTCTTTAGTT GGCCAAGCCC TTTTTGGTGA TGGGTCTGCA661 GCTGTGATCG TTGGATCAGA TCCAGATATC TCGATTGAAC AACCACTTTT TCAACTCGTC721 TCAGCAGCCC AAACATTTAT TCCTAATTCA GCAGGTGCCA TTGCCGGGAA CTTACGTGAG781 GTGGGACTCA CATTTCATTT GTGGCCCAAT GTGCCAACTT TAATTTCTGA GAACATAGAG841 AAATGCTTGA CTCAGGCTTT TGACCCACTT GGTATTAGCG ATTGGAACTC GTTATTTTGG901 ATTGCTCACC CAGGTGGCCC TGCAATTCTT GATGCGGTTG AAGCAAAACT CAATTTAGAC961 AAAAAGAAAC TTGAAGCAAC GAGCCATGTG TTAAGTGAGT ATGGCAACAT GTCAAGTGCA1021 TGTGTGTTGT TTATTTTGGA TGAGATGAGA AAGAAATCAC TTAAGGGGGA GAAGGCCACC1081 ACAGGTGAAG GATTGGATTG GGGAGTATTA TTTGGCTTTG GACCAGGCTT GACTATTGAG1141 ACTGTTGTGT TGCATAGCAT TCCTATGGTT ACAAATTAA
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的芪合酶基因(sts)，其特征是該基因的5′調(diào)控區(qū)部分序列為1 ACCCACGAGG AGCATCGTGG AAAAAGAAGA CGTTCCAACC ACGTCTTCAA AGCAAGTGGA61 TTGATGTGAT ACTCCAAGAA TATCAAAGAT ACAGTCTCAG AAGACCAAAG GGCTATTGAG121 ACTTTTCAAC AAAGGGTAAT ATCGGGAAAC CTCCTCGGAT TCCATTGCCC AGCTATCTGT181 CACTTCATCA AAAGGACAGT AGGAAAGGAA GGTGGCACCT ACAAATGCCA TCATTGCGAT241 AAAGGAAAGG CTATCGTTCA AGATGCCTCT GCCGACAGTG GTCCCAAAGA TGGACCCCCA301 CCCACGAGGA GCATCGTGGA AAAAGAAGAC GTTCCAACCA CGTCTTCAAA GCAAGTGGAT361 TGATGTGATA TCTCCACTGA CGTAAGGGAT GACGCACAAT CCCACTATCC TTCGCCGACG421 GATCCTATTT TTACAACAAT TACCAACAAC AACAAACAAC AAACAACATT ACAATTACTA481 TTTACAATAA CAATGGACTG TCTAGAGGAT CCGCC
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的真菌芪合酶基因(sts)與宿主植物中sts基因相比不含有內(nèi)含子序列，而宿主植物sts基因183bp處含有一個(gè)361bp的內(nèi)含子，兩種sts基因的調(diào)控方式不同，宿主內(nèi)含子序列為1 TCTAATTTTA ACATCCTTTG CGTGCATATA ATTGTGTATA CATATGATAA AGCTTTTAGA61 TTCACCTCAG AGTACCGAAA CATCTTTTTC AAGCTTTCTG TGTACTCATT TTTAAATTAA121 TACAATGCAT CCGTGACTGA TGCTCAGAGC AGGTGCTCTT TCAATCATAC GGTATAAAGC181 CTGGGGTCAT ATCATTAATG TAATAAGTAA TAAGAACAAG CTTTTATATT CTATTAAGAT241 GAATCATTTT ATACTCACTG GAACAACAAA AACTATATAC ATATTATTGA GTACTACTTG301 TGTTTTACTT GCAATGCCTT GAGCTCACAT ATTACTGTTT TTTAATTCTT ATACAGGTGA361 C
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的內(nèi)生真菌，其特征是產(chǎn)物為具有藥用和保健功能的白藜蘆醇(Resveratrol)，它對于植物自身有提高抗病性的作用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的內(nèi)生真菌，其發(fā)酵后的產(chǎn)物為具有藥用和保健功能的白藜蘆醇(Resveratrol)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的內(nèi)生真菌，其通過轉(zhuǎn)化LeGDP為啟動(dòng)子的透明顫菌血紅蛋白基因(VHb)后的真菌比非轉(zhuǎn)基因的對照菌在氧受限的條件下明顯增加了代謝速度和生長量。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的內(nèi)生真菌，其通過轉(zhuǎn)化LeGDP為啟動(dòng)子的一種生長激素類的基因，如異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因(ipt)和植物生長素相關(guān)基因(iaaM)導(dǎo)入該真菌，結(jié)果加快了真菌生長速度。
全文摘要
本發(fā)明從爬山虎(Parthenocissi Tricuspidatae)內(nèi)生真菌中克隆了芪合酶基因(sts)，它與爬山虎中sts基因的編碼序列相似性為95.25％，經(jīng)18SrDNA序列鑒定該真菌屬枝孢霉菌(Cladosporiumsp.)。高效液相色譜和質(zhì)譜分析表明，該菌在離體培養(yǎng)下也能合成白藜蘆醇。對內(nèi)生真菌sts基因的非編碼部分(5端調(diào)控區(qū)及內(nèi)含子)的分析表明它與植物中sts基因的調(diào)控元件有很大區(qū)別。向內(nèi)生菌導(dǎo)入外源基因(如VHb、ipt和iaaM等)可促進(jìn)內(nèi)生菌生長。這為通過發(fā)酵培養(yǎng)此真菌來大規(guī)模生產(chǎn)白藜蘆醇開辟了一條新的途徑，也為通過改進(jìn)內(nèi)生真菌與宿主植物的相互作用來提高白藜蘆醇產(chǎn)量提供新的方法。
文檔編號A01N63/04GK1948459SQ200610150010
公開日2007年4月18日 申請日期2006年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月24日
發(fā)明者林忠平, 王曉麗, 胡鳶雷, 劉樹君 申請人:林忠平