專利名稱：一種殺線蟲生物菌劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種殺線蟲生物菌劑及其制備方法和應(yīng)用，屬生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物線蟲是一種世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生的植物病害，僅根結(jié)線蟲已知種類達(dá)70多種，危害3000多種植物，每年造成損失巨大。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)，每年全球因線蟲造成的損失高達(dá)1000多億美元，2001年我國作物受線蟲危害造成的損失高達(dá)233億元。松材線蟲被稱為無煙森林火災(zāi)，在江蘇、浙江、廣東、山東、安徽、湖北、上海、臺灣、香港等部份地區(qū)嚴(yán)重發(fā)生，有向全國漫延的趨勢。更嚴(yán)重的是由于根結(jié)線蟲侵染后造成作物傷口，致使作物根部病害嚴(yán)重發(fā)生。
目前對線蟲防治仍以化學(xué)殺線蟲劑為主。長期以來，化學(xué)殺線蟲劑在保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，防治線蟲病中發(fā)揮了重要作用。但隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，發(fā)現(xiàn)許多化學(xué)殺線蟲劑均有副作用，不僅產(chǎn)生抗藥性，更造成環(huán)境污染，危害人體健康，相繼有不少被禁用或即將禁用。如美國已經(jīng)禁止使用溴甲烷，二溴甲烷。化學(xué)殺線蟲劑在防治線蟲危害，保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的同時(shí)，給人類健康和環(huán)境帶來了一定的負(fù)面影響，開發(fā)高效低毒殺線蟲劑和生物殺線蟲劑已經(jīng)迫在眉睫。
輪枝菌是一類非常重要的生防真菌，其中很多都是重要的昆蟲和線蟲的病原真菌，能有效的防治多種有害昆蟲和線蟲，在植物的病原昆蟲和線蟲的生物防治中起著非常重要的作用。其中，蠟蚧輪枝菌和厚孢普可尼亞菌已經(jīng)應(yīng)用于生物殺蟲劑的開發(fā)，而有關(guān)刀孢輪枝菌對昆蟲和線蟲的作用目前尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過對一株產(chǎn)生胞外酶并能夠有效分解線蟲體壁結(jié)構(gòu)的內(nèi)寄生真菌刀孢輪枝菌的研究，開發(fā)殺線蟲生物菌劑。
本發(fā)明人篩選到一株對植物寄生線蟲具有很好毒殺效果的內(nèi)寄生真菌-刀孢輪枝菌Lecanicillium psalliotae，YMF1.00112。YMF1.00112菌株已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國.北京.中關(guān)村；保藏日期2005年1月27日；保藏登記入冊的編號CGMCC No.1312。
刀孢輪枝菌Lecanicillium psalliotae，YMF1.00112系本發(fā)明人從線蟲體表分離的一株內(nèi)寄生真菌，主要形態(tài)特征為在PDA培養(yǎng)基上生長較快，培養(yǎng)7天后菌落直徑達(dá)到3～6cm，菌絲生長致密，菌落顏色呈白色，背面淺黃至棕色；分生孢子梗輪狀著生，基部寬13～29μm，頂部寬0.2～0.5μm，分生孢子頭狀著生，橢圓形，鐮刀形，0.6～2.2×2.0～9.0μm，未見厚垣孢子。
本發(fā)明采用常規(guī)方法將刀孢輪枝菌擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取殺線蟲有效成分，測定其對腐生線蟲(Panagrellus redivivus)和松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)的殺蟲效果。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的YMF1.00112菌株培養(yǎng)方法1.試管種培養(yǎng)試管種采用常規(guī)方法培養(yǎng)，將YMF1.00112菌絲體接種到PDA培養(yǎng)基上，20-25℃下培養(yǎng)7～10天，獲得試管種。
2.液體擴(kuò)大培養(yǎng)液體培養(yǎng)基配方為8-15g葡萄糖；0.8-1.5g硫酸銨；0.4-0.6g硫酸鎂；0.01-0.02g硫酸亞鐵；1000ml土豆浸出汁(100g土豆加1200ml水煮沸過濾，用水補(bǔ)足至1000ml)，pH6.5。用250ml三角瓶，每個裝60ml培養(yǎng)液，121℃滅菌20分鐘后接入試管種，26℃，200rpm下?lián)u床培養(yǎng)6天。
提取殺線蟲活性成分將前述液體擴(kuò)大培養(yǎng)好的菌液過濾后，用5KDa孔徑的超濾膜進(jìn)行濃縮。濃縮液透析處理以后用陽離子交換柱進(jìn)行純化，分別收集穿透峰和洗脫峰，生物活性測定表明大部分蛋白酶活性在洗脫峰，合并洗脫峰再用疏水柱進(jìn)一步的純化，收集洗脫峰并用蒸餾水透析處理，電泳分析已達(dá)到電泳純。冷凍干燥把樣品凍干并溶解于2ml的蒸餾水中，-20℃保存，經(jīng)過超濾膜濃縮以后的制劑即為殺線蟲制劑。
殺線蟲活性試驗(yàn)1.制備試驗(yàn)用藥劑和對照用藥劑1)制備試驗(yàn)用藥劑按前述YMF1.00112菌株培養(yǎng)方法獲得菌液，按前述提取殺線蟲活性成份的方法制備試驗(yàn)用藥劑。
2)制備對照用藥劑對照1按制備試驗(yàn)用藥方法制備，不同的是，培養(yǎng)液中不接入YMF1.00112菌株；對照2將制備供試藥劑100℃煮沸30分鐘后作為對照，以證明殺線蟲有效成份是蛋白酶。
2.制備試驗(yàn)用線蟲1)制備Panagrellus redivivus線蟲將P.redivivus線蟲接種于燕麥片培養(yǎng)基上，于28℃下培養(yǎng)6天，凍于4℃冰箱備用。將所需線蟲用貝曼漏斗法洗出，置于5ml離心管內(nèi)，加5ml無菌水洗滌，瞬時(shí)離心，棄上清，重復(fù)5次得到潔凈供試線蟲。用無菌水將線蟲稀釋為含量為15條/μl的線蟲懸浮液。
2)制備松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)
在100ml三角瓶中放入15g經(jīng)水浸泡2天的玉米粒，加水10ml，高壓滅菌，接入灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。25℃培養(yǎng)4至7天。待菌絲鋪滿三角瓶后，接種經(jīng)0.25％次氯酸鈉表面消毒的松材線蟲，28℃培養(yǎng)15至20天。用無菌水將線蟲洗下，制成含量為15條/μl的線蟲懸浮液。
3.試驗(yàn)方法1)藥效試驗(yàn)方法取試驗(yàn)用藥劑200μl于1.5ml離心管中，加入活線蟲60條，離心管平放，置于25℃下，Panagrellus redivivus線蟲分別于12小時(shí)、20小時(shí)；松材線蟲分別于12小時(shí)、20小時(shí)檢查并計(jì)算線蟲的死亡率。鑒定死亡的方法為在處理離心管中加入1-5滴5％Nacl溶液，2分鐘后觀察，死蟲僵直，活蟲則卷曲或扭動。
分別用2種對照藥劑進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)。
試驗(yàn)設(shè)三個平行，兩次重復(fù)。
2)純化樣品的殺線蟲作用和對線蟲體壁的分解實(shí)驗(yàn)方法同上，用光學(xué)顯微鏡觀察純化的樣品對線蟲體壁的分解作用。
4.試驗(yàn)結(jié)果表1YMF1.001 12對Panagrellus redivivus線蟲殺蟲效果
表2YMF1.00112對松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)的殺蟲效果 結(jié)果表明，從YMF1.00112菌株液體發(fā)酵產(chǎn)物中提取的試驗(yàn)用藥劑對Panagrellusredivivus線蟲和松材線蟲均具較好的殺線蟲效果。用5倍濃縮的樣品作為藥液處理線蟲，12小時(shí)后Panagrellus redivivus線蟲100％死亡并且線蟲完全被分解，松材線蟲死亡率也達(dá)到60％以上(表2)，20小時(shí)以后松材線蟲的死亡率也達(dá)到100％，但松材線蟲的體壁結(jié)構(gòu)完整，沒有被分解。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)表明，經(jīng)陽離子柱純化的樣品的殺線蟲活性低于粗的濃縮樣品，說明有其它成分參與了殺線蟲的過程。
從處理線蟲的變化來看，經(jīng)歷了從部份體壁分解到蟲體全部降解的過程，說明活性成份主為要分解線蟲的酶類。而將同批提取的試驗(yàn)用藥劑經(jīng)過煮沸處理，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性后，其殺線蟲活性非常小，且線蟲體壁不出現(xiàn)溶解現(xiàn)象，這也證明了YMF1.00112菌株對線蟲的活性成份主要為酶類。
本發(fā)明刀孢輪枝菌YMF1.00112是一種對線蟲具有較好毒殺作用功能的真菌，其主要作用成份是胞外酶，對線蟲特別是松材線蟲的毒力顯著高于或同等于以前報(bào)道的厚孢普可尼亞菌，具備了很好的應(yīng)用開發(fā)前景。
具體實(shí)施例方式以下是本發(fā)明的實(shí)施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
實(shí)施例一
將YMF1.00112菌株接種到PDA斜面上，20-25℃下培養(yǎng)8天，獲得試管種。
將試管種接種到250ml三角瓶液體培養(yǎng)基中，每瓶裝60ml，液體培養(yǎng)基配方為10g葡萄糖，1g硫酸銨，0.5g硫酸鎂，0.015g硫酸亞鐵，1000ml土豆浸出汁，pH6.5。每個250ml三角瓶分裝60ml培養(yǎng)液，121℃滅菌20分鐘后接入試管種，26℃，200rpm下?lián)u床培養(yǎng)6天后，將菌液過濾，用5KDa孔徑的超濾膜進(jìn)行濃縮。濃縮液透析處理以后用陽離子交換柱進(jìn)行純化，分別收集穿透峰和洗脫峰，生物活性測定表明大部分蛋白酶活性在洗脫峰，合并洗脫峰再用疏水柱進(jìn)一步的純化，收集洗脫峰并用蒸餾水透析處理，電泳分析已達(dá)到電泳純。冷凍干燥把樣品凍干并溶解于2ml的蒸餾水中，-20℃保存。經(jīng)過超濾膜濃縮以后的制劑即為殺線蟲制劑。
實(shí)施例二基本同實(shí)施例一，不同之處是液體培養(yǎng)基配方為8g葡萄糖；1.5g硫酸銨；0.6g硫酸鎂；0.01g硫酸亞鐵。
實(shí)施例三基本同實(shí)施例一，不同之處是液體培養(yǎng)基配方為15g葡萄糖；0.8g硫酸銨；0.4g硫酸鎂；0.02g硫酸亞鐵。
本發(fā)明的使用效果詳見表1和表2。
權(quán)利要求
1.一種殺線蟲生物菌劑，該菌劑由生產(chǎn)菌株和輔料經(jīng)試管種培養(yǎng)、液體擴(kuò)大培養(yǎng)及提取殺線蟲活性成份工序后得到，其特征在于該生物菌劑的生產(chǎn)菌株為刀孢輪枝菌(Lecanicillium psalliotae)YMF1.00112，YMF1.00112菌株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏日期2005年1月27日；保藏號CGMCC No.1312。
2.權(quán)利要求1所述生物菌劑的制備方法，包括試管種培養(yǎng)、液體擴(kuò)大培養(yǎng)及提取殺線蟲活性成分工序，其特征在于液體擴(kuò)大培養(yǎng)基的配方為8-15g葡萄糖；0.8-1.5g硫酸銨；0.4-0.6g硫酸鎂；0.01-0.02g硫酸亞鐵；1000ml土豆浸出汁，pH6.5。
3.權(quán)利要求1所說的生物制劑，其特征在于該制劑對Panagrellus redivivus線蟲和松材線蟲具有毒殺作用，可用于植物寄生線蟲生防。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種殺線蟲生物菌劑及其制備方法和應(yīng)用，屬微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的生物菌劑由生產(chǎn)菌株經(jīng)試管種培養(yǎng)、液體擴(kuò)大培養(yǎng)及提取殺線蟲活性成分的常規(guī)方法制備，其生產(chǎn)菌株為Lecanicillium psalliotae YMF1.00112，保藏號CGMCC No.1312。本發(fā)明制備方法中液體擴(kuò)大培養(yǎng)基的配方為10g葡萄糖，1g硫酸銨，0.5g硫酸鎂，0.015g硫酸亞鐵，1000ml土豆浸出汁，pH6.5。本發(fā)明的殺線蟲生物菌劑對松材線蟲和Panagrellus redivivus線蟲具有毒殺作用，可用于植物寄生線蟲生防。本發(fā)明具有毒殺力高、有利于人體健康和環(huán)境保護(hù)等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號A01N63/04GK1663394SQ20051001069
公開日2005年9月7日 申請日期2005年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月16日
發(fā)明者張克勤, 楊金奎, 周薇 申請人:云南大學(xué)