專利名稱：一種培育低重金屬積累植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種培育低重金屬積累植物的方法。
背景技術(shù)：
隨著工業(yè)的發(fā)展，重金屬污染已成為一個(gè)嚴(yán)重威脅人類生存的問(wèn)題，其中鎘(Cd)是此類污染物之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)受鎘污染的農(nóng)田面積已超過(guò)20萬(wàn)畝，有11處污灌區(qū)甚至達(dá)到了生產(chǎn)“鎘米”的程度，如沈陽(yáng)的張士灌區(qū)由于采用污水灌溉造成嚴(yán)重的鎘污染，導(dǎo)致大面積水稻嚴(yán)重減產(chǎn)，且稻米含鎘量超標(biāo)。此外，成都東郊污灌區(qū)內(nèi)稻米的含鎘量最高可達(dá)1.65mg/kg，湖北大冶稻谷的含鎘量最高可達(dá)1.7mg/kg。調(diào)查表明，污灌區(qū)居民每人每日攝取的鎘量平均為558μg，大大超過(guò)了聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織議定的每日每公斤體重1μg的最大可忍受值。重金屬鎘較其它重金屬更容易被農(nóng)作物吸收，因此更容易對(duì)人類健康造成危害。研究表明，長(zhǎng)期攝入過(guò)量的鎘，會(huì)影響體內(nèi)其它有益元素的效能，導(dǎo)致肝腎損害、肺氣腫、支氣管炎、內(nèi)分泌失調(diào)、食欲不振、失眠等疾病。2003年8月，Nature-Medicine發(fā)表文章指出鎘有模擬雌激素的作用，即便低于每日每公斤體重1μg的劑量也會(huì)對(duì)機(jī)體造成影響，甚至可誘發(fā)子宮癌和乳癌。
針對(duì)農(nóng)業(yè)土壤重金屬污染嚴(yán)重的現(xiàn)實(shí)，國(guó)內(nèi)外多從兩方面入手解決這一難題。一方面，采用常規(guī)的物理或化學(xué)方法，如吸附固定法、絡(luò)合浸提法，以及近年來(lái)新興的生物修復(fù)技術(shù)來(lái)清除、凈化受重金屬污染的土壤。然而用吸附固定法、絡(luò)合浸提法清除土壤污染的成本太高且收效甚微，難以進(jìn)行大面積推廣使用，尤其不適用于發(fā)展中國(guó)家。另一方面，近年來(lái)人們開始研究利用高等植物能夠吸收和富集重金屬的特性來(lái)凈化被污染的土壤或水體的新技術(shù)，即植物修復(fù)技術(shù)，這是一種經(jīng)濟(jì)有效的去污凈化方案，由于它可使金屬回收具有潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，還能保持土壤結(jié)構(gòu)和微生物活性，因此被土壤及環(huán)境專家視為集“生態(tài)效益、環(huán)境效益、經(jīng)濟(jì)效益與社會(huì)效應(yīng)”于一體的原位綠色技術(shù)。但是目前國(guó)內(nèi)外尚沒(méi)有通過(guò)現(xiàn)代分子調(diào)控技術(shù)培育對(duì)重金屬高耐受低吸收農(nóng)作物，特別是開發(fā)在農(nóng)作物食用部分不積累重金屬的關(guān)鍵技術(shù)的研究。
RNA干涉技術(shù)(RNA interference，簡(jiǎn)稱RNAi)是指一些雙鏈RNA能夠特異地誘導(dǎo)產(chǎn)生一種能夠識(shí)別并降解這樣的RNA序列的RNase，從而在轉(zhuǎn)錄后的水平上強(qiáng)烈地抑制該類基因的表達(dá)，即利用上述雙鏈RNA使目的基因沉默的技術(shù)。當(dāng)已知某個(gè)或某類具有特定功能基因的cDNA序列時(shí)，可將該cDNA片段與一段能夠被預(yù)期的宿主細(xì)胞識(shí)別并切除的內(nèi)含子序列構(gòu)建成“cDNA-內(nèi)含子-cDNA”的結(jié)構(gòu)，將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的核酸酶就會(huì)將轉(zhuǎn)錄出的RNAi結(jié)構(gòu)中的由內(nèi)含子片段轉(zhuǎn)錄的部分切除，形成一段由cDNA轉(zhuǎn)錄出的雙鏈RNA結(jié)構(gòu)，而該雙鏈RNA結(jié)構(gòu)會(huì)誘導(dǎo)宿主細(xì)胞合成一種RNase，該RNase可特異地識(shí)別并降解宿主細(xì)胞內(nèi)正常轉(zhuǎn)錄的目的基因的mRNA，從而抑制該基因的表達(dá)。
研究表明，植物絡(luò)合素(Phytochelatins，PCs)是一種可以有效地螯合鎘(Cd)等重金屬的多肽物質(zhì)，在植物對(duì)重金屬Cd的抗性機(jī)制中起重要作用。PCs主要通過(guò)絡(luò)合與區(qū)室化作用來(lái)對(duì)重金屬離子特別是鎘離子起解毒作用。經(jīng)過(guò)不同途徑進(jìn)入液泡的低分子量PCs-Cd復(fù)合物在液泡中最終形成高分子量的PCs-Cd復(fù)合物，Cd被有效地與細(xì)胞中的其它生物分子隔離。在液泡的酸性環(huán)境中，雖然S2-、SO32-可對(duì)高分子量的Cd-PCs復(fù)合物起到穩(wěn)定作用，但是此復(fù)合物還是可能發(fā)生降解。降解后游離出的Cd2+可被液泡中含量豐富的有機(jī)酸如蘋果酸、檸檬酸、草酸等所沉淀，而復(fù)合物中的多肽成分將被分解為氨基酸，氨基酸又可進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，參與下一輪PCs的合成或其它代謝過(guò)程。目前已知植物絡(luò)合素不是基因的直接表達(dá)產(chǎn)物，而是以谷胱甘肽為底物的酶促反應(yīng)的產(chǎn)物，其中植物絡(luò)合素合酶(Phytochelatin synthase，PCS)是合成該多肽物質(zhì)的關(guān)鍵酶。目前為止，包括水稻在內(nèi)的十幾種植物的PCS基因已被克隆并進(jìn)行了序列測(cè)定。水稻的PCS基因與重金屬尤其是鎘的吸收有關(guān)。
統(tǒng)計(jì)資料表明，全世界水稻的平均播種面積近20億公頃，幾乎有一半人口(主要集中在亞洲)以水稻作為主要食品。水稻也是我國(guó)重要的糧食作物，種植面積占糧食作物總面積的30％左右，稻谷產(chǎn)量占糧食總產(chǎn)量的50％左右，平均畝產(chǎn)超過(guò)350公斤，比世界平均產(chǎn)量高40％，全國(guó)約有6億多人以水稻為主食。目前我國(guó)的一些水稻主產(chǎn)區(qū)，由于污水灌溉、化肥及殺蟲劑的過(guò)量使用導(dǎo)致土壤重金屬離子污染，并造成稻米中重金屬含量超標(biāo)，由此引發(fā)的糧食安全問(wèn)題日趨為公眾所關(guān)注。但是以我國(guó)現(xiàn)階段的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)條件，又不可能對(duì)這些糧食產(chǎn)區(qū)進(jìn)行土地的廢耕處理，并且在目前的流通和監(jiān)管體制下，也無(wú)法阻止這些受污染糧食流入市場(chǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種培育低重金屬積累植物的方法。
本發(fā)明所提供的培育低重金屬積累植物的方法，包括以下步驟1)構(gòu)建含有“植物重金屬吸收相關(guān)基因cDNA-內(nèi)含子-植物重金屬吸收相關(guān)基因cDNA”結(jié)構(gòu)的RNAi表達(dá)載體；2)將步驟1)的RNAi表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物，獲得低重金屬積累植物。
當(dāng)所述RNAi表達(dá)載體的啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子(如Ubiquitin啟動(dòng)子)時(shí)，可培育整個(gè)植株中低重金屬積累的植物；當(dāng)所述RNAi表達(dá)載體的啟動(dòng)子為組織特異性啟動(dòng)子(如ZMM1啟動(dòng)子)時(shí)，可培育目標(biāo)組織和器官中低重金屬積累的植物。
所述Ubiquitin啟動(dòng)子是一個(gè)來(lái)源于玉米的組成型表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子，所述ZMM1啟動(dòng)子來(lái)源于玉米，可啟動(dòng)外源基因在種子中表達(dá)。
所述植物重金屬吸收相關(guān)基因可為植物絡(luò)合素基因、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因或金屬硫蛋白基因。
所述內(nèi)含子的大小為300-700bp，任意一個(gè)植物基因組的內(nèi)含子序列均能達(dá)到本發(fā)明的目的，但最好是來(lái)源于目標(biāo)植物。
本發(fā)明的方法較適合于培育如下低重金屬積累的植物，如低Cd、Cu、As或Pb等多種重金屬元素積累的植物，尤其是低鎘積累植物(水稻、玉米或小麥等)，特別適合于培育低鎘積累水稻。
當(dāng)培育低鎘積累水稻時(shí)，所述植物絡(luò)合素基因可為水稻植物絡(luò)合素基因片段。
所述水稻植物絡(luò)合素基因片段可為具有序列表中序列1的核苷酸序列或?yàn)樾蛄?的5’至3’端第4-434位堿基共431bp的核苷酸片段。
其中，序列表中的序列1由1422個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1到第1422位堿基，編碼具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
用于構(gòu)建所述RNAi表達(dá)載體的出發(fā)載體可為基因工程領(lǐng)域中的植物表達(dá)載體，如pTCK303、pCAMBIA1301(CAMBIA)或pBI121(CLONTECH)等；優(yōu)選為含有ubiquitin啟動(dòng)子和NOS基因終止子的載體pTCK303。
以pTCK303為出發(fā)載體構(gòu)建的含有水稻植物絡(luò)合素基因(OsPCS1)片段的RNAi表達(dá)載體為pUbi-RNAi-OsPCS1；為了特異地降低種子中重金屬Cd的累積量，還可將pUbi-RNAi-OsPCS1中的ubiquitin啟動(dòng)子切除后，將其與種子特異啟動(dòng)子ZMM1重新連接，獲得RNAi表達(dá)載體pZMM1-RNAi-OsPCS1。
所述轉(zhuǎn)化植物的方法可為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法或花粉管通道法，優(yōu)選為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法。
所述轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌優(yōu)選為農(nóng)桿菌EHA105。
以pUbi-RNAi-OsPCS1為RNAi表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻為例，說(shuō)明本發(fā)明方法的原理pUbi-RNAi-OsPCS1通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)整合到水稻細(xì)胞染色體之后，內(nèi)含子和其兩端的OsPCS1片段在Ubiquitin啟動(dòng)子的控制之下轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后內(nèi)含子被切除，從而形成大量的OsPCS1片段的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。Dicer酶復(fù)合物將結(jié)合這個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，然后又以其為模板與水稻內(nèi)源OsPCS1的mRNA結(jié)合，并以大約22bp左右的間隔將其切割，從而抑制OsPCS1的表達(dá)。
本發(fā)明利用含有種子特異性啟動(dòng)子ZMM1的RNAi表達(dá)載體pZMM1-RNAi-OsPCS1轉(zhuǎn)化水稻，實(shí)現(xiàn)了在水稻種子中特異地抑制OsPCS1的表達(dá)，獲得了在種子中低鎘積累的水稻(與對(duì)照相比降低了76％)。本發(fā)明的方法具有廣泛的適用性，可實(shí)現(xiàn)在重金屬污染的土地上生產(chǎn)的糧食既耐受重金屬離子而又在食用部分(種子)不積累或低積累重金屬，以獲得新型優(yōu)質(zhì)的安全作物品種。


圖1為重組載體pUbi-RNAi-OsPCS1的構(gòu)建示意2為重組載體pZMM1-RNAi-OsPCS1的構(gòu)建示意3為未轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織圖4為轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織圖5為開始分化的水稻轉(zhuǎn)化愈傷組織圖6為移栽的轉(zhuǎn)基因水稻圖7為轉(zhuǎn)基因水稻幼苗圖8為GUS檢測(cè)結(jié)果圖9為PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株的瓊脂糖凝膠電泳圖譜圖10為轉(zhuǎn)基因植株和野生型水稻種子中的OsPCS1 RT-PCR定量分析結(jié)果圖11為轉(zhuǎn)基因水稻葉、穎殼和種子中的OsPCS1 RT-PCR定量分析結(jié)果圖12a為水稻SRNAi-09株系與對(duì)照莖、葉、穎殼和稻米中鎘積累的比較圖12b為水稻SRNAi-09株系與對(duì)照根中鎘積累的比較具體實(shí)施方式
實(shí)驗(yàn)材料及化學(xué)試劑1、質(zhì)粒質(zhì)粒pCAMBIA1301為CAMBIA產(chǎn)品，pUC19購(gòu)自TaKaRa公司。
2、植物材料水稻品種采用粳稻日本晴(Oryza sativa L.ssp.japonica)，其萌發(fā)條件為將水稻種子置于鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，室溫下置于暗處，3-4天后發(fā)芽，再將其置于光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)7天，用于提取RNA。
3、化學(xué)試劑所用限制性內(nèi)切酶，mRNA selective kit，LA Taq DNA合成酶，dNTP均購(gòu)于TaKaRa生物技術(shù)公司；SMARTTMcDNA Library Construction Kit，SMARTTMRACE cDNAAmplification Kit購(gòu)于Clontech公司；pGEM-T Easy載體購(gòu)于Promega公司；Trizol，Superscript Reverse Transcriptase購(gòu)于Invitrogen公司；其它常用化學(xué)藥品購(gòu)于華美生物工程公司、北京化學(xué)試劑公司；引物由上海生工生物工程公司和博亞公司合成，序列測(cè)定工作由基康公司和博亞生物技術(shù)公司完成。
下述實(shí)例中所用實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、OsPCS1表達(dá)被抑制的轉(zhuǎn)基因水稻的獲得及其表達(dá)檢測(cè)一、水稻RNAi載體的構(gòu)建1、水稻總RNA的提取包括以下步驟1)取100mg萌發(fā)7天的水稻幼苗，置液氮中研磨至粉狀，加入1ml Trizol試劑，混勻后12000rpm離心5分鐘，取上清；2)將步驟1)中的上清液用1∶1比例混合的苯酚氯仿溶液抽提兩遍，離心取上清；3)向步驟2)獲得的上清中加入等體積的異丙醇，沉淀5分鐘后4℃ 12000rpm離心5分鐘，棄上清；4)將步驟3)中獲得的沉淀用70％乙醇洗兩遍；5)將步驟4)的沉淀在室溫下干燥10分鐘，再將沉淀溶于20μl DEPC處理水。
2、mRNA的純化及濃縮使用Oligotex mRNA Spin-Column Kit(Clontech公司)并參照其說(shuō)明書對(duì)步驟1獲得的水稻總RNA進(jìn)行純化及濃縮，得到含有水稻mRNA的濃縮液，具體步驟如下1)取250-500μg步驟1獲得的水稻總RNA置于1.5ml離心管中，60℃加熱3min；2)加入RNase-free水至總體積為500μl，漩渦混合5sec；3)加入500μl OBB緩沖液(Oligotex mRNA Spin-Column Kit自帶)和30μlOligotex凝膠懸浮液(Oligotex mRNA Spin-Column Kit自帶)后混勻，70℃保溫3min；4)室溫放置10min后，15000rpm離心3min，棄上清；5)加入400μl OW2緩沖液(Oligotex mRNA Spin-Column Kit自帶)懸浮沉淀后，將其轉(zhuǎn)移至small spin column(Oligotex mRNA Spin-Column Kit自帶)中，15000rpm離心2min，棄收集液；6)再向small spin column中加入400μl OW2緩沖液，15000rpm離心2min，棄收集液；7)將small spin column轉(zhuǎn)移至一新的RNase-free的1.5ml離心管中，加入50μl 70℃預(yù)熱的OEB溶液(Oligotex mRNA Spin-Column Kit自帶)，懸浮凝膠，15000rpm離心2min，獲得經(jīng)純化的mRNA溶液；
8)向純化的mRNA溶液中加入1/10體積的3M NaAc和2倍體積的乙醇，-20℃放置1h后8000rpm離心15min，棄上清；9)向步驟8)的沉淀中加入1ml 70％乙醇，混勻后8000rpm離心15min，棄上清；10)將步驟9)的沉淀室溫下干燥10min，用RNase-free水溶解沉淀獲得水稻mRNA濃縮液。
3、水稻cDNA的合成使用SMARTTMcDNA Library Construction Kit并參照其說(shuō)明書合成水稻的cDNA，具體步驟如下1)配制第一鏈合成反應(yīng)液1μL水稻總RNA(約0.5μg)、1μl SMART IVTM寡核苷酸(SMARTTMcDNA Library Construction Kit自帶)、1μl CDS III/3’PCR引物(序列為5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG(T)30-3’，SMARTTMcDNA LibraryConstruction Kit自帶)和2μl DEPC處理的H2O，將上述溶液混勻后72℃保溫2min，再冰浴2min得到第一鏈合成反應(yīng)液；2)水稻第一鏈cDNA合成反應(yīng)，反應(yīng)體系為2.0μl 5×第一鏈合成反應(yīng)液、1.0μL DTT(20mM)、1.0μl dNTP混合物(10mM)和1.0μl Superscript ReverseTranscriptase，42℃空氣浴1hr，再置于冰上終止反應(yīng)；3)合成水稻雙鏈cDNA，反應(yīng)體系為2μL步驟2)合成的水稻第一鏈cDNA、80μl滅菌水、10μl 10×PCR反應(yīng)緩沖液、2μl 50×dNTP混合液、2μl 5’PCR引物(序列為5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’，10mM)、2μl CDS III/3’PCR引物(SMARTTMcDNA Library Construction Kit自帶)和2μl 50×Advantage 2DNA聚合酶(SMARTTMcDNA Library Construction Kit自帶)；反應(yīng)程序?yàn)?2℃ 10min；95℃ 1min；再95℃ 15sec，68℃ 8min 3個(gè)循環(huán)。
4)反應(yīng)結(jié)束后將PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果得到0.5-2kb的彌散條帶，表明獲得了水稻cDNA，-20℃保存。
4、OsPCS1基因的克隆根據(jù)Tiger(http//www.tigr.org)所公布的推測(cè)的水稻日本晴(Oryza sativa L.ssp.Japonica)的植物絡(luò)合素合酶基因序列設(shè)計(jì)引物，并分別在上游引物中加入EcoRI識(shí)別位點(diǎn)，在下游引物中加入PstI識(shí)別位點(diǎn)，引物序列如下引物1(OsPCS-up)5’-GAATTCATGGCGTCTAAACCAAGCA-3’(劃線部分堿基為EcoRI識(shí)別位點(diǎn))引物2(OsPCS-lw)5’-CTGCAGTCAATGCAAGGTTCTAGGAG-3’(劃線部分堿基為Pst I識(shí)別位點(diǎn))以步驟3獲得的水稻cDNA為模板，在引物1和引物2引導(dǎo)下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為步驟3獲得的水稻cDNA 1ng、12μl H2O、2μl 10×PCR反應(yīng)緩沖液、3μl 10mM dNTP混合液，1μl引物1(10mM)，1μl引物2(10mM)，1μl LATaq DNA聚合酶；PCR循環(huán)條件為94℃ 5min；再94℃ 20sec，50℃ 20sec，72℃ 3min，3個(gè)循環(huán)；然后94℃ 20sec，65℃ 20sec，72℃ 3min，30個(gè)循環(huán)。將擴(kuò)增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)Tiger所公布的水稻日本晴(Oryza sativa L.ssp.Japonica)的植物絡(luò)合素合酶基因序列(長(zhǎng)度為1497bp)用玻璃奶DNA回收試劑盒(博大泰克公司)回收1.5kb左右的基因片段，經(jīng)測(cè)序結(jié)果表明，該基因片斷具有序列表中序列1的核苷酸序列，自5’端至3’端序列長(zhǎng)度為1422bp，編碼具有序列表中序列2(473個(gè)氨基酸殘基)的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。并將該基因命名為OsPCS1，所克隆的OsPCS1序列與Tiger所公布的序列1497bp相比，自5’至3’端第734位堿基處開始缺失了長(zhǎng)度為75bp的片斷，因而選擇OsPCS1基因自5’至3’端第4-434位堿基共431bp的核苷酸片段作為靶序列進(jìn)行RNAi抑制。再用T4DNA連接酶將電泳純的OsPCS1與載體pGEM-T Easy連接，將連接產(chǎn)物用引物1和引物2進(jìn)行PCR檢測(cè)和酶切鑒定后，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果表明獲得了正確的含有OsPCS1的重組載體，并將其命名為pGEM-OsPCS1，將該重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，選取陽(yáng)性克隆提質(zhì)粒。
5、水稻RNAi載體的構(gòu)建含玉米u(yù)biquitin啟動(dòng)子和nopaline synthetase(NOS)基因的終止子融合到pCAMBIA1301中(參見文獻(xiàn)Ge L et al.，Overexpression of OsRAA1 causespleiotropic phenotypes in transgenic rice plants，including altered leaf，flower，and root development and root response to gravity.Plant Physiology，2004.135，1502-1513)。將水稻內(nèi)含子序列參見水稻基因組序列中第7號(hào)染色體中(GenBank AP003758)OsTubA1(GenBank X91808)基因的第三個(gè)內(nèi)含子的序列(557bp)插入以上載體的ubiquitin啟動(dòng)子和NOS基因終止子之間，即構(gòu)建成質(zhì)粒pTCK303，所含酶切位點(diǎn)如圖1所示。根據(jù)參考文獻(xiàn)(Theissen G et al.，Structuralcharacterization，chromosomal localization and phylogenetic evaluation of twopairs of AGAMOUS-like MADS-box genes from maize.Gene，1995.156(2)，155-166)所提供的序列(GenBank X81199)，設(shè)計(jì)引物對(duì)(5’-CCA AGC TTC ATG CAT GGC GGCATG ACC A-3’，斜體劃線部分堿基為HindIII位點(diǎn)；5’-CTG GAT CCG CTG GAG ATCTCA GCT GAA ATG CA-3’，斜體劃線部分堿基為BamH I位點(diǎn))以玉米基因組DNA為模板擴(kuò)增(反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 2min；再94℃ 30min，64℃ 30sec，72℃ 2min，30個(gè)循環(huán)；然后72℃ 10min)種子專一性表達(dá)的ZMM1啟動(dòng)子，并利用限制性內(nèi)切酶Hind III和BamH I將其克隆到pUC19上構(gòu)建成質(zhì)粒pKM1-I。
選取步驟4擴(kuò)增的OsPCS1基因自5’至3’端第4-434位堿基共431bp的核苷酸片段作為靶序列進(jìn)行RNAi抑制，并將其作為所要構(gòu)建的水稻RNAi載體的目標(biāo)元件，根據(jù)所測(cè)定的OsPCS1序列設(shè)計(jì)引物，并分別在上游引物中加入Kpn I和Spe I識(shí)別位點(diǎn)，在下游引物中加入Sac I和BamH I識(shí)別位點(diǎn)，引物序列如下引物3(Os-pcs-ks up) Kpn I Spe I引物4(Os-pcs-bns lw)5’-CGGGATCCATGGAGCTCGGCGAGCGTGGCC-3’BamH I Sac I以步驟4的質(zhì)粒pGEM-OsPCS1為模板，在引物3和引物4引導(dǎo)下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為pGEM-OsPCS1 1-10ng，10×PCR緩沖液2μl，dNTPs(10mM)3μl，LA Taq DNA聚合酶1μl，1μl引物3(10mM)，1μl引物4(10.mM)，用ddH20至20μl；PCR循環(huán)條件為94℃ 5min；再94℃ 20sec，55℃ 20sec，72℃ 3min，2個(gè)循環(huán)；然后94℃ 20sec，65℃ 20sec，72℃ 3min，30個(gè)循環(huán)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，表明獲得了長(zhǎng)度約431bp的片段，用玻璃奶DNA回收試劑盒(博大泰克公司)回收該431bp左右的基因片段，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符，獲得了序列正確的RNAi靶序列。將該回收片段用Sac I和Spe I限制性內(nèi)切酶酶切后與用相同酶酶切的載體pTCK303用T4DNA連接酶連接得到重組載體，將其命名為p2S-OsPCS1(用于構(gòu)建水稻RNAi載體的中間載體)，再把該回收片段和中間載體p2S-OsPCS1用BamH I和Kpn I雙酶切后用T4DNA連接酶連接，得到含有ubiquitin啟動(dòng)子和兩段序列相同、方向相反的OsPCS1序列的OsPCS1的水稻RNAi載體，將其命名為pUbi-RNAi-OsPCS1(其構(gòu)建過(guò)程如圖1所示)；用HindIII和BamH I將重組載體pUbi-RNAi-OsPCS1所含的ubiquitin啟動(dòng)子切除，用HindIII和BamH I將種子特異表達(dá)啟動(dòng)子ZMM1從質(zhì)粒pKM1-I上切下，電泳回收該ZMM1啟動(dòng)子片段，然后將其用T4DNA連接酶與切除了ubiquitin啟動(dòng)子的線性pUbi-RNAi-OsPCS1片段連接獲得種子特異水稻RNAi載體，將其命名為pZMM1-RNAi-OsPCS1(其構(gòu)建過(guò)程如圖2所示)。
二、水稻的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配方A)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽，B5培養(yǎng)基的微量元素和維生素，水解酪蛋白300mg/L，脯氨酸500mg/L，蔗糖30g/L，山梨醇30g/L，2，4-D 2mg/L，植物凝膠2.0g/L，pH5.8；B)共培養(yǎng)培養(yǎng)基N6培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽，B5培養(yǎng)基的微量元素和維生素，水解酪蛋白1g/L，脯氨酸500mg/L，蔗糖30g/L，葡萄糖20g/L，2，4-D 2mg/L，植物凝膠2.0g/L，100μmol/L乙酰丁香酮，pH5.2；C)篩選培養(yǎng)基N6培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽，B5培養(yǎng)基的微量元素和維生素，水解酪蛋白1g/L，脯氨酸500mg/L，蔗糖30g/L，2，4-D 2mg/L，植物凝膠2.0g/L，羧芐青霉素500mg/L，潮霉素50mg/L pH5.8；D)分化培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽、微量元素，水解酪蛋白2g/L，脯氨酸500mg/L，蔗糖30g/L，山梨醇30g/L，6-BA 2mg/L，NAA 0.2mg/L，植物凝膠2.0g/L，潮霉素30mg/L pH5.8E)壯苗培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽、微量元素，蔗糖30g/L，植物凝膠2.0g/L，潮霉素50mg/L pH5.8；F)農(nóng)桿菌培養(yǎng)基YEB培養(yǎng)基添加50mg/L利福平、100mg/L卡那霉素和100mg/L鏈霉素。
1、水稻愈傷組織的誘導(dǎo)取成熟粳稻日本晴(Oryza sativa L.ssp.japonica)的種子，剝?nèi)ネ鈿ず笥?0％乙醇浸泡1分鐘進(jìn)行消毒，再用無(wú)菌水沖洗2-3遍；然后用0.1％的升汞溶液振蕩消毒20分鐘，再用無(wú)菌水沖洗5-6遍，將消毒后的種子置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，于28℃暗培養(yǎng)，每14天繼代一次。繼代2次后，得到愈傷組織(圖3)。
2、根癌農(nóng)桿菌的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化具體包括以下步驟1)根癌農(nóng)桿菌的培養(yǎng)用電轉(zhuǎn)化法將步驟一構(gòu)建的表達(dá)載體pUbi-RNAi-OsPCS1和pZMM1-RNAi-OsPCS1導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中，經(jīng)篩選，將含有載體pUbi-RNAi-OsPCS1的重組菌株命名為EHA105/pUbi-RNAi-OsPCS1，將含有載體pZMM1-RNAi-OsPCS1的重組菌株命名為EHA105/pZMM1-RNAi-OsPCS1。從YEB固體培養(yǎng)基上分別挑取上述重組菌EHA105/pUbi-RNAi-OsPCS1和EHA105/pZMM1-RNAi-OsPCS1的單克隆接種到20ml含100mg/L卡那霉素(Km)、100mg/L鏈霉素以及50mg/L利福平(Rif)的YEB液體培養(yǎng)基中，在28℃ 210rpm振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600約0.5)。培養(yǎng)結(jié)束后3000rpm離心10min，棄上清，將沉淀用等體積的含100μmol/L乙酰丁香酮(AS)的液體AAM培養(yǎng)基懸浮。
2)將步驟1的愈傷組織在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)一周后，將其分別用含有重組菌EHA105/pUbi-RNAi-OsPCS1和EHA105/pZMM1-RNAi-OsPCS的液體AAM培養(yǎng)基浸泡20min，用無(wú)菌濾紙吸干多余培養(yǎng)液，然后將用上述兩種不同菌株侵染的愈傷組織轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上(其表面鋪一張無(wú)菌濾紙)，在25℃的黑暗條件下共培養(yǎng)48-72小時(shí)。
3)將步驟2)的愈傷組織用含0.1mol/L甘露醇和500mg/L羧芐青霉素的無(wú)菌水沖洗3次，用無(wú)菌濾紙吸干多余水分后轉(zhuǎn)移到含有50mg/L潮霉素和500mg/L羧芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，具體操作為a)抗性愈傷組織的篩選將上述愈傷組織用選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)21天(圖4)后繼代第一次，以后每14天繼代一次，一個(gè)月左右，在褐色或黑色的愈傷組織上長(zhǎng)出白色的抗性愈傷組織；b)分化將經(jīng)過(guò)3代篩選長(zhǎng)出的生長(zhǎng)迅速、結(jié)構(gòu)致密的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到鋪放有2層無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中干燥處理2天，然后將其接種到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件設(shè)為光周期12小時(shí)，白天28℃，夜晚25℃(每2周繼代一次)，約一個(gè)月后愈傷組織開始變綠、發(fā)芽，同時(shí)開始生根(圖5)；c)壯苗將分化出芽與根的幼苗轉(zhuǎn)移到壯苗培養(yǎng)基上，至幼苗高度為10cm后打開容器封口膜，煉苗2-3天，然后將小苗移入人工氣候室栽培(圖6、圖7)。
三、轉(zhuǎn)基因水稻的篩選1、GUS檢測(cè)取長(zhǎng)約0.2cm大小的未轉(zhuǎn)化植株(對(duì)照)或轉(zhuǎn)化植株的葉片材料進(jìn)行GUS染色，結(jié)果得到轉(zhuǎn)化有pZMM1-RNAi-OsPCS的含有ZMM1啟動(dòng)子的RNAi陽(yáng)性植株共35株(共轉(zhuǎn)化67株)，圖8中左側(cè)葉片為對(duì)照的葉片，右側(cè)葉片為轉(zhuǎn)化植株的葉片；但在相同的轉(zhuǎn)化和篩選條件下，含有ubiquitin啟動(dòng)子啟動(dòng)的RNAi植株難以轉(zhuǎn)化和分化，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)共得到23株，用GUS染色確認(rèn)轉(zhuǎn)化有pUbi-RNAi-OsPCS1(含有ubiquitin啟動(dòng)子)的陽(yáng)性苗僅獲得4株。
2、基因組PCR檢測(cè)提取步驟1經(jīng)GUS染色檢測(cè)為陰性和陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化植株的總DNA，在靠近ZMM1啟動(dòng)子3’端處設(shè)計(jì)上游引物(引物5(zmm1113s)5’-TGTTCATCCCATTTGCTG-3’)，將其與OsPCS1片段中的特異引物(引物6(Pospcs168s)5’-CAGCCTCGTCTCCGTCT-3’)配合，以上述提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)，將PCR進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)結(jié)果如圖9所示(泳道1為GUS染色檢測(cè)為陰性的轉(zhuǎn)化植株，泳道2為野生型植株，泳道3-8為GUS染色檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化植株，泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量(分子量范圍100-3000bp)，表明獲得了OsPCS1的RNAi載體轉(zhuǎn)入的轉(zhuǎn)基因水稻植株。
實(shí)施例2、轉(zhuǎn)基因水稻組織中OsPCS1表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)
1、材料處理分別提取pZMM1-RNAi-OsPCS轉(zhuǎn)化植株和野生型植株不同部位(葉片、種子、穎殼)的總RNA，按實(shí)施例1中步驟一的方法提取不同部位的RNA，用Beckman DU640可見-紫外分光光度計(jì)測(cè)其濃度，再按實(shí)施例1中步驟一所述方法合成不同部位的cDNA。
2、RT-PCR對(duì)OsPCS1轉(zhuǎn)錄的定量分析植物中的微管蛋白(tublin)的編碼基因?yàn)榻M成型表達(dá)，因此選擇該基因作為RT-PCR檢測(cè)的內(nèi)參。根據(jù)水稻中tublin所編碼的基因序列設(shè)計(jì)引物，引物序列如下引物7(OsTublin1)5’-GAACTGGTATGGTCAAGGCTG-3’引物8(OsTublin2)5’-ACACGGAGCTCGTTGTAGAAG-3’以步驟1獲得的cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。該RT-PCR反應(yīng)體系為步驟1獲得的cDNA 1ng，10×PCR緩沖液2μl，dNTPs(10mM)3μl，LA Taq聚合酶1μl，引物7和引物8(10μM)各1μL，用ddH2O補(bǔ)充至20μL。反應(yīng)條件為94℃ 3min；94℃ 20sec，55℃ 20sec，72℃ 50sec；94℃ 20sec，54.5℃ 20sec，72℃ 50sec；94℃ 20sec，54℃ 20sec，72℃ 50sec；94℃ 20sec，53.5℃ 20sec，72℃ 50sec；94℃ 20sec，53℃ 20sec，72℃ 50sec，19個(gè)循環(huán)。對(duì)得到的PCR產(chǎn)物定量，然后調(diào)整模板量使PCR產(chǎn)物量一致，再以定量的不同組織的第一鏈cDNA為模板，在OsPCS1特異引物(引物序列如下)的引導(dǎo)下，進(jìn)行PCR檢測(cè)OsPCS1的轉(zhuǎn)錄情況引物9(OsPCS588s)5’-CGCTCGCTTCAAATACCCTC-3’引物10(OsPCS824a)5’-GGATCCTCCTTCCTCTTGTCTCC-3’PCR反應(yīng)體系為定量的第一鏈cDNA 1ng，10×PCR緩沖液2μl，dNTPs(10mM)3μl，LA Taq聚合酶1μl，引物9和引物10(10μM)各1μl，用ddH2O補(bǔ)充至20μl。反應(yīng)條件為94℃ 3min；94℃ 20sec，55℃ 20sec，72℃ 50sec；94℃ 20sec，54.5℃ 20sec，72℃ 50sec；94℃ 20sec，54℃ 20sec，72℃ 50sec；94℃ 20sec，53.5℃ 20sec，72℃ 50sec；94℃ 20sec，53℃ 20sec，72℃ 50sec，27個(gè)循環(huán)。
取等量的PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳、掃描后，利用Bio1D對(duì)各泳道的條帶進(jìn)行積分，同法測(cè)定對(duì)應(yīng)的Tublin表達(dá)量，結(jié)果如圖10所示，表明與野生型相比，ZMM1啟動(dòng)子調(diào)控的RNAi植株種子中OsPCS1的轉(zhuǎn)錄量降低了54.5％，說(shuō)明OsPCS1在種子中轉(zhuǎn)錄后受到了明顯的抑制，但并不是完全抑制。轉(zhuǎn)基因植株不同部位的OsPCS1表達(dá)量大小順序如下葉＞穎殼＞種子(圖11)。
實(shí)施例3、鎘的原子吸收實(shí)驗(yàn)在28L的塑料桶中種植水稻，每桶中裝入25公斤按1∶1比例混勻的林下土和泥炭土。每桶種植野生型和轉(zhuǎn)基因植株各2株，移栽一個(gè)月后加入CdSO4(終濃度為10ppm)。水稻在網(wǎng)室中成熟收獲后，分別對(duì)多個(gè)株系的不同部位包括根、莖、葉、穎殼和稻米取材，在80攝氏度烘箱中放置24小時(shí)后，委托北京譜尼理化分析測(cè)試中心進(jìn)行原子吸收測(cè)定，所用儀器為SB-01原子吸收光譜儀AAS(SOLAAR-M6TJA)，參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.15-2003進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定方法如下1)取水稻的不同部位(根、莖、葉、穎殼和稻米)在80攝氏度的烘箱中烘烤24小時(shí)，磨碎過(guò)20目篩，備用；2)樣品消解稱取0.5g樣品，置于瓷坩鍋中，先小火碳化至無(wú)煙，移入馬弗爐500±2.5攝氏度灰化6-8小時(shí)，自然冷卻。用硝酸(0.5mol/L)將灰分充分溶解，少量多次地過(guò)濾到25ml的容量瓶中，定容后搖勻備用。同時(shí)作試劑空白對(duì)照；3)測(cè)定委托具有國(guó)家計(jì)量認(rèn)證資質(zhì)的北京譜尼理化分析測(cè)試中心[(2000)量認(rèn)京字Z0407]進(jìn)行。
測(cè)定結(jié)果表明ZMM1啟動(dòng)子調(diào)控的RNAi水稻植株中莖、葉、穎殼和稻米中鎘的含量均有所降低，SRNAi-09株系與對(duì)照株系相比，莖、葉、穎殼和稻米中鎘的含量分別降低了58.3％、70％、86％和76％(圖12a，CK-01對(duì)照株系；SRNAi-09ZMM1啟動(dòng)子的RNAi株系)。但根中的含量沒(méi)有明顯降低，有些株系甚至有所升高，如SRNAi-09株系(圖12b)。
序列表<160>2<210>1<211>1422<212>DNA<213>稻屬水稻日本晴(Oryza sativa L.ssp.japonica)<400>1atggcgtcta aaccaagcag ccgagcggaa agcaaccagg cggcggcggc ggtgccgtcg 60ctgtacgggc gcgccctgcc gtcgccgccg gcggtggagt tcgcgtcggc ggaggggcgg 120cggctgttcg cggaggcgct ccaggggggc accatgcagg ggttctccag cctcgtctcc 180gtcttccaga cgcagtcgga gccggccttc tgcggcctcg ccacgctcgc cgtcgtcctc 240aacgcgctcc gcatcgaccc ggggcggcgg tggaagggcc cctggcagtg gttcgacgag 300tccatgctcg actgctgcga gcacctcgac acggtcaggg cggaggggat caccttcggc 360aaggtcgcct gcctcgccca ctgctccggc gccgacgtcc gcaccttccg cgccgcccag 420gccacgctcg ccgacctccg ccgccacctc ctgcgctgcg cctcctccca ggattgccat 480ctcgtcgcct cctaccaccg gaagcttctc ggccagactg gaacagggca tttctcgccg 540attggcggct accatgctgg gcaggacatg gcgctgatcc tggatgtcgc tcgcttcaaa 600taccctcctc attggattcc gctgccgctt ctttgggaag ccatgaacac gattgatgag 660gcaactgggc ttctcagggg gttcatgctt atctcaagga atactgaagc tcctttattg 720atccgtgcag tgagtaaatt aacatgccaa tgcttggtga atcaaatatt gaatcatctt 780cctcccaatg ctggaaattt tatcaaatgg gtcattgaag ttaggagaca agaggaagga 840ggatccagcc caagtaaaga ggctaacgaa atgcctttcc tgaaggaaaa ggtcctacag 900caaatccgtg atactaagct ttttcagctg gtccacaaac tgcaatgttc taagcagccc 960tgttgtagtt gctcgtcttt aacggacgaa gattccattt cccagattgc agccagtgtg1020tgctgtgaag caaccgcatt gctaagtggg aatctgtcat caagagatgg attatttttc1080agtgaaactt gttccggatg tacacaagtg aatgatgagg ggcttaaaaa tgtcattaca1140ggcaaagtgg tatctgaagg caatggacat gttgataagc tttcaccgat atcctcgact1200gaaacatgct tctgcaattc aactctgagc aatgaaactg tcaattatcc atcaaacaca1260gacattctaa ctgttctatt actgtcgtta catcctagca catggttgtg cattgaagat1320gagaagttga aagctgaatt tcagagcctt gtttctacgg acgatcttcc tgatcctctt1380aaactggagg tgtgctgtct cactcctaga accttgcatt ga 1422
<210>2<211>473<212>PRT<213>稻屬水稻日本晴(Oryza sativa L.ssp.japonica)<400>2Met Ala Ser Lys Pro Ser Ser Arg Ala Glu Ser Asn Gln Ala Ala Ala1 5 10 15Ala Val Pro Ser Leu Tyr Gly Arg Ala Leu Pro Ser Pro Pro Ala Val20 25 30Glu Phe Ala Ser Ala Glu Gly Arg Arg Leu Phe Ala Glu Ala Leu Gln35 40 45Gly Gly Thr Met Gln Gly Phe Ser Ser Leu Val Ser Val Phe Gln Thr50 55 60Gln Ser Glu Pro Ala Phe Cys Gly Leu Ala Thr Leu Ala Val Val Leu65 70 75 80Asn Ala Leu Arg Ile Asp Pro Gly Arg Arg Trp Lys Gly Pro Trp Gln85 90 95Trp Phe Asp Glu Ser Met Leu Asp Cys Cys Glu His Leu Asp Thr Val100 105 110Arg Ala Glu Gly Ile Thr Phe Gly Lys Val Ala Cys Leu Ala His Cys115 120 125Ser Gly Ala Asp Val Arg Thr Phe Arg Ala Ala Gln Ala Thr Leu Ala130 135 140Asp Leu Arg Arg His Leu Leu Arg Cys Ala Ser Ser Gln Asp Cys His145 150 155 160Leu Val Ala Ser Tyr His Arg Lys Leu Leu Gly Gln Thr Gly Thr Gly165 170 175His Phe Ser Pro Ile Gly Gly Tyr His Ala Gly Gln Asp Met Ala Leu180 185 190Ile Leu Asp Val Ala Arg Phe Lys Tyr Pro Pro His Trp Ile Pro Leu195 200 205Pro Leu Leu Trp Glu Ala Met Asn Thr Ile Asp Glu Ala Thr Gly Leu210 215 220Leu Arg Gly Phe Met Leu Ile Ser Arg Asn Thr Glu Ala Pro Leu Leu
225 230 235 240Ile Arg Ala Val Ser Lys Leu Thr Cys Gln Cys Leu Val Asn Gln Ile245 250 255Leu Asn His Leu Pro Pro Asn Ala Gly Asn Phe Ile Lys Trp Val Ile260 265 270Glu Val Arg Arg Gln Glu Glu Gly Gly Ser Ser Pro Ser Lys Glu Ala275 280 285Asn Glu Met Pro Phe Leu Lys Glu Lys Val Leu Gln Gln Ile Arg Asp290 295 300Thr Lys Leu Phe Gln Leu Val His Lys Leu Gln Cys Ser Lys Gln Pro305 310 315 320Cys Cys Ser Cys Ser Ser Leu Thr Asp Glu Asp Ser Ile Ser Gln Ile325 330 335la Ala Ser Val Cys Cys Glu Ala Thr Ala Leu Leu Ser Gly Asn Leu340 345 350Ser Ser Arg Asp Gly Leu Phe Phe Ser Glu Thr Cys Ser Gly Cys Thr355 360 365Gln Val Asn Asp Glu Gly Leu Lys Asn Val Ile Thr Gly Lys Val Val370 375 380Ser Glu Gly Asn Gly His Val Asp Lys Leu Ser Pro Ile Ser Ser Thr385 390 395 400Glu Thr Cys Phe Cys Asn Ser Thr Leu Ser Asn Glu Thr Val Asn Tyr405 410 415Pro Ser Asn Thr Asp Ile Leu Thr Val Leu Leu Leu Ser Leu His Pro420 425 430Ser Thr Trp Leu Cys Ile Glu Asp Glu Lys Leu Lys Ala Glu Phe Gln435 440 445Ser Leu Val Ser Thr Asp Asp Leu Pro Asp Pro Leu Lys Leu Glu Val450 455 460Cys Cys Leu Thr Pro Arg Thr Leu His465 470
權(quán)利要求
1.一種培育低重金屬積累植物的方法，包括以下步驟1)構(gòu)建含有“植物重金屬吸收相關(guān)基因cDNA-內(nèi)含子-植物重金屬吸收相關(guān)基因cDNA”結(jié)構(gòu)的RNAi表達(dá)載體；2)將步驟1)的RNAi表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物，獲得低重金屬積累植物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述RNAi表達(dá)載體的啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述植物重金屬吸收相關(guān)基因?yàn)橹参锝j(luò)合素基因、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因和金屬硫蛋白基因；所述內(nèi)含子的大小為300-700bp。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述重金屬為Cd、Cu、As或Pb。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述植物為水稻、玉米或小麥。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述植物為水稻；所述植物絡(luò)合素基因?yàn)樗窘j(luò)合素基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述水稻絡(luò)合素基因?yàn)榫哂行蛄斜碇行蛄?的核苷酸序列或?yàn)樾蛄?的自5’端第4-434位堿基共431bp的核苷酸片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述啟動(dòng)子為Ubiquitin啟動(dòng)子或ZMM1啟動(dòng)子。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于用于構(gòu)建所述RNAi表達(dá)載體的出發(fā)載體為pTCK303、pCAMBIA1301或pBI121。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述RNAi表達(dá)載體為pUbi-RNAi-OsPCS1或pZMM1-RNAi-OsPCS1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培育低重金屬積累植物的方法。該方法包括以下步驟1)構(gòu)建含有“植物重金屬吸收相關(guān)基因cDNA－內(nèi)含子－植物重金屬吸收相關(guān)基因cDNA”結(jié)構(gòu)的RNAi表達(dá)載體；2)將步驟1)的RNAi表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物，獲得低重金屬積累植物。本發(fā)明的方法具有廣泛的適用性，可實(shí)現(xiàn)在重金屬污染的土地上生產(chǎn)的糧食既耐受重金屬離子而又在食用部分(種子)不積累或低積累重金屬，以獲得新型優(yōu)質(zhì)的安全作物品種。
文檔編號(hào)A01G7/00GK1784946SQ200410096858
公開日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2004年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月8日
發(fā)明者麻密, 李江川, 郭江波, 徐文忠, 何振艷 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院植物研究所