專利名稱：角膜中期保存液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種眼科醫(yī)用制品的改進，具體講是一種角膜中期保存液。其屬于化學組合物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)有技術(shù)的角膜活性保存方法中有傳統(tǒng)的濕房保存法，該法簡單易行，缺點是角膜保存時間太短(僅2天)。有專利文獻CN1262866A公開了一種角膜活性保存液，其包括，MEM細胞培養(yǎng)基，硫酸軟骨素，低分子右旋糖酐，地塞米松，抗生素和HEEPES液。該保存液雖具有較好的保存效果，但有的組分可能因硫酸軟骨素含量較高，使保存液中帶負電荷，強電量的負電荷對角膜內(nèi)皮細胞是有害的。還有一種含透明質(zhì)酸的角膜保存液，其專利號為ZL97193593.9。該專利角膜保存液，主要成分是透明質(zhì)酸，其成分單一，在角膜內(nèi)皮細胞保存15天中代表角膜活性的乳酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、葡萄糖脫-6-磷酸脫氫酶的活性水平下降，而且較長時間的保存會引起角膜植片水腫，使角膜內(nèi)皮的有效活性密度下降，致使手術(shù)操作困難，也使術(shù)后易出現(xiàn)植片內(nèi)皮功能失代償。目前臨床常用的是美國CHIRON公司生產(chǎn)的Optisol保存角膜內(nèi)皮細胞活性較好的保存液。該保存液主要配方是Tc-199，MEM，HEPES，慶大霉素，硫酸軟骨素和Dextron，其中有的原料價格昂貴，進口角膜保存液20ml/50美元(每瓶)，僅用于保存一個供體角膜。因此我國迫切需要一種具有較好的保存效果，同時具有我國獨立知識產(chǎn)權(quán)并在經(jīng)濟上適合國情的角膜中期保存液。
以上這些角膜保存液還存在的共同問題，就是只考慮到角膜植片內(nèi)皮細胞的活性，未涉及角膜上皮細胞的存活情況。一般來講，保存于上述角膜保存液中的角膜植片上皮細胞存活時間為4～6天，超過7天上皮細胞均發(fā)生脫落。雖然角膜植片上皮細胞層不如內(nèi)皮細胞層重要，一旦角膜植片上皮細胞發(fā)生脫落，角膜植片極可能發(fā)生水腫，不但影響角膜內(nèi)皮細胞層的保存質(zhì)量，同時會影響角膜移植手術(shù)的效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的就是為了解決上述問題，從而提供一種既經(jīng)濟、保存效果又好的角膜中期保存液的技術(shù)方案。
本發(fā)明目的是通過如下技術(shù)措施實現(xiàn)的，研制了一種角膜中期保存液，其是以1000ml計的保存液中含有RPMI1640培養(yǎng)液4.2-6.2g，硫酸軟骨素15-35mg，透明質(zhì)酸5-25mg，HEPES緩沖液3.76-5.76g，地塞米松5-50mg。還含有低分子量海藻多糖10-30mg，妥布霉素或萬古霉素10-150mg；該保存液為淡橘紅色、透明輕度粘稠液體，其PH值為7.0-7.6，滲透壓300-400mOsm/KgH2O，在2-6℃保存。
所述的保存液中還加入MEM培養(yǎng)基3.7-5.7g。
所述的保存液中還加入氫化可的松0.1-5mg/mL。
所述的保存液中的萬古霉素，還與妥布霉素聯(lián)合應(yīng)用，其中萬古霉素10-80mg，妥布霉素25-50mg。
所述的保存液加入的妥布霉素的規(guī)格為25-50萬單位。
所述的低分子量海藻多糖，其分子量為25000-100000Da，其包括卡拉膠，綠藻中的石莼多糖，褐藻中的褐藻多糖硫酸酯，其濃度為2-20mg/mL。
所述的保存液還可加入L-谷氨酰胺0.175-0.575mg/mL，在配制時加入或使用時加入。
本發(fā)明的優(yōu)點在于由于采用RPMI1640培養(yǎng)液4.2-6.2g，硫酸軟骨素15-35mg，透明質(zhì)酸5-25mg，HEPES緩沖液3.76-5.76g，地塞米松5-50mg，低分子量海藻多糖10-30mg和妥布霉素或萬古霉素10-150mg作為本發(fā)明角膜中期保存液的重要配方。其成份相對簡單，由于硫酸軟骨素、低分子量的海藻多糖和透明質(zhì)酸的協(xié)同作用，可以減少硫酸軟骨素的用量，從而減少角膜中期保存液中負電荷的量，使供體角膜在保存期間不致于水腫增厚。在保存期間離體的角膜發(fā)生水腫增厚的機理是由于Na+-K+-ATP酶功能下降，改變了角膜的水合作用，導致角膜內(nèi)皮細胞功能下降，使角膜基質(zhì)中的內(nèi)源性葡萄糖的含量減少，角膜基質(zhì)的水腫增加。在4℃條件下保存角膜時，內(nèi)皮細胞功能明顯下降，不能對抗角膜基質(zhì)中存在的聚氨基多糖形成的吸水負壓，若在角膜周圍環(huán)境中不存在一定的膠體滲透壓，必然會引起角膜水腫。而且水腫的角膜組織可引起更多的組織內(nèi)成分如聚氨基葡萄糖的降低。所以針對上述角膜離體保存期間增厚的機理，本發(fā)明的角膜中期保存液中利用具有與水形成粘稠凝膠，有潤滑和保護細胞作用的透明質(zhì)酸，具有增加并維持膠體滲透壓作用的低分子量的海藻多糖和具有滲透脫水作用的硫酸軟骨素，三者的協(xié)同組合作用，而且這種協(xié)同組合作用作為一種抗氧化劑防止細胞膜脂類的過氧化反應(yīng)。尤以加入的海藻多糖，能夠延長保存液中角膜植片上皮的存活時間，防止因上皮脫落引起的角膜植片水腫的發(fā)生。本發(fā)明的角膜中期保存液中充分利用硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、海藻多糖三者的協(xié)同組合而產(chǎn)生一定的膠體滲透壓，以維持細胞膜的穩(wěn)定性，減輕內(nèi)皮細胞的自溶。因此，這種協(xié)同組合作用可明顯提高本發(fā)明的角膜中期保存液的膠體滲透壓，形成內(nèi)皮細胞的特殊基質(zhì)，維持其特定的生化環(huán)境，有利于維持理想的角膜厚度，提高角膜內(nèi)皮細胞活性的保存效果。
實驗證明，本發(fā)明的角膜存活保存液確實具有提高角膜內(nèi)皮細胞活性和延長角膜上皮脫落時間的保存效果，在保存期間和手術(shù)中可維持近乎生理的角膜厚度。再配合加入地塞米松和/或氫化可的松，其可以穩(wěn)定細胞的溶酶體膜及其他生物膜，增強細胞對毒素和損害的抵御能力，更好地保持內(nèi)皮細胞的形態(tài)和功能。本發(fā)明在保存液應(yīng)用前加入L-谷氨酰胺，可減少角膜上皮和內(nèi)皮細胞的氧化損害，補充上皮和內(nèi)皮細胞代償?shù)谋匦璋被?，延長上皮的脫落時間和保存內(nèi)皮的活性改變。本發(fā)明的角膜中期保存液中加入有效的萬古霉素或萬古霉素與妥布霉素聯(lián)合應(yīng)用，可以防止供體攜帶的病原菌或保存液制作過程中的操作污染引起的微生物感染。
本發(fā)明可使角膜活性的保存時間達2周以上，存放期間內(nèi)皮細胞活性穩(wěn)定、變化小，在角膜植片內(nèi)皮細胞的保存方面可與美國CHIRON公司生產(chǎn)的Optisol相媲美，而且在上皮細胞的保存時間方面優(yōu)于Optisol。酶組織化學檢查顯示隨保存時間的延長，本發(fā)明的角膜存活保存液可比美國CHIRON公司生產(chǎn)的Opthiol維持更高的內(nèi)皮細胞代謝功能。經(jīng)臨床應(yīng)用，角膜保存7天以上后再使用，術(shù)后1-4周植片內(nèi)皮細胞數(shù)均超過2000個/mm2。本發(fā)明的角膜中期保存液所需原料易得，價格低廉，經(jīng)濟性好，適合國內(nèi)中期保存法，可成為當前我國眼庫中一種理想的中期角膜保存液，填補國內(nèi)空白。
具體實施例方式
為能清楚地說明本發(fā)明角膜中期保存液的技術(shù)方案，現(xiàn)通過具體實施例表，對其進行詳細闡述。本發(fā)明的實施例見表1。
表1角膜中期保存液的配方 本發(fā)明的角膜中期保存液用于貓角膜上皮脫落時間的研究分別將保存于各液5天、7天、15天的貓角膜各10只，進行穿透性角膜移植，觀察術(shù)后不同時間角膜植片上皮的存活情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Optisol保存液中上皮細胞的存活時間維持在4～6天。而在本發(fā)明的角膜保存液中保存的角膜植片上皮細胞存活時間超過7天，最長可達到10天。
本發(fā)明的角膜中期保存液應(yīng)用于兔角膜內(nèi)皮活性試驗在125只兔角膜中各取25只，分到保存于本發(fā)明的4個配方和Optisol各10ml保存液中，冰箱4℃保存，保存時間分別是5天、7天、10天、15天和20天。每次各取5只，行0.25％錐蘭加1％茜素紅聯(lián)合染色，用雙目顯微鏡觀察內(nèi)皮細胞活性密度和活性率，結(jié)果見表1。由表1看出，本發(fā)現(xiàn)四個配方均具有較好的角膜內(nèi)皮細胞活性保存效果，與Optisol相接近。但對角膜上皮細胞的保存時間明顯比Optisol長。同時還看出本發(fā)現(xiàn)的角膜內(nèi)皮細胞活性率隨時間的變化較小，性質(zhì)穩(wěn)定，存放20天的活性率達90.5％以上。
本發(fā)明的角膜中期保存液應(yīng)用于兔角膜內(nèi)皮細胞酶組織化學染色在行錐蘭染色前，取保存于各液7天、15天的兔角膜各4只，切片，另取正常兔角膜4只切片作對照組，行酶組織化學染色，即測瓊脂酸脫氫酶、乳酸脫氫酶和葡萄糖-6一磷酸脫氧酶三種酶，測每種酶時，從每只角膜各取切片4張，同一種孵育液孵育。三種酶染色均呈現(xiàn)反應(yīng)。每種酶的透光密度值(OPTDM值)與酶的活性呈反比。由表2可看出，隨保存時間的延長，本發(fā)明可較Optisol維持更高的內(nèi)皮細胞代謝功能。
本發(fā)明的角膜中期保存液臨床應(yīng)用于對人角膜進行保存的實驗
先后對67位角膜病患者(均為單眼發(fā)病}進行角膜移植術(shù)，使用67只人角膜，保存于本發(fā)明和美國CHIRON公司生產(chǎn)的Optisol中的角膜分別為37只和30只，其中有2只因全角膜移植，沒有剩余邊緣角膜進行內(nèi)皮染色觀察。
臨床觀察結(jié)果可看出，對保存于本發(fā)現(xiàn)保存液中的37只角膜平均保存6.5天，均獲透明愈合效果，其植片內(nèi)皮細胞活性率均在90％以上，對術(shù)后1-4周內(nèi)皮細胞進行了檢查，植片內(nèi)皮細胞數(shù)平均達2204.56個/mm2。
本發(fā)明保存的角膜移植術(shù)后1-4周內(nèi)，植片內(nèi)皮細胞數(shù)全在1500個/mm2以上。
表2兔角膜內(nèi)皮細胞保存活性率比較(％)

注本發(fā)明的角膜中期保存液實例配方4未加入海藻多糖，所以加入的硫酸軟骨素及透明質(zhì)酸的量相對較多，可能導致角膜保存液中的負電荷含量增加，影響了角膜內(nèi)皮細胞的活性。由于海藻多糖的缺乏，角膜植片上皮的存活時間縮短，并因上皮脫落導致角膜植片水腫發(fā)生。實例配方4與美國CHIRON公司生產(chǎn)的Optisol相比，不同時間的角膜內(nèi)皮細胞保存活性率均有所降低。
本發(fā)明的角膜中期保存液實例配方8和實例配方9中均未加入地塞米松或氫化可的松，導致角膜細胞的溶酶體膜及其他生物膜穩(wěn)定性降低，對毒素和損害的抵御能力下降。實例配方8和實例配方9與美國CHIRON公司生產(chǎn)的Optisol相比，各時間的角膜內(nèi)皮細胞保存活性率均有所降低。
本發(fā)明的角膜中期保存液實例配方12和實例配方13中均未加入L-谷氨酰胺，與美國CHIRON公司生產(chǎn)的Optisol相比，雖然各時間的角膜內(nèi)皮細胞保存活性率沒有明顯改變，但是角膜植片上皮脫落的時間縮短，可能與L-谷氨酰胺的缺乏導致角膜上皮細胞的氧化損害有關(guān)。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會理解，在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)，對于上述實施例進行修改，添加和替換都是可能的，其都沒有超出本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種角膜中期保存液，其是以1000ml計的保存液中含有RPMI1640培養(yǎng)液4.2——6.2g，硫酸軟骨素15——35mg，透明質(zhì)酸5——25mg，HEPES緩沖液3.76-5.76g，地塞米松5——50mg，其特征在于還含有低分子量海藻多糖10——30mg，妥布霉素或萬古霉素10-150mg；該保存液為淡橘紅色、透明輕度粘稠液體，其PH值為7.0——7.6，滲透壓300-400mOsm/KgH2O，在2——6℃保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述角膜中期保存液，其特征在于所述的保存液中還加入MEM培養(yǎng)基3.7-5.7g。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述角膜中期保存液，其特征在于所述的保存液中還加入氫化可的松0.1-5mg/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述角膜中期保存液，其特征在于所述的保存液中的萬古霉素，還與妥布霉素聯(lián)合應(yīng)用，其中萬古霉素10——80mg，妥布霉素25——50mg。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述角膜中期保存液，其特征在于所述的保存液加入的妥布霉素的規(guī)格為25-50萬單位。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述角膜中期保存液，其特征在于所述的低分子量海藻多糖，其分子量為25000-100000Da，其包括卡拉膠，綠藻中的石莼多糖，褐藻中的褐藻多糖硫酸酯，其濃度為2-20mg/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述角膜中期保存液，其特征在于所述的保存液還可加入L-谷氨酰胺0.175-0.575mg/mL，在配制時加入或使用時加入。
全文摘要
本發(fā)明是角膜中期保存液有RPMI1640培養(yǎng)液，硫酸軟骨素，透明質(zhì)酸，HEPES緩沖液，地塞米松，低分子量海藻多糖，妥布霉素或萬古霉素組成；該保存液為淡橘紅色、透明輕度粘稠液體。該液可使角膜活性的保存達2周以上，存放期間內(nèi)皮細胞活性穩(wěn)定、變化小，在角膜植片內(nèi)皮細胞的保存方面可與美國的Optisol相媲美，上皮細胞的保存時間長。酶組織化學檢查顯示隨保存時間的延長，比美國的Opthiol維持更高的內(nèi)皮細胞代謝功能。經(jīng)臨床應(yīng)用，角膜保存7天以上后再使用，術(shù)后1－4周植片內(nèi)皮細胞數(shù)均超過2000個/mm
文檔編號A01N1/02GK1631138SQ20041009100
公開日2005年6月29日 申請日期2004年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月15日
發(fā)明者董曉光, 謝立信, 史偉云 申請人:山東省眼科研究所