專利名稱：非洲蟛蜞菊的繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物組織培養(yǎng)方法，具體地講，是指一種采用組織培養(yǎng)技術(shù)對非洲蟛蜞菊離體培養(yǎng)進(jìn)行快速繁殖的方法。
背景技術(shù)：
植物組織培養(yǎng)是指用植物的任何器官、組織或細(xì)胞，在人工控制條件下進(jìn)行無菌培養(yǎng)生長發(fā)育的過程。該技術(shù)取材少，培養(yǎng)植物材料成本低，生長周期短，管理方便。利用植物組織培養(yǎng)這種快速繁殖技術(shù)，能在短時(shí)間內(nèi)繁衍出大量保持母本生物特性和遺傳性狀的植株。據(jù)了解，我國快速繁殖的植物已有近千種。通常使用的基本培養(yǎng)基有數(shù)種，如MS、B5、White、N6等。在組織培養(yǎng)中，植物外植體要在植物生長物質(zhì)的作用下，經(jīng)過誘導(dǎo)脫分化、恢復(fù)細(xì)胞分裂的能力、影響再分化、促進(jìn)器官形成等過程。植物外植體繁殖系數(shù)的大小，直接影響著生產(chǎn)后代植株的數(shù)量和質(zhì)量。
非洲蟛蜞菊(Wedelia prostrata)，又名單花蟛蜞菊，別名貓舌菊、天蓬草舅、地錦花、鹵地菊，是菊科的蟛蜞菊屬多年生草本。廣布于泛熱帶到暖帶海岸，臺(tái)灣、華南、東南亞、日本一帶均有生長。非洲蟛蜞菊可做花壇、護(hù)坡地被，是優(yōu)良的海岸定沙植物；葉可藥用；是中小型蝴蝶的蜜源。非洲蟛蜞菊的繁殖主要靠扦插繁殖，但自然繁殖存在著繁殖系數(shù)低，受季節(jié)限制等問題。通過組織培養(yǎng)可以達(dá)到短時(shí)間內(nèi)快速繁殖的目的，提高產(chǎn)量，并且可以克服季節(jié)對繁殖的影響。用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行規(guī)?；⒎敝常谦@得大量優(yōu)質(zhì)種苗的有效途徑。針對這樣的情況我們旨在利用組織培養(yǎng)方法，通過無性繁殖手段來提高非洲蟛蜞菊的繁殖率，為其周年生產(chǎn)提供技術(shù)方案。有關(guān)非洲蟛蜞菊無性繁殖幼苗的組織培養(yǎng)方法在國內(nèi)尚未有人報(bào)道，國際上也未見報(bào)道。
植物組織培養(yǎng)的基本過程為利用植物體離體的器官、組織或細(xì)胞，(如根、莖、葉、花、果實(shí)、種子、胚、胚珠、子房、花藥、花粉以及貯藏器官的薄壁組織、維管束組織等)在無菌和適宜的人工培養(yǎng)基及光照、溫度等條件下，誘導(dǎo)出愈傷組織再分化形成不定芽，或者直接由植物離體組織或器官直接分化出叢生芽，然后誘導(dǎo)生根，最后形成完整的植株。再生植株經(jīng)煉苗后移栽，最終形成商品植株。
(三)發(fā)明的內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種非洲蟛蜞菊的繁殖方法，它能夠明顯提高非洲蟛蜞菊的無性繁殖系數(shù)，繁殖速度快而且操作簡便。
具體地講，本發(fā)明方法包括如下步驟(1)外植體消毒將非洲蟛蜞菊頂芽或側(cè)芽置于65-75％乙醇中浸泡20-60s(表示“秒”，下同)，0.1％升汞中滅菌4-12min(表示“分鐘”，下同)，再用無菌水沖洗3-6次；(2)無菌苗的獲得將消毒后的非洲蟛蜞菊頂芽或側(cè)芽接種到MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)15～30天獲得無菌苗，培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，光照強(qiáng)度1500Lux，光照時(shí)間12h·d-1(表示“小時(shí)/天”，下同)；(3)誘導(dǎo)叢生芽發(fā)生將無菌苗的莖尖或莖段置于配方為MS+0.5-5mg/L 6-芐基氨基嘌呤(簡稱6-BA)+0-0.5mg/L萘乙酸(簡稱NAA)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)15～35天獲得叢生芽(高度一般為1～2cm)，培養(yǎng)條件同步驟(2)；(4)誘導(dǎo)生根將步驟(3)所得到的叢生芽分切成單株，在1/2MS+0-5mg/L吲哚丁酸(簡稱IBA)或NAA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～20天得到再生植株，培養(yǎng)條件同步驟(2)。
(5)再生植株移栽將步驟(4)獲得的再生植株經(jīng)煉苗后，移栽入蛭石土或者花卉土中，用自來水或者1/4MS培養(yǎng)液澆灌。
上述方法中，在步驟(3)中，培養(yǎng)基的優(yōu)選方案是MS+1-5.0mg/L6-BA+0.1-0.5mg/L NAA，最好是MS+2.0mg/L 6BA+0.5mg/LNAA。步驟(4)中培養(yǎng)基的優(yōu)選配方是采用1/2MS+0.5-1mg/L IBA或NAA配方，其中IBA或NAA的濃度最好是1.0mg/L。
本發(fā)明具有如下的優(yōu)點(diǎn)和效果1.經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明方法步驟(3)中不定芽的誘導(dǎo)率最高可達(dá)100％，每個(gè)外植體都可以分化出多個(gè)不定芽，其中以2.0mg/L6BA+0.5mg/L NAA的培養(yǎng)基中的不定芽最多，每個(gè)外植體有8～10個(gè)芽，在步驟(4)中，采用IBA、NAA進(jìn)行誘導(dǎo)，生根率100％，而且長勢良好，保證了試管苗不定根質(zhì)量。與現(xiàn)有的繁殖技術(shù)相比，該方法繁殖效率高，周年可以大量生產(chǎn)，克服了現(xiàn)有技術(shù)受季節(jié)對繁殖的影響。
2.本發(fā)明方法無需專有設(shè)備，操作簡便。
(四)具體的實(shí)施方式實(shí)施例1(1)外植體的消毒取非洲蟛蜞菊頂芽或側(cè)芽置于70％乙醇中浸泡30s，0.1％升汞中滅菌6min，再用無菌水沖洗5次；(2)無菌苗的獲得將已消毒的非洲蟛蜞菊外植體接種到MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)15天，獲取無菌苗，培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，光照強(qiáng)度1500Lux，光照時(shí)間12h·d-1(表示“小時(shí)/天”，下同)；(3)芽的分化一個(gè)月后接種到附加有0.5mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)15天，不定芽分化率為87.5％，能分化的每個(gè)外植體有1～2個(gè)不定芽，培養(yǎng)35天，不定芽分化率為100％，能分化的每個(gè)外植體有2個(gè)不定芽。
(4)根的形成形成的小苗，轉(zhuǎn)接入附加1.0mg/L IBA的1/2MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5天時(shí)，生根率為100％，且每個(gè)外植體均有10～11條誘導(dǎo)根，誘導(dǎo)根成放射狀，培養(yǎng)10天后，每個(gè)外植體的誘導(dǎo)根增至15～16條，培養(yǎng)20天后，誘導(dǎo)根生長變長，爬滿瓶底。苗的生長狀況良好。
(5)試管苗移栽在誘導(dǎo)根實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)20天后，將試管苗煉苗后轉(zhuǎn)入蛭石土，以1/4MS培養(yǎng)液澆灌，15天后苗生長良好，成活率100％。
實(shí)施例2其它操作同實(shí)施例1，所不同的是步驟(1)中，取非洲蟛蜞菊頂芽或側(cè)芽置于65％乙醇中浸泡20s，0.1％升汞中滅菌4min，再用無菌水沖洗6次；步驟(2)中，培養(yǎng)時(shí)間為20天；步驟(3)中，培養(yǎng)基配方為MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA，培養(yǎng)時(shí)間為15天，不定芽分化率為100％，每個(gè)外植體有2～3個(gè)分化芽，培養(yǎng)35天時(shí)，每個(gè)外植體平均有3個(gè)分化芽；步驟(4)中，培養(yǎng)基改為1/2MS+1.0mg/L NAA，培養(yǎng)5天時(shí)，生根率也為100％，每個(gè)外植體的誘導(dǎo)根為8～9條，誘導(dǎo)根成放射狀生出，且增長狀況較好，培養(yǎng)10天后，每個(gè)外植體的誘導(dǎo)根增至13～14條，培養(yǎng)20天后，誘導(dǎo)根生長變長，爬滿瓶底，苗的生長狀況良好；步驟(5)中，蛭石土改為花卉土，以自來水澆灌，15天后，苗生長良好，成活率為100％。
實(shí)施例3其它操作同實(shí)施例1，所不同的是步驟(1)中，取非洲蟛蜞菊頂芽或側(cè)芽置于75％乙醇中浸泡60s，0.1％升汞中滅菌12min，再用無菌水沖洗3次；步驟(2)中，培養(yǎng)時(shí)間為30天；步驟(3)中，培養(yǎng)基配方為MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA，培養(yǎng)時(shí)間為15天時(shí)，不定芽分化率為75％，能分化的每個(gè)外植體有2～3個(gè)分化芽，培養(yǎng)時(shí)間為35天時(shí)，不定芽分化率為100％，每個(gè)外植體有3～5個(gè)分化芽；步驟(4)中，培養(yǎng)基改為1/2MS+0.5mg/L NAA，培養(yǎng)5天時(shí)，誘導(dǎo)根成放射狀生出，生根率也為100％，每個(gè)外植體的誘導(dǎo)根為7～8條，培養(yǎng)10天后每個(gè)外植體的誘導(dǎo)根增至9～10條，培養(yǎng)20天后，誘導(dǎo)根生長變長，爬滿瓶底。苗的生長狀況良好。
實(shí)施例4其它操作同實(shí)施例1，所不同的是步驟(3)中，培養(yǎng)基配方為MS+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA，培養(yǎng)時(shí)間為15天時(shí)，不定芽分化率為66.7％，能分化的每個(gè)外植體有1～2個(gè)分化芽，培養(yǎng)時(shí)間為35天，不定芽分化率為100％，每個(gè)外植體有3～5個(gè)分化芽，且部分外植體會(huì)有根生成；步驟(4)中，培養(yǎng)基改為1/2MS+0.5mg/L IBA，培養(yǎng)5天時(shí)，根成放射狀生出，生根率也為100％，每個(gè)外植體的誘導(dǎo)根為9～10條，且增長狀況較好，培養(yǎng)10天后每個(gè)外植體的誘導(dǎo)根增至13～14條，培養(yǎng)20天后，根長長，布滿瓶底。苗的生長狀況良好。
實(shí)施例5其它操作同實(shí)施例2，所不同的是步驟(3)中，培養(yǎng)基配方為MS+1mg/L 6-BA，培養(yǎng)時(shí)間為20天，不定芽分化率為100％，每個(gè)外植體有3～4個(gè)分化芽；步驟(4)中，培養(yǎng)基改為1/2MS，5天時(shí)，生根率為75％，每個(gè)外植體的誘導(dǎo)根為2條，10天后生根率為95.8％，每個(gè)外植體的誘導(dǎo)根為2～3條，培養(yǎng)20天后，生根率為100％，每個(gè)外植體的誘導(dǎo)根為2～3條，誘導(dǎo)根生長變長。苗的生長狀況良好。
實(shí)施例6其它操作同實(shí)施例2，所不同的是步驟(3)中，培養(yǎng)基配方為MS+1mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA，培養(yǎng)時(shí)間為20天時(shí)，不定芽分化率為100％，每個(gè)外植體有4～5個(gè)分化芽，培養(yǎng)時(shí)間為30天時(shí)，每個(gè)外植體的分化芽增至6～8個(gè)；步驟(4)中，培養(yǎng)基改為1/2MS+2mg/L NAA，培養(yǎng)5天后，外植體長出根點(diǎn)，尚無明顯生根，底部有愈傷，苗生長良好，培養(yǎng)8天后，根開始成形，生長密集，每個(gè)外植體有誘導(dǎo)根9～10個(gè)，根較為短，只有1～2mm，生根率為100％，培養(yǎng)15天后，每個(gè)外植體有19～20條根，根增長，但最長只有1cm左右。苗長高，長勢良好。
實(shí)施例7其它操作同實(shí)施例2，所不同的是步驟(3)中，培養(yǎng)基配方為MS+1mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA，培養(yǎng)時(shí)間為20天時(shí)，不定芽分化率為100％，每個(gè)外植體有3～5個(gè)分化芽，培養(yǎng)時(shí)間為30天時(shí)，每個(gè)外植體的分化芽增至8～9個(gè)；步驟(4)中，培養(yǎng)基改為1/2MS+5mg/L NAA，培養(yǎng)5天后，外植體底部有愈傷，根點(diǎn)不明顯，培養(yǎng)10天后，底部形成愈傷大，愈傷上都有根長出，底部的根點(diǎn)密集，培養(yǎng)15天后，每個(gè)外植體有19～20條根，生根率為100％，根增長，但是大部分僅為2～3mm，最長為2cm。苗長高，長勢良好。
實(shí)施例8其它操作同實(shí)施例2，所不同的是步驟(3)中，培養(yǎng)基配方為MS+1mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA，培養(yǎng)時(shí)間為20天，不定芽分化率為100％，每個(gè)外植體有3～4個(gè)分化芽，培養(yǎng)時(shí)間為30天時(shí)，每個(gè)外植體的不定芽增至6～9個(gè)；步驟(4)中，培養(yǎng)基改為1/2MS+2mg/L IBA，培養(yǎng)5天后，外植體底部有愈傷，長出根點(diǎn)，尚無明顯生根，苗生長良好，培養(yǎng)8天后，根生長密集，每個(gè)外植體有誘導(dǎo)根14～15個(gè)，但是根較為短，只有1～2mm，生根率為100％，培養(yǎng)15天后，每個(gè)外植體有22～23條根，根增長，但平均只有1cm左右。苗長高，長勢良好。
實(shí)施例9
其它操作同實(shí)施例1，所不同的是步驟(3)中，培養(yǎng)基配方為MS+2mg/L 6-BA，培養(yǎng)時(shí)間為20天，不定芽分化率為100％，每個(gè)外植體有3～5個(gè)分化芽；步驟(4)中，培養(yǎng)基改為1/2MS+5mg/L IBA，培養(yǎng)5天后，外植體底部有愈傷，根點(diǎn)不明顯，培養(yǎng)10天后，底部形成愈傷大，愈傷上都有根長出，底部的根點(diǎn)密集，培養(yǎng)15天后，每個(gè)外植體有17～18條根，生根率為100％，根增長，但是平均只有4～5mm，苗長高，長勢良好。
實(shí)施例10其它操作同實(shí)施例1，所不同的是步驟(3)中，培養(yǎng)基配方為MS+2mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA，培養(yǎng)時(shí)間為20天，不定芽分化率為100％，每個(gè)外植體有3～4個(gè)分化芽，培養(yǎng)時(shí)間為30天時(shí)，每個(gè)外植體的不定芽增至5～7個(gè)。
實(shí)施例11其它操作同實(shí)施例1，所不同的是步驟(3)中，培養(yǎng)基配方為MS+2mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA，培養(yǎng)時(shí)間為20天，不定芽分化率為100％，每個(gè)外植體有4～5個(gè)分化芽，培養(yǎng)時(shí)間為30天時(shí)，每個(gè)外植體的不定芽增至5～8個(gè)。
實(shí)施例12其它操作同實(shí)施例1，所不同的是步驟(3)中，培養(yǎng)基配方為MS+2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA，培養(yǎng)時(shí)間為20天，不定芽分化率為100％，每個(gè)外植體有4～6個(gè)分化芽，培養(yǎng)時(shí)間為30天時(shí)，每個(gè)外植體的不定芽增至8～10個(gè)。
實(shí)施例13其它操作同實(shí)施例2，所不同的是步驟(3)中，培養(yǎng)基配方為MS+5mg/L 6-BA，培養(yǎng)時(shí)間為20天，不定芽分化率為30％，能分化的每個(gè)外植體有1～2個(gè)分化芽，培養(yǎng)時(shí)間為30天時(shí)，不定芽分化率為50％，每個(gè)外植體的分化芽增至2個(gè)。
實(shí)施例14
其它操作同實(shí)施例2，所不同的是步驟(3)中，培養(yǎng)基配方為MS+5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA，培養(yǎng)時(shí)間為20天，不定芽分化率為100％，每個(gè)外植體有3～5個(gè)分化芽，培養(yǎng)時(shí)間為30天時(shí)，每個(gè)外植體的不定芽增至5～6個(gè)，培養(yǎng)時(shí)間為35天時(shí)，每個(gè)外植體的不定芽增至7～8個(gè)。分化芽顏色較淺。
實(shí)施例15其它操作同實(shí)施例2，所不同的是步驟(3)中，培養(yǎng)基配方為MS+5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA，培養(yǎng)時(shí)間為20天，不定芽分化率為100％，每個(gè)外植體有3～5個(gè)分化芽，培養(yǎng)時(shí)間為30天時(shí)，每個(gè)外植體的不定芽增至5～8個(gè)，培養(yǎng)時(shí)間為35天時(shí)，每個(gè)外植體的不定芽為5～9個(gè)。分化芽顏色較淺。
實(shí)施例16其它操作同實(shí)施例2，所不同的是步驟(3)中，培養(yǎng)基配方為MS+5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA，培養(yǎng)時(shí)間為20天，不定芽分化率為100％，每個(gè)外植體有3～5個(gè)分化芽，培養(yǎng)時(shí)間為30天時(shí)，每個(gè)外植體的不定芽增至5～8個(gè)，培養(yǎng)時(shí)間為35天時(shí)，每個(gè)外植體的不定芽為5～9個(gè)。分化芽顏色較淺。
實(shí)施例17其它操作同實(shí)施例2，所不同的是步驟(3)中，培養(yǎng)基配方為MS+5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA，培養(yǎng)時(shí)間為20天，不定芽分化率為100％，每個(gè)外植體有4～6個(gè)分化芽，培養(yǎng)時(shí)間為30天時(shí)，每個(gè)外植體的不定芽增至7～9個(gè)，培養(yǎng)時(shí)間為35天時(shí)，每個(gè)外植體的不定芽為8～10個(gè)。分化芽顏色較淺。
權(quán)利要求
1.一種非洲蟛蜞菊的繁殖方法，其特征在于包括如下步驟(1)外植體消毒將非洲蟛蜞菊頂芽或側(cè)芽置于65-75％乙醇中浸泡20-60s，0.1％升汞中滅菌4-12min，再用無菌水沖洗3-6次；(2)無菌苗的獲得將消毒后的非洲蟛蜞菊頂芽或側(cè)芽接種到MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)15～30天獲得無菌苗，培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，光照強(qiáng)度1500Lux，光照時(shí)間12h·d-1；(3)誘導(dǎo)叢生芽發(fā)生將無菌苗的莖尖或莖段置于配方為MS+0.5-5mg/L 6-BA+0-0.5mg/L NAA的培養(yǎng)基上培養(yǎng)15～35天獲得叢生芽，培養(yǎng)條件同步驟(2)；(4)誘導(dǎo)生根將步驟(3)所得到的叢生芽分切成單株，在1/2MS+0-5mg/L IBA或NAA的培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～20天得到再生植株，培養(yǎng)條件同步驟(2)；(5)再生植株移栽將步驟(4)得到的再生植株煉苗后，移栽入蛭石土或者花卉土中，用自來水或者1/4MS培養(yǎng)液澆灌。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在步驟(3)中，培養(yǎng)基配方為MS+1-5.0mg/L6-BA+0.1-0.5mg/L NAA。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟(3)中培養(yǎng)基的配方為MS+2.0mg/L 6BA+0.5mg/L NAA。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(4)中，培養(yǎng)基的配方為1/2MS+0.5-1mg/L IBA或NAA。
5.如權(quán)利要1或4所述的方法，其特征在于步驟(4)中培養(yǎng)基的配方為1/2MS+1.0mg/L IBA或NAA。
全文摘要
非洲蟛蜞菊的繁殖方法，包括五步驟(1)外植體消毒采用65－75％乙醇和0.1％升汞消毒；(2)無菌苗的獲得采用MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)15～30天，溫度25±2℃，光照強(qiáng)度1500Lux，光照時(shí)間12h·d
文檔編號(hào)A01H4/00GK1631106SQ20041007759
公開日2005年6月29日 申請日期2004年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月27日
發(fā)明者譚武賢, 劉吉升, 陳剛, 李玲 申請人:華南師范大學(xué)