專利名稱：輪葉黑藻工程苗快繁方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種快速生產(chǎn)輪葉黑藻優(yōu)質(zhì)工程苗的方法。
背景技術(shù)：
輪葉黑藻(Hydrilla verticillata Royle)是水鱉科黑藻屬一種水生草本植物，生長在淡水湖泊中。該植物對水體污染具有很高的耐受性，在富營養(yǎng)化水體生態(tài)修復工程中可充當凈水工具種和植被恢復先鋒物種。該植物還被廣泛栽植于魚、蝦和蟹塘中，不僅可以為上述水產(chǎn)品提供餌料，也可以為之提供必要的避難和產(chǎn)卵場所。另外，在室內(nèi)觀賞水族養(yǎng)殖過程中，該植物也是常用的造景材料。
目前市場上對輪葉黑藻種苗需求量很大。但有關(guān)輪葉黑藻的研究都集中在其自然種群的分布、其耐污性與凈水效果、以及其在魚蝦蟹養(yǎng)殖中的應用。在實踐過程中，輪葉黑藻種源都采集于自然環(huán)境。打撈過程中根系多遭受一定程度的破壞，且植株個體間又大小不一，不利于其成功移植。另外，自然來源的輪葉黑藻多數(shù)帶菌，不利于魚蝦蟹塘和室內(nèi)觀賞水族缸中的安全使用。最后輪葉黑藻主要以冬芽繁殖，自然環(huán)境中種源有限，過量采集容易導致其原生生境的破壞。
迄今國內(nèi)外未見有關(guān)輪葉黑藻無菌苗的培養(yǎng)及其大規(guī)模人工繁殖的研究與報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，獲得并在室內(nèi)大規(guī)模繁殖輪葉黑藻工程苗，并盡量保持其無菌，以克服該物種野外收集有限且污染嚴重的弊端，適應我國淡水湖泊植被恢復、野外魚蝦蟹水產(chǎn)養(yǎng)殖以及室內(nèi)觀賞水族布景的需要。
本發(fā)明的技術(shù)方案是1.輪葉黑藻原始種源的采集與準備于秋冬季從野外湖泊中采集輪葉黑藻植株，剪取帶冬芽的莖段，于肥皂水中浸泡2h以上，用自來水洗凈后，培養(yǎng)在溫室中。每日更換自來水，且每周添加適量Hoagland大量元素營養(yǎng)液(見表1)。溫室中光照強度1000lx左右，每日光照10h，溫度25℃左右。
表1.Hoagland大量元素營養(yǎng)液配方為

*上述試劑中除Fe-EDTA兩種成分須先加熱熬合，其余各成分均各自用蒸餾水配成100倍母液，用時用自來水將各成分混合并防止沉淀，pH調(diào)整為6.0。
2.輪葉黑藻無菌苗的獲得取上述在溫室中培養(yǎng)2周以上的冬芽，用70％乙醇浸泡一定時間，再用適當濃度的NaClO漂白劑并一定比例的Tween-80浸泡一定時間，用無菌水徹底漂洗后，接種于1/2Ms液體培養(yǎng)基中(見表2)，于組培室中培養(yǎng)。光照強度1500lx左右，每日光照10h，溫度仍為25℃左右。期間注意觀察，隨時剔除仍然污染的材料。
3.輪葉黑藻無菌苗的大規(guī)模繁殖上述材料中的無菌個體經(jīng)過20d培養(yǎng)后，多數(shù)莖葉已明顯伸長，植株粗壯。將材料于超凈工作室中分割成帶2～3節(jié)的小段，接種于相同成分的培養(yǎng)液中。各小段經(jīng)一段時間培養(yǎng)后，多數(shù)會在小節(jié)處長出側(cè)芽。待側(cè)芽長大后切下，可繼續(xù)分割，再接種于1/2Ms培養(yǎng)液中，以獲得更大量莖芽；也可直接將側(cè)芽切下，轉(zhuǎn)接到1/4Ms液體培養(yǎng)基中，20d后多數(shù)將長出1～3cm長的根。上述培養(yǎng)也在組培室中進行，光照和溫度不變。
4.輪葉黑藻工程苗的壯苗將1/4Ms培養(yǎng)基中莖長6cm以上，根系發(fā)達的輪葉黑藻取出，可直接滿足室內(nèi)觀賞水族布景的需要。若用于大型湖泊植被恢復和魚蝦蟹塘移栽，須先移栽到底部鋪有滅過菌的沙石的大玻璃缸中。保持水深50cm以上，每周換水并添加一定量Hoagland營養(yǎng)液以促進其生長。當室外白晝氣溫20℃以上時，將玻璃缸置于室外，直接利用太陽光照；否則，仍放于溫室中，保持溫度并補充人工光照。當植株長至40cm以上時可進行大規(guī)模移栽。
5.輪葉黑藻工程苗的應用收獲1/4Ms培養(yǎng)液中莖長6cm以上的健康輪葉黑藻植株，用自來水將植株上殘留的培養(yǎng)液沖洗干凈后，根據(jù)布景的需要，栽種于室內(nèi)觀賞水族缸中。收獲大玻璃缸中40cm以上的健康輪葉黑藻植株，采用合適的密度，單獨或與其它水生物種一起移栽到目標湖泊中，用于目標地植被恢復與水質(zhì)凈化，或移栽到魚蝦蟹塘中，建群后用作魚蝦蟹飼料并為之提供避難和產(chǎn)卵場所。
表2.Ms液體培養(yǎng)基基本配方為

*將上述除蔗糖外的成分按大量元素、微量元素、有機成分和Fe-EDTA熬合劑用蒸餾水配成4種50倍母液，用時用蒸餾水再混合稀釋，蔗糖現(xiàn)溶。調(diào)整pH到5.7后分裝到100mL三角瓶中，用封口膜包扎后于121℃、0.1MPa左右濕熱滅菌18min。
本發(fā)明的效果在于1)獲得了輪葉黑藻無菌苗。野外采集的輪葉黑藻原材料本身污染嚴重，而該水草莖葉細嫩，又兼有吸收能力，使其滅菌過程具有相當難度。本技術(shù)采用肥皂水浸洗，并在自來水配合低濃度的營養(yǎng)液中預培養(yǎng)一定時間，先初步降低污染程度，并提高材料活力。再通過乙醇和NaClO漂白劑共同作用，徹底滅菌。本技術(shù)中選用輪葉黑藻的冬芽，有利于材料本身對消毒劑的抵抗力。通過該程序，在保證無菌率60％以上的基礎(chǔ)上，材料存活率也在50％以上。
2)建立了輪葉黑藻工程苗快速繁殖途徑。本技術(shù)在獲得輪葉黑藻無菌苗的基礎(chǔ)上，直接利用其側(cè)芽進行分割繁殖，步驟簡單，操作方便，所用試劑均為常規(guī)化工產(chǎn)品，成本低廉，便于其大規(guī)模工廠化生產(chǎn)。以20d為一個分割周期，每個無菌冬芽或側(cè)芽至少可分割成4個帶2～3小節(jié)的莖段，而每個莖段至少分蘗出3個側(cè)芽，以此估算，每個原始芽一年內(nèi)可至少分出(4×3)17個新芽。而每個幼芽自萌出到長成6cm以上完整植株約需40d，以此估算，一個長×寬為120cm×60cm的8層普通培養(yǎng)架，可年生產(chǎn)輪葉黑藻工程苗25000株以上。
本項發(fā)明可不分季節(jié)，隨時為湖泊植被恢復、魚蝦蟹塘養(yǎng)殖和室內(nèi)水族觀賞布景提供足夠的輪葉黑藻優(yōu)質(zhì)工程苗。
具體實施例方式
實例1.于11月從蘇州東太湖采集輪葉黑藻種源，剪取帶冬芽的莖段，于肥皂水中浸泡4h后用自來水漂洗。用2L燒杯培養(yǎng)在溫室中。每日更換自來水，且每周添加一次Hoagland營養(yǎng)液。溫室中光照強度1000lx左右，每日光照10h，溫度25℃左右。15d后選取莖桿粗壯，葉片無缺損的冬芽30枚，用70％乙醇浸泡數(shù)秒，再用稀釋適當比例并含有一定量Tween-80的NaClO漂白劑浸泡數(shù)分鐘，用無菌水徹底漂洗后，接種于含40mL 1/2Ms液體培養(yǎng)基的封口三角瓶中，于組培室中培養(yǎng)。平均光照強度1500lx，每日光照10h，溫度25℃左右。此后每日觀察，隨時剔除污染材料，1周后得無菌芽21枚。20d后多數(shù)冬芽長至4cm以上，并有部分冬芽在基部又長出了側(cè)芽。在無菌條件下切下1～2cm長的莖尖芽段，轉(zhuǎn)接到1/4Ms液體培養(yǎng)基中。另外剩余莖段材料以每2～3小結(jié)再分段，繼續(xù)培養(yǎng)在1/2Ms培養(yǎng)液中。又經(jīng)20d，在1/4Ms中共有25個芽段發(fā)育成帶根植株。將這些完整植株轉(zhuǎn)接到新的1/4培養(yǎng)液中再培養(yǎng)一段時間后用于觀賞水族布景。同時在1/2Ms中培養(yǎng)的材料經(jīng)20d也分化出92個新芽，繼續(xù)切割培養(yǎng)。實例2.取保存在溫室中帶冬芽的輪葉黑藻莖段，于肥皂水中浸泡3h后用自來水徹底漂洗，再在流動自來水中培養(yǎng)。采用自然光照，溫度25℃左右。48h后切取莖桿粗壯，葉片無缺損的冬芽50枚，用70％乙醇浸泡數(shù)秒，再用稀釋適當比例并含有一定量Tween-80的NaClO漂白劑浸泡數(shù)分鐘，用無菌水徹底漂洗后，接種于含40mL 1/2Ms液體培養(yǎng)基的封口三角瓶中，于組培室中培養(yǎng)。光照強度1500lx左右，每日光照10h，溫度仍為25℃。此后隨時剔除仍然污染的材料，1周后得無菌芽34枚。20d后在無菌條件下將培養(yǎng)物全部切成至少帶2～3小結(jié)的莖段，繼續(xù)培養(yǎng)在1/2Ms培養(yǎng)液中。又經(jīng)20d，共獲得413個新芽，將其中1.5cm以上長度的新芽取下，轉(zhuǎn)接到1/4Ms培養(yǎng)液中，再培養(yǎng)30d，共獲得356株健康幼苗。將這些幼苗移栽到鋪有滅過菌的沙石的大玻璃缸中，用于濕地植被恢復研究。
權(quán)利要求
1.一種輪葉黑藻無菌苗培養(yǎng)及其工程苗快速擴繁的方法，其特征為該方法利用植物組織培養(yǎng)原理，經(jīng)過一系列預培養(yǎng)和滅菌過程，獲得輪葉黑藻無菌冬芽，切段后培養(yǎng)于1/2Ms液體培養(yǎng)基中以獲得更多新芽，再將芽段轉(zhuǎn)接到1/4Ms液體培養(yǎng)基中以誘導根的形成，繼續(xù)培養(yǎng)至莖長6cm以上，轉(zhuǎn)到大玻璃缸中，補充Hoagland營養(yǎng)液繼續(xù)壯苗，直到植株長到40cm以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述輪葉黑藻工程苗的應用，其特征在于該工程苗在湖泊植被恢復工程中的應用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述輪葉黑藻工程苗的應用，其特征在于該工程苗在魚蝦蟹養(yǎng)殖過程中的應用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述輪葉黑藻工程苗的應用，其特征在于該工程苗在室內(nèi)觀賞水族養(yǎng)殖過程中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。運用輪葉黑藻組織培養(yǎng)技術(shù)，獲得并大規(guī)模擴繁其優(yōu)質(zhì)工程苗，以克服該物種在自然環(huán)境中種源有限且污染嚴重的問題。滿足目前湖泊生態(tài)修復工程中作為凈水工具種和植被恢復先鋒物種、魚蝦蟹塘養(yǎng)殖過程中作為餌料、避難和產(chǎn)卵場所，以及室內(nèi)觀賞水族養(yǎng)殖過程中作為布景材料的迫切需要。
文檔編號A01G33/00GK1555682SQ200410013848
公開日2004年12月22日 申請日期2004年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月8日
發(fā)明者安樹青, 周長芳, 蔣金輝, 尹大強 申請人:南京大學