專利名稱：高山冰緣植物組織培養(yǎng)與冷誘導分泌蛋白生產的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于蛋白質工程技術，尤其屬于一種高山冰緣植物組織培養(yǎng)與冷誘導分泌蛋白生產的方法。
背景技術：
植物分泌蛋白是指植物細胞分泌到質外體的蛋白，可以在液體搖培時分泌到培養(yǎng)液。一般植物的分泌蛋白包括信號多肽或抗凍蛋白。例如鈣調素是一種信號多肽，經國內外10多年的研究已證實鈣調素不僅普遍存在于植物細胞外，而且在胞外位點具有促進懸浮培養(yǎng)細胞及其原生質體的增殖和促進二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亞基基因的光不依賴性表達等多種重要生物學功能；關于抗凍蛋白及其基因的研究也已有40多年的歷史，但實驗材料大多集中于魚類和昆蟲，自從1992年Griffith等從冬黑麥質外體中發(fā)現(xiàn)可經冷誘導表達的抗凍蛋白以來，黑麥草、胡蘿卜的抗凍蛋白相繼被發(fā)現(xiàn)，并且都是冷誘導表達，都存在與質外體中，屬于分泌性蛋白，并且其抗凍活性優(yōu)于魚類或昆蟲。所以植物冷誘導產生分泌蛋白很有可能具有抗凍功能。由于抗凍蛋白分布的不普遍性，很難從特定的幾種植物中找到，并且傳統(tǒng)的質外體提取技術難掌握，大大限制了冷誘導分泌的抗凍蛋白的分離。高山冰緣植物是很好的植物抗凍種質庫，通過組織培養(yǎng)獲得其擴繁的組織材料進而分離內源的抗凍蛋白及其編碼基因，這在細胞生物學、遺傳學、植物生理學、分子生物學等基礎研究方面具有重要的意義，而且具有廣泛的應用價值。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的著眼于高山冰緣植物，并通過高質量的采樣、運輸系統(tǒng)，將高山冰緣植物活體移植回實驗室，排除形態(tài)解剖學上有明顯抗寒特性的物種，將通過篩選的物種進行組織培養(yǎng)，并在組織培養(yǎng)過程中評價變異情況，并利用可控低溫、光周期懸浮愈傷組織搖動培養(yǎng)，通過分光光度計定時檢測培養(yǎng)液蛋白吸收波段吸收峰，確定誘導出冷誘導蛋白，利用套管離心愈傷組織，得到冷誘導蛋白。
本發(fā)明的目的可通過以下步驟來實現(xiàn)(1)選擇合適的采樣地點。在冰川附近，植物生長期大約在6-10月份，白天氣溫10℃以上，晚上氣溫0℃左右，晝夜有反復凍融的溫差。利用采集杖將植物的植株連根帶土挖下，迅速放置到聚乙烯采集袋中，采集到的植株當天取出放入運輸箱中。運輸箱夾層支撐隔板上放置加緩釋冰袋，每隔6小時從透氣孔中向箱內噴霧補水，如果儲存或運輸超過2天則換一次冰袋。同時在采樣地用FAA固定液固定每種植物的幾篇葉片，留作形態(tài)解剖觀察之用。
(2)篩選植物。根據(jù)所設計的產冷誘導分泌蛋白高山冰緣植物候選標準，即無分泌蠟質的腺體、無表皮絨毛、無角質層加厚。具體將運輸回實驗室的固定葉片用梯度乙醇脫水(90％，95％，100％)各30-40分鐘，并用二甲苯浸泡1小時，浸臘包埋后進行切片，1％伊紅染色。
(3)組織培養(yǎng)。在篩選后的植株中，選擇飽滿挺拔的葉子剪下置于自來水管下流水洗滌1小時，然后在超凈臺上將葉片移入高壓滅菌過的燒杯中，70％乙醇浸泡30秒，放于另一無菌燒杯用無菌水淋洗一次，加0.1％的氯化汞滅菌15分鐘，移入無菌培養(yǎng)皿中用無菌水淋洗3次，然后用無菌濾紙吸干表面水分。切去葉片邊緣，將葉片切成5mm左右的片斷，轉到含2.0-6.0mg/L的GA3的MS固體培養(yǎng)基中，25℃、每天10小時光照培養(yǎng)。一周后保持鮮活的葉片移入含1.0-2.0mg/LGA3+0.1-2mg/LBA+0.1-2mg/L的NAA或0.1-2mg/L2，4-D的MS固體培養(yǎng)基中誘導愈傷組織。愈傷組織出現(xiàn)后，經過4-6周的相同培養(yǎng)基的繼代擴繁，轉移到不含激素的MS液體培養(yǎng)基，利用可控低溫與光周期搖動培養(yǎng)裝置進行低溫誘導。搖培后的愈傷組織接入無激素MS培養(yǎng)基發(fā)芽生根，再生為植株。
(4)組織培養(yǎng)的變異評價，其分兩部分。第一部分是幼胚染色體變異評價，操作步驟包括選取液體搖動培養(yǎng)后的1毫米左右直徑的小顆粒在顯微鏡下挑出發(fā)育的幼胚，利用6％纖維素酶+6％果膠酶25攝氏度6小時消化細胞壁，過6微米的尼龍膜，濾液每分鐘600轉離心5分鐘，去上清，加入2M的氯化鈣打散細胞，底部加入60％的蔗糖，形成雙相溶液，每分鐘600轉離心5分鐘，然后用注射器針頭抽出界面處的原生質體條帶。2M的氯化鈣稀釋原生質體，于載玻片上空1米處滴片，加一滴卡諾固定液展片，將制片65攝氏度溫浴4小時，然后乙醇梯度脫水(70％，80％，95％，100％乙醇各10分鐘)，室溫晾干制片上的乙醇，1％醋酸洋紅染色10分鐘，顯微鏡觀察染色體數(shù)目。第二部分是再生苗根尖染色體變異評價，操作步驟包括，選取液體搖動培養(yǎng)中的幼胚，轉到MS固體培養(yǎng)基再生并生根，根長至1厘米時取根尖，6％纖維素酶+6％果膠酶25攝氏度6小時消化細胞壁，壓片，染色步驟同上，顯微鏡下觀察染色體數(shù)目。
(5)冷誘導。利用冷柜接-30℃-+30℃溫控器，內置40瓦日光燈4個接微電腦控時開關，內置水平搖床。在無菌操作臺上，取1克愈傷組織接入盛有50毫升MS液體培養(yǎng)基的150毫升三角瓶中，蓋橡膠塞，插入17號注射針頭，尖端進入液體培養(yǎng)基，溫度-4-4攝氏度，光周期每天光照12小時，搖動速率每分鐘60轉，搖動培養(yǎng)4-6周。
(6)冷誘導分泌蛋白的檢測。每天用注射器連接橡膠塞中的針頭，抽取液體培養(yǎng)液200微升，放到150微升石英比色皿，選取200-300納米激發(fā)波長做分光光度掃描，以新鮮配制的液體MS培養(yǎng)基為對照掃描基線，觀察吸收峰的變化，有明顯吸收峰時即為誘導蛋白出現(xiàn)。
(7)冷誘導分泌蛋白的分離。將出現(xiàn)誘導蛋白的愈傷組織橡膠塞打開，抽真空滲透30分鐘，然后將愈傷組織過濾收集。移入底部用鋼針扎0.1毫米孔的0.5毫升離心管，外套2毫升離心管，每分鐘500轉離心10分鐘，收集2毫升離心管中的滲出液，即為得到的冷誘導蛋白混合液，可采用聚丙烯酰胺變性膠電泳印證。
本發(fā)明的優(yōu)點及產生的效果是1、高山冰緣植物采樣與運輸系統(tǒng)首次提出采用聚乙烯袋保濕，運輸過程中運輸箱采取夾層冰袋制冷。減少了采后鮮樣的蒸騰失水，降低高山冰緣植物的代謝速率，并采取透氣孔通氣和噴霧補充水分的方法，大大提高了高山冰緣植物的成活率，為下一步組織培養(yǎng)創(chuàng)造良好的條件；2、本發(fā)明首次提出高山冰緣植物候選標準，排除形態(tài)解剖學抗寒特性的思想和方法，縮小了產冷誘導蛋白高山冰緣植物的候選范圍；3、高山冰緣植物組織培養(yǎng)首次采用GA3預處理的方法，抑制了高山冰緣植物組織培養(yǎng)初期出現(xiàn)的葉片易褐變、易水漬化和易白化的現(xiàn)象；4、高山冰緣植物組織培養(yǎng)的變異評價首次提出用搖動培養(yǎng)的幼胚制作原生質體進行染色體變異評價，并結合再生苗根尖染色體變異評價，形成完善的評價系統(tǒng)；5、可控低溫、光周期的懸浮組織搖動培養(yǎng)的冷誘導系統(tǒng)首次采用冰柜內置搖床，利用微電腦控時結合精密溫控器進行控光、控溫，滿足了搖動培養(yǎng)中對溫度和光照的要求，填補現(xiàn)階段無滿足冷誘導條件的儀器的空白；6、冷誘導分泌蛋白的檢測系統(tǒng)首次提出針頭定時吸取培養(yǎng)液進行分光光度掃描的方法，大大優(yōu)于分階段提取蛋白進行電泳的繁雜方法；
7、冷誘導分泌蛋白的分離系統(tǒng)首次提出利用原培養(yǎng)液取代提取緩沖液進行真空滲透，保持了冷誘導蛋白的環(huán)境穩(wěn)定性，并首次利用離心管套疊取代注射器或微管的離心的方法分離分泌蛋白，是一種有效而簡化的方法。


圖1為本發(fā)明運輸箱剖面示意圖。
圖2為可控低溫、光周期的懸浮組織搖動培養(yǎng)冷誘導與冷誘導蛋白檢測示意圖。
圖3為冷誘導分泌蛋白的分離示意圖圖4為高山離子芥組織培養(yǎng)結果。
圖5為掃描檢測結果第四周出峰。
圖6為三個蛋白條帶具體實施方式
下面結合附圖對本發(fā)明的技術方案再作進一步詳述(1)高山冰源植物樣品采集。8月份在天山一號冰川附近的空冰斗采樣，此處此時的晝夜有反復凍融的溫差，白天平均氣溫10℃左右，夜晚平均氣溫0℃以下。利用采集杖將植物的植株連根帶土挖下，迅速放置到聚乙烯采集袋中，采集到的植株當天取出放入運輸箱1，夾層支撐隔板3上放置加緩釋冰袋2，每隔6小時從透氣孔中向箱內噴霧補水，同時在采樣地用FAA固定液固定每種植物的幾篇葉片，留作形態(tài)解剖觀察之用(參見圖1)。(2)產冷誘導分泌蛋白高山冰緣植物候選。將固定樣用梯度乙醇脫水(90％，95％，100％)各30分鐘，并用二甲苯浸泡1小時，浸臘包埋后進行切片，1％伊紅染色，發(fā)現(xiàn)高山離子芥無分泌蠟質的腺體、無表皮絨毛、無角質層加厚，隨即將高山離子芥做為組織培養(yǎng)對象。(3)進行高山冰緣植物組織培養(yǎng)及其變異評價。選擇高山離子芥植株，并將飽滿挺拔的葉子剪下，置于自來水管下流水洗滌1小時，然后在超凈臺上將葉片移入高壓滅菌過的燒杯中，70％乙醇浸泡30秒，放于另一無菌燒杯用無菌水淋洗一次，加0.1％的氯化汞滅菌15分鐘，移入無菌培養(yǎng)皿中用無菌水淋洗3次，然后用無菌濾紙吸干表面水分。切去葉片邊緣，將葉片切成5毫米左右的片斷，轉到含4mg/L的GA3的MS固體培養(yǎng)基中，25攝氏度、每天10小時光照培養(yǎng)。一周后保持鮮活的葉片移入含2mg/LGA3+0.2mg/L2，4-D+0.2mg/LNAA的MS固體培養(yǎng)基中誘導愈傷組織。4周后高山離子芥愈傷組織出現(xiàn)，再經過4周的相同培養(yǎng)基的繼代擴繁，轉移到不含激素的MS液體培養(yǎng)基，冷誘導過程利用冷柜5接-30～+30℃溫控器6內置40W的該燈管10接微電腦開關7、內置水平搖床鋪11進行低溫誘導4-6周，溫度-4-4攝氏度，光周期每天光照12小時，搖動速率每分鐘60轉(參見圖2)。選取液體搖動培養(yǎng)后的1毫米左右直徑的小顆粒在顯微鏡下挑出發(fā)育的幼胚，利用6％纖維素酶+6％果膠酶25攝氏度6小時消化細胞壁，過6微米的尼龍膜，濾液每分鐘600轉離心5分鐘，去上清，加入2M的氯化鈣打散細胞，底部加入60％的蔗糖，形成雙相溶液，每分鐘600轉離心5分鐘，然后用注射器針頭抽出界面處的原生質體條帶。2M的氯化鈣稀釋原生質體，于載玻片上空1米處滴片，加一滴卡諾固定液展片，將制片65攝氏度溫浴4小時，然后乙醇梯度脫水(70％，80％，95％，100％乙醇各10分鐘)，室溫晾干制片上的乙醇，1％醋酸洋紅染色10分鐘，顯微鏡觀察染色體數(shù)目。選取液體搖動培養(yǎng)中的幼胚，轉到MS固體培養(yǎng)基再生并生根，根長至1厘米時取根尖，6％纖維素酶+6％果膠酶25攝氏度6小時消化細胞壁，壓片，染色步驟同上，顯微鏡下觀察染色體數(shù)目。發(fā)現(xiàn)觀察到的染色體數(shù)目皆為14條，沒有發(fā)現(xiàn)變異。(4)搖動培養(yǎng)進行低溫誘導。無菌操作，取1克高山離子芥愈傷組織接入盛有50毫升MS液體培養(yǎng)基的150毫升三角搖瓶8中，蓋橡膠塞，插入17號注射針頭9，尖端進入液體培養(yǎng)基，溫度-4-4攝氏度，光周期每天光照12小時，搖動速率每分鐘60轉，搖動培養(yǎng)4周。(5)冷誘導分泌蛋白的檢測。每天用注射器連接橡膠塞中的針頭，抽取液體培養(yǎng)液200微升，放到150微升石英比色皿，選取200-300納米激發(fā)波長做分光光度掃描，以新鮮配制的液體MS培養(yǎng)基為對照掃描基線，觀察吸收峰的變化，在第4周開始出現(xiàn)明顯吸收峰，即為誘導蛋白出現(xiàn)(參見圖5)。(6)冷誘導分泌蛋白的分離。將盛有高山離子芥愈傷組織的三角瓶的橡膠塞打開，抽真空滲透30分鐘，然后將愈傷組織過濾收集。移入底部用鋼針扎0.1毫米孔13的0.5毫升離心管12，外套2毫升離心管14，每分鐘500轉離心10分鐘，收集2毫升離心管14中的滲出液，即為得到的冷誘導蛋白混合液，(參見圖3)采用聚丙烯酰胺變性膠電泳印證，發(fā)現(xiàn)有三條明顯條帶(參見圖6)。
權利要求
1.一種高山冰緣植物組織培養(yǎng)與冷誘導分泌蛋白生產的方法，包括下述步驟(1)采樣、擬定候選標準，篩選可生產冷誘導分泌蛋白的高山冰緣植物；(2)取高山冰緣植物葉片進行組織培養(yǎng)，利用GA3急速預處理的方法進行脫分化、擴繁、懸浮培養(yǎng)及再分化；(3)進行高山冰緣植物組織培養(yǎng)變異評價；(4)利用可控低溫、光周期的懸浮搖動培養(yǎng)實施冷誘導；(5)檢測培養(yǎng)液中蛋白的產生；(6)冷誘導蛋白的分離。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種高山冰緣植物組織培養(yǎng)與冷誘導分泌蛋白生產的方法，其特征在于利用采集杖挖掘冰川附近的植物，用聚乙烯袋收集帶土植株，運輸時去掉聚乙烯袋移栽到塑料泡沫運輸箱(1)夾層的下層，支撐隔板(3)放置加緩釋冰袋(2)，中途通過箱側透氣孔(4)噴霧補水。高山冰緣植物候選標準是根據(jù)高山冰緣植物抗寒特性，利用顯微鏡切片觀察，排除形態(tài)解剖的冷適應機制，篩選很有可能分泌冷誘導蛋白的植物物種。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種高山冰緣植物組織培養(yǎng)與冷誘導分泌蛋白生產的方法，其特征在于利用植物的葉片，表面消毒后接入含2.0-6.0mg/L的GA3的MS培養(yǎng)基，25℃每天10小時光照培養(yǎng)，經過7天的培養(yǎng)，鮮活葉片移入到含1.0-2.0mg/L的GA3與2，4-D、NAA、BA不同搭配組合的培養(yǎng)基誘導愈傷組織，愈傷組織經過懸浮培養(yǎng)后轉入無激素培養(yǎng)基再生出苗。冷誘導過程利用冷柜(5)接-30℃-+30℃溫控器(6)，內置日光燈(10)接微電腦控時開關(7)，內置水平搖床(11)進行低溫誘導4-6周，溫度-4℃～+4℃，搖動速率每分鐘60轉愈傷組織搖動培養(yǎng)。
4.據(jù)權利要求1所述的一種高山冰緣植物組織培養(yǎng)與冷誘導分泌蛋白生產的方法，其特征在于包括再生懸浮幼胚和再生苗根尖的染色體變異評價，利用懸浮培養(yǎng)的幼胚制作原生質體，高空滴片后經過染色，顯微鏡下觀察再生幼胚染色體變異情況；并且利用根尖染色體壓片的方法進行觀察再生苗染色體變異情況。
5.根據(jù)要求1所述的一種高山冰緣植物組織培養(yǎng)與冷誘導分泌蛋白生產的方法，其特征在于利用17號注射器針頭(9)插入搖瓶(8)橡膠塞，定時抽取培養(yǎng)液上清進行全波段分光光度掃描。
6.根據(jù)要求1所述的一種高山冰緣植物組織培養(yǎng)與冷誘導分泌蛋白生產的方法，其特征在于將搖培的愈傷組織過濾收集后采用真空滲透法將提取緩沖液滲入細胞間隙，利用2ml離心管(14)內套底部扎微孔(13)的0.5ml離心管(12)低速離心，收集離心液后高速離心取上清，聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。
7.根據(jù)要求1所述的一種高山冰緣植物組織培養(yǎng)與冷誘導分泌蛋白生產的方法，其特征在于所述的高山冰緣植物為高山離子芥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高山冰緣植物組織培養(yǎng)與冷誘導分泌蛋白生產的方法，包括以下步驟(1)采樣、擬定候選標準，篩選了生產冷誘導分泌蛋白的植物；(2)將高山冰緣植物葉片進行組織培養(yǎng)，利用GA3激素預處理方法進行脫分化，擴繁，再分化；(3)高山冰緣植物組織培養(yǎng)的變異評價(4)利用可控低溫、光周期的懸浮組織搖動培養(yǎng)實施冷誘導(6)冷誘導分泌蛋白的檢測系統(tǒng)(7)冷誘導分泌蛋白的分離。本發(fā)明解決了高山冰緣植物采樣、運輸、移栽困難的問題，采用GA3預處理方法，通過控光、控溫懸浮組織搖動培養(yǎng)的冷誘導，利用離心管套疊離心的方法分離分泌蛋白，其對于獲得抗凍蛋白及其編碼基因不僅在植物生理學、遺傳學甚至分子生物學等基礎研究方面有重要的經濟意義，而且在植物育種及品種改良方面有廣泛的應用價值。
文檔編號A01H4/00GK1625941SQ20031012197
公開日2005年6月15日 申請日期2003年12月10日 優(yōu)先權日2003年12月10日
發(fā)明者安黎哲, 王建輝 申請人:安黎哲