專利名稱：脫水素基因BcDh2及其啟動子在培育耐旱植物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及克隆了一個新的脫水素基因BcDh2和其啟動子BcDh2P，并且提供了利用此基因遺傳轉(zhuǎn)化獲得耐旱耐寒轉(zhuǎn)基因植物的分子方法。該基因為脫水素家族YSK2類型成員。
背景技術(shù)：
LEA蛋白是胚胎發(fā)生的晚期，或干旱，低溫或外源ABA處理之后，產(chǎn)生的一類主要的蛋白質(zhì)。LEA具有保守的結(jié)構(gòu)域，較高的親水性，可溶性，廣泛存在單子葉和雙子葉植物中。它們表達(dá)的發(fā)育階段特異性及干旱脅迫期間的積累，指出在保護(hù)細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)方面起的作用。依據(jù)氨基酸組成的不同，LEA分為五類，group I LEA的特征，它有20個氨基酸組成的基序，如小麥Em蛋白；group II LEA稱做脫水素(dehydrin)，是LEA中研究最多的，脫水素結(jié)構(gòu)的基本特征是在羧基末端存在2-11個氨基酸組成的富含Lys的K-區(qū)段(K-segment，EKKGIMDKIKEKIPG)，可以形成兩性的α-螺旋。在中部含有一連串排列的絲氨酸組成的S-區(qū)段(S-segment)，絲氨酸被磷酸化，可以通過結(jié)合核定位的信號肽參與核運輸。在脫水素的氨基末端，有時會存在1-2個Y-區(qū)段(Y-segment，T/VDEYGNP)，它與分子伴侶的部分核苷酸結(jié)合位點同源。到目前為止，盡管許多研究證實脫水素與大分子，如與核內(nèi)的核蛋白復(fù)合體和脂膜有聯(lián)系，但脫水素的確切功能仍不清晰。推測脫水素是一種表面活性劑，在細(xì)胞干旱和低溫條件下能抑制大分子的聚合，保護(hù)細(xì)胞的完整性(Close，1996，1997)；groupIII LEA含有一個11個氨基酸組成的基序，形成α-螺旋，可能在分子內(nèi)或分子間的相互作用間起作用；groupIV LEA具有保守的氨基末端形成α-螺旋，和一個多變的羧基末端，具有無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)；groupV LEA含有比其他group更多的疏水氨基酸，可能形成球形結(jié)構(gòu)(Dure et al.，1989，Ingram and Bartels，1996)。

發(fā)明內(nèi)容
1、克隆了新的脫水素基因BcDh2我們從干旱誘導(dǎo)的厚葉旋蒴苣苔(B.crassifolia)的葉片中分離出一個新的脫水素類似基因cDNA，命名為BcDh2(GenBank登錄號為AY243045)。BcDh2編碼區(qū)(codingsequence)為402bp。該基因編碼一條由133個氨基酸組成的多肽—一個典型的YSK2型脫水素，在氨基末端具有一個Y-區(qū)段，中部為7個絲氨酸組成的S-區(qū)段，羧基末端含有兩個重復(fù)排列的K-區(qū)段。根據(jù)已知的植物脫水素基因保守區(qū)域設(shè)計引物，采用DDRT-PCR方法從厚葉旋蒴苣苔總RNA中擴(kuò)增出一個300bp與植物脫水素基因同源的序列。利用5’RACE技術(shù)獲得了植物脫水素基因家族的一個新成員BcDh2的全長cDNA(402bp)，并對該基因的表達(dá)特性進(jìn)行了分析。Southern雜交分析表明BcDh2基因在厚葉旋蒴苣苔基因組中以單拷貝形式存在。Northern雜交分析指出，BcDh2基因在正常生長的植物體中是不表達(dá)的，但在不同的環(huán)境脅迫(干旱，低溫，熱擊)和外源誘導(dǎo)物(外源ABA，MeJA和SA)存在條件下的積累是不同的。BcDh2轉(zhuǎn)錄子在干旱，高鹽，溫和的熱擊和外于外源ABA誘導(dǎo)下強(qiáng)烈表達(dá)，但對低溫，MeJA和水楊酸處理有微弱表達(dá)，這些結(jié)果指出BcDh2基因在脅迫和傷害反應(yīng)中的作用。
2、構(gòu)建了BcDh2基因的植物表達(dá)載體將BcDh2基因置于CaMV 35S啟動子調(diào)控下，構(gòu)建了植物表達(dá)載體pBI121BcDh2。通過凍融法轉(zhuǎn)化土壤農(nóng)桿菌LBA4404，再利用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草得到了轉(zhuǎn)基因煙草植株。將BcDh2基因置于Ubiquitin啟動子調(diào)控下，構(gòu)建了單字葉植物表達(dá)載體pAHC-BcDh2和p3ubiBcDh2。通過基因槍轉(zhuǎn)化草坪草和牧草，得到轉(zhuǎn)基因植株，并初步表現(xiàn)耐旱耐寒性能提高。
3、克隆了該脫水素基因的上游調(diào)控區(qū)，并命名為啟動子BcDh2P通過連接介導(dǎo)PCR的方法，克隆到BcDh2基因上游的一段1084bp的序列BcDh2P，將它連接到含有GUS報告基因的中間表達(dá)載體pCAMBIA1350中，對轉(zhuǎn)基因煙草中GUS表達(dá)的分析表明，BcDh2P該能對ABA、干旱和寒冷做出反應(yīng)。
4、通過基因槍和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法對草坪草和牧草進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，并獲得了耐旱轉(zhuǎn)基因草坪草和牧草將BcDh2基因置于在單子葉中高效表達(dá)的Ubi啟動子驅(qū)動下，通過基因槍的方法導(dǎo)入廣泛應(yīng)用的草坪植物如早熟禾、高羊茅、黑麥草、紫羊茅、剪股潁、結(jié)縷草、狗牙根以及牧草如苜蓿、沙打旺、百脈根、畫眉草、冰草中，使草坪草和牧草的耐旱性顯著提高，對于解決城市綠化中草坪耗水量大與我國水資源形勢嚴(yán)峻的矛盾有重要意義。目前已獲得轉(zhuǎn)基因草坪草，并已初步表現(xiàn)出增加耐缺水能力，有助于解決草坪草耗水量大、養(yǎng)護(hù)困難的問題。因此這一轉(zhuǎn)基因草坪草在節(jié)約城市綠化用水方面很有潛力。
這里應(yīng)特別指出的是，雖然在本發(fā)明的下述實施例中以轉(zhuǎn)基因煙草、草坪草(包括早熟禾、高羊茅、黑麥草、紫羊茅、剪股潁、結(jié)縷草、狗牙根等)和牧草(包括苜蓿、沙打旺、百脈根、畫眉草、冰草等)的產(chǎn)生及檢測舉例進(jìn)一步詳細(xì)描述了本發(fā)明，但這絕不意味本發(fā)明制備的脫水素BcDh2基因及其所用的植物表達(dá)載體只用于轉(zhuǎn)化和產(chǎn)生表達(dá)BcDh2基因編碼蛋白的煙草、早熟禾、高羊茅、黑麥草、紫羊茅、剪股潁、結(jié)縷草、狗牙根、苜蓿、沙打旺、百脈根、畫眉草、冰草，還包括其它草坪植物和牧草。因為本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以利用本專利構(gòu)建好的BcDh2基因表達(dá)載體，利用本專利提供的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化其它草坪植物和牧草植物。
在本發(fā)明的一個實施方案中，BcDh2基因置于組成型表達(dá)啟動子CaMV35S啟動子的調(diào)控之下，構(gòu)建了適合于雙子葉植物轉(zhuǎn)化的植物表達(dá)載體pBI121BcDh2。將連接在pGEM-TEasy載體上的BcDh2基因編碼區(qū)用Nco I和Sac I切下來，連接到用Nco I和Sac I處理過的原核表達(dá)載體pET-30a上，構(gòu)建表達(dá)BcDh2蛋白的質(zhì)粒pET-30aBcDh2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5α菌株，篩選正確的克隆。用Bgl II和Sac I消化質(zhì)粒p30aBcDh2，回收BcDh2片段，將它連接到用BamH I和Sac I消化過的質(zhì)粒pBI121中，形成pBI121BcDh2。
根據(jù)本發(fā)明的這一個實施方案，驅(qū)動BcDh2基因的啟動子除了組成型表達(dá)啟動子CaMV35S外，還應(yīng)包括其它目的是為了驅(qū)動BcDh2基因在植物中高效表達(dá)的啟動子如泛素Ubiqutin啟動子，actin啟動子等。
根據(jù)本發(fā)明的這一個實施方案，構(gòu)建所選用的原始植物表達(dá)載體為pBI121表達(dá)載體，其植物篩選標(biāo)記基因為NPTII，編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶蛋白，具有抗卡那霉素的作用。NPTII編碼區(qū)的啟動子為CaMV35S啟動子，終止子為CaMV35S polyA。驅(qū)動BcDh2基因的啟動子為CaMV35S啟動子，終止子為nos polyA。
根據(jù)本發(fā)明的這一個實施方案，構(gòu)建所選用的原始植物表達(dá)載體除了pBI121表達(dá)載體外，還可以選用CAMBIA公司的pCAMBIA系列載體或者本領(lǐng)域技術(shù)人員所構(gòu)建的其它常用的植物表達(dá)載體如pGPTV系列，pCB系列等。這些植物表達(dá)載體的標(biāo)記基因為hptII、NPTII和bar。HptII基因的編碼產(chǎn)物提供了潮霉素抗性功能，NPTII基因的編碼產(chǎn)物提供了卡那霉素抗性功能，bar基因的編碼產(chǎn)物提供了除草劑抗性功能。
在本發(fā)明的一個實施方案中，BcDh2基因置于Ubiquitin(泛素蛋白基因的5’端調(diào)控區(qū)，在單子葉植物中組成型表達(dá))啟動子的調(diào)控之下，構(gòu)建了適合于單子葉的植物表達(dá)載體pAHC-BcDh2。將連接在pGEM-T Easy載體上的BcDh2基因編碼區(qū)用Nco I和Sac I切下來，連接到用Nco I和Sac I處理過的原核表達(dá)載體pET-30a上，構(gòu)建表達(dá)BcDh2蛋白的質(zhì)粒pET-30aBcDh2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5α菌株，篩選正確的克隆。用Bgl II和Sac I消化質(zhì)粒p30aBcDh2，回收BcDh2片段，將它連接到用BamH I和Sac I消化過的質(zhì)粒pAHC25中形成pAHC-BcDh2。該表達(dá)載體由于沒有LB(Left Border)、RB(RightBorder)，因此不能通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化植物，而采取基因槍的方法轉(zhuǎn)化植物。
根據(jù)本發(fā)明的這一個實施方案，BcDh2基因的啟動子為Ubiquitin，終止子為Tnos；篩選標(biāo)記基因為Bar，bar基因的啟動子亦為Ubiquitin，終止子為Tnos。
在本發(fā)明的一個實施方案中，BcDh2基因置于Ubiquitin啟動子的調(diào)控之下，構(gòu)建了適合于用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的植物雙元表達(dá)載體p3ubiBcDh2。用Apa I切pTRD，補(bǔ)平，用SpeI切下ubiquitin啟動子(2.0kb)，亞克隆到pBluescript KS(+)EcoR V和Spe I位點間得到質(zhì)粒pBRD；pBRD用Xba I和Sac I消化后，連上用Xba I和Sac I從質(zhì)粒pT-BcDh2上切下的BcDh2(0.7kb)片段得質(zhì)粒pBRDI；用HindIII和Sac I消化pBRDI，回收ubiquitin啟動子和BcDh2基因的融合片段(2.9kb)，將它與Hind III和Sac I消化pCAMBIA3300回收的大片段連接，得到ubiquitin啟動子驅(qū)動BcDh2基因的植物雙元表達(dá)載體p3ubiBcDh2。
根據(jù)本發(fā)明的這一個實施方案，BcDh2基因的啟動子為Ubiquitin，終止子為Tnos；篩選標(biāo)記基因為Bar，bar基因的啟動子為2xCaMV35S，終止子為Tnos。
根據(jù)本發(fā)明的這一個實施方案，該植物表達(dá)載體既可以通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法遺傳轉(zhuǎn)化植物，亦可以通過基因槍的方法轉(zhuǎn)化植物。
根據(jù)本發(fā)明的這一個實施方案，構(gòu)建所選用的原始植物表達(dá)載體為CAMBIA公司的pCAMBIA3300表達(dá)載體，其植物篩選標(biāo)記基因為Bar，bar基因的編碼產(chǎn)物提供了除草劑(草丁膦)抗性功能。
根據(jù)本發(fā)明的這一個實施方案，構(gòu)建所選用的原始植物表達(dá)載體除了CAMBIA公司的pCAMBIA3300表達(dá)載體外，還可以選用CAMBIA公司的其它表達(dá)載體或者本領(lǐng)域技術(shù)人員所構(gòu)建的其它常用的植物表達(dá)載體如pGPTV系列，pBI系列pCB系列等。
在本發(fā)明的一個實施方案中，植物表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌的方法為凍融法。凍融法為本領(lǐng)域技術(shù)人員非常熟悉的技術(shù)操作，不是本發(fā)明的關(guān)鍵。通過PCR檢測陽性的農(nóng)桿菌菌株，用于轉(zhuǎn)化煙草、草坪草和牧草。
根據(jù)本發(fā)明的這一個實施方案，所選用的農(nóng)桿菌菌株為LBA4404。
根據(jù)本發(fā)明的這一個實施方案，所選用的農(nóng)桿菌菌株除了LBA4404外，還應(yīng)包括農(nóng)桿菌的其它菌株。這些菌株的特征是本身含有Vir毒性蛋白區(qū)，能夠幫助轉(zhuǎn)入的植物表達(dá)載體中的T-DNA轉(zhuǎn)移到植物的基因組中。
在本發(fā)明的一個實施方案中，轉(zhuǎn)化煙草、草坪草和牧草的一種方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。
根據(jù)本發(fā)明的這一個實施方案，植物篩選所用的抗生素除了卡那霉素，還包括除草劑，具體選用何種篩選要看選用植物表達(dá)載體所對應(yīng)的標(biāo)記基因。如選用pBI121BcDh2載體則篩選標(biāo)記為卡那霉素(Km)，選用pAHC-BcDh2和p3ubiBcDh2載體則篩選標(biāo)記為除草劑。
在本發(fā)明的一個實施方案中，轉(zhuǎn)化草坪草和牧草的另一種方法為基因槍法。
根據(jù)本發(fā)明的這一個實施方案，用于基因槍轉(zhuǎn)化的載體質(zhì)粒主要是pAHC-BcDh2和p3ubiBcDh2。這兩種載體的植物篩選標(biāo)記均為除草劑。
本發(fā)明用于靶植物的實際轉(zhuǎn)化方法除了農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法，還可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的各種不同的轉(zhuǎn)化技術(shù)將重組DNA序列導(dǎo)入待轉(zhuǎn)化的靶植物細(xì)胞。這些方法包括但并不僅限于農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，微粒轟擊法(即基因槍法)，顯微注射法，共沉淀法，電穿孔法，以及子房注射植物受精胚囊法等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過參考有關(guān)文獻(xiàn)得到詳情。最好使被轉(zhuǎn)化的序列穩(wěn)定的整合到靶植物細(xì)胞的基因組中，從而使其在傳代的過程中不被丟失。另外，用于轉(zhuǎn)化靶植物的核苷酸序列可以以線性，環(huán)形或其它重組載體的形式如人工染色體的形式存在。
本發(fā)明的有益效果BcDh2基因受干旱和寒冷誘導(dǎo)表達(dá)，其編碼蛋白脫水素在植物干旱情況下與細(xì)胞內(nèi)一些糖醇類小分子協(xié)同作用，保護(hù)細(xì)胞膜和生物大分子，從而幫助植物細(xì)胞抵抗干旱脅迫，提高植物的耐旱性。將BcDh2基因?qū)氩萜翰莺湍敛葜参锖?，能有效提高轉(zhuǎn)基因植物的耐旱保水能力。轉(zhuǎn)基因株系在離體條件下與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗迪啾龋?小時后保水力提高20～33％，9小時后保水力提高22～50％。在田間種植條件下轉(zhuǎn)基因株系比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ展?jié)水25～40％。
四、附圖簡要說明


圖1是表示植物表達(dá)載體pAHC-BcDh2構(gòu)建流程的示圖。
圖2是表示植物表達(dá)載體p3ubiBcDh2的示圖。
圖3是BcDh2基因轉(zhuǎn)化草坪草和牧草的PCR檢測。
圖中擴(kuò)增條帶大小為0.7kb，電泳帶從左到右編號依次為M，1，2，3，4。M表示分子標(biāo)記Marker，1為負(fù)對照，2為正對照，3，4為不同轉(zhuǎn)基因株系。
圖4是BcDh2基因轉(zhuǎn)化草坪草和牧草的Southern檢測。
圖中譜帶大小為0.7kb，從左到右編號依次為1，2，3，4，5。1為正對照，5為負(fù)對照，2，3，4為不同轉(zhuǎn)基因株系。
圖5是轉(zhuǎn)BcDh2基因草坪草和牧草的Northern boltting檢測。
圖中譜帶大小為0.7kb，從左到右編號依次為1，2，3，4。1為負(fù)對照，4為正對照，2，3為不同轉(zhuǎn)基因株系。
圖6是轉(zhuǎn)BcDh2基因草坪草和牧草的保水力曲線。
橫坐標(biāo)為離體葉片小時數(shù)，縱坐標(biāo)為葉片含水量百分比?！舯硎痉寝D(zhuǎn)基因?qū)φ?，●■▲表示三種不同轉(zhuǎn)基因株系。
五具體實施例方式所有實施例中的細(xì)菌培養(yǎng)和DNA操作均參考《分子克隆實驗室操作指南》(金冬雁等譯，科學(xué)出版社，北京(1993))和《精編分子生物學(xué)指南》(顏子穎等譯，科學(xué)出版社，北京(1998))。分子操作中的工具酶如限制性內(nèi)切酶均購自Promega公司，NewEnglandBiolabs公司。
實施例1 BcDh2基因的克隆根據(jù)脫水素類基因富含賴氨酸的保守區(qū)EKKGIMD(E)KIKEKLPG設(shè)計簡并引物，用GSP1和mRNA 3’端的錨定引物43218 5’GCG GCC GCT(18)3’。采用TRIzol試劑從干旱脅迫處理后的厚葉旋蒴苣苔(Boea crassifolia Hemsl.)提取葉片總RNA，加DNaseI消化去除殘存DNA，用引物43128逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后用引物GSP1和43128進(jìn)行PCR反應(yīng)。樣品經(jīng)94℃預(yù)變性5min，然后按照下列參數(shù)進(jìn)行PCR.94℃30s，53℃30s，72℃ 20s，30個循環(huán)；72℃延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳檢測后，純化回收特異片段，連入pGEM-T Easy載體，送北京博亞生物技術(shù)公司進(jìn)行序列測定。
為了通過5’RACE的方法獲得BcDh2基因的5’端，參照文獻(xiàn)(Kimura Y et al，1996)合成上游引物(46121)5’GGC CCGACGTCGCATG 3’和錨定引物(46122)5’GGC CCGACG TCG CAT GAA TTC(12)3’，基因特異引物(GSP2)5’TTG GAT TCT CAG TGGCAT GC 3’和(43514)5’TAC ACT TCC TCG GTC TTC TTG 3’。采用TRIzol試劑從干旱脅迫處理后的厚葉旋蒴苣苔提取葉片總RNA，加DNaseI消化去除殘存DNA，用引物GSP1逆轉(zhuǎn)錄合成總cDNA第一鏈，玻璃奶純化后用磷酸轉(zhuǎn)移酶將polyA加到cDNA鏈的5’末端，接著以加尾的cDNA鏈為模板PCR擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳檢測后，純化回收特異片段，連入pGEM-T Easy載體，送北京博亞生物技術(shù)公司進(jìn)行序列測定。
細(xì)菌質(zhì)粒DNA的制備(1)挑取單菌落接種于含適當(dāng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜；(2)取1.5ml菌液于小離心管中，10,000rpm離心30秒；(3)菌體沉淀重懸于100ul溶液I(50mM蔗糖，20mM Tris.Cl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0))中，振蕩混勻并靜置數(shù)分鐘；(4)加入新鮮配置的200ul溶液II(0.2N NaCl，1％SDS)，輕彈混勻，冰上放置3分鐘；(5)加入預(yù)冷的150ul溶液III(60ml 5M KAc，11.5ml冰乙酸，28.5ml無菌水)，輕彈混勻，冰上放置5分鐘；(6)12,000rpm離心5分鐘；(7)取上清液，加入1倍體積的異丙醇，混勻后在冰上放置10分鐘；(8)12,000rpm離心5分鐘，棄去上清后稍微晾干，使之溶于200ul無菌水；(9)加入100u17.5M醋酸銨，輕輕混勻后在冰上放置10分鐘；于12,000rpm離心5分鐘；(10)取上清液，加入兩倍體積無水乙醇后，于冰上或-20℃放置20分鐘，12,000rpm離心15分鐘；(11)沉淀用70％乙醇清洗，抽干后溶于TE緩沖溶液(10mM Tris.Cl(pH8.0)，1mMEDTA(pH8.0))中。
質(zhì)粒酶切條件
30ul反應(yīng)體系中，加入10×酶切緩沖液3ul，DNA 1-5ug，限制性內(nèi)切酶1ul(10U)，加無菌雙蒸水補(bǔ)至30ul，37℃反應(yīng)1-2小時，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。
DNA片段的回收(1)從瓊脂糖凝膠上切下所需DNA片段(體積不要超過100ul)置于小離心管；(2)加入3倍體積的溶膠液，60℃水浴5分鐘，其間輕搖小離心管數(shù)次使膠完全溶化；(3)加入10ul玻璃奶，用加樣器混勻。室溫靜置5分鐘；(4)離心，3,000rpm數(shù)秒，吸棄上清；(5)加125ul漂洗液，混勻。離心棄上清；(6)重復(fù)第五步兩次；(7)加適量無菌蒸餾水或TE緩沖液，混勻；(8)60℃水浴5分鐘；(9)15,000rpm離心數(shù)秒?；厥丈锨鍌溆?。連接10ul反應(yīng)體系中加入5∶1比例量的插入片段和載體片段，1單位T4DNA連接酶，16℃放置10小時左右。
大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(1)挑取E.coli DH5α單菌落接種于100ml液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600約0.4；(2)冰浴10分鐘，分裝于無菌離心管中，4℃，4,000rpm離心5分鐘收集細(xì)胞；(3)重懸于600ul冰預(yù)冷的0.1M CaCl2中，冰浴30分鐘；(4)4℃，4,000g離心10分鐘收集細(xì)胞。用100ul預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸細(xì)胞沉淀，待用。
感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(1)取100ul感受態(tài)細(xì)胞加5ul連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰置30分鐘；(2)于42℃水中熱激90秒，迅速置于冰上冷卻1-2分鐘；(3)加200ul LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)45分鐘至1小時；(4)均勻涂布于含適當(dāng)抗生素的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。
重組質(zhì)粒的篩選與鑒定a.藍(lán)白斑篩選對于載體上含有l(wèi)acZ基因的重組質(zhì)粒，可以利用x-Gal/IPTG選擇培養(yǎng)基進(jìn)行初步篩選，沒有插入外源片段的自身環(huán)化質(zhì)粒菌落為藍(lán)色，插入外源片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子為白色菌落；b.酶切鑒定挑取單菌落于含適當(dāng)抗生素的3ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜提取質(zhì)粒DNA，用適當(dāng)限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切以判斷是否為陽性克??；c.PCR檢測以質(zhì)粒DNA為模板，用特定引物在適當(dāng)條件下做PCR擴(kuò)增反應(yīng)，電泳檢測是否有特異條帶。
實施例2 BcDh2基因5’端調(diào)控區(qū)BcDh2P啟動子的克隆厚葉旋蒴苣苔總DNA分別用BamH I、Bgl II、Bcl I、Xho I和Sal I酶切，連上相應(yīng)的接頭，兩輪PCR后只有經(jīng)過Xho I處理的厚葉旋蒴苣苔總DNA能擴(kuò)增出特異片斷，將該片段瓊脂糖凝膠電泳回收連接到pGEM-T Easy載體上，篩選陽性克隆并測序。染色體步行法得到的BcDh2基因上游調(diào)控區(qū)長為1084bp。將該啟動子驅(qū)動GUS報告基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，通過干旱、寒冷及ABA誘導(dǎo)等不同處理，檢測GUS基因的活性，發(fā)現(xiàn)該啟動子能受干旱、寒冷及ABA的誘導(dǎo)。
操作過程中有關(guān)質(zhì)粒提取、酶切、回收、連接、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、重組質(zhì)粒的酶切鑒定和PCR鑒定均按照實施例1所述步驟進(jìn)行。
實施例3 BcDh2P啟動子驅(qū)動GUS報告基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建通過染色體步行法得到的BcDh2基因上游調(diào)控區(qū)長為1084bp。將該啟動子驅(qū)動GUS報告基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，通過干旱、寒冷及ABA誘導(dǎo)等不同處理，檢測GUS基因的活性，發(fā)現(xiàn)該啟動子能受干旱、寒冷及ABA的誘導(dǎo)。GUS組織染色顯示轉(zhuǎn)基因植株在干旱、寒冷和ABA誘導(dǎo)下起GUS陽性反應(yīng)(染出藍(lán)色)。
實施例4 植物表達(dá)載體pBI121BcDh2的構(gòu)建將連接在pGEM-T Easy載體上的BcDh2基因編碼區(qū)用Nco I和Sac I切下來，連接到用Nco I和Sac I處理過的原核表達(dá)載體pET-30a上，構(gòu)建表達(dá)BcDh2蛋白的質(zhì)粒pET-30aBcDh2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5α菌株，篩選正確的克隆。用Bgl II和Sac I消化質(zhì)粒p30aBcDh2，回收BcDh2片段，將它連接到用BamH I和Sac I消化過的質(zhì)粒pBI121中，形成pBI121BcDh2。
操作過程中有關(guān)質(zhì)粒提取、酶切、回收、連接、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、重組質(zhì)粒的酶切鑒定和PCR鑒定均按照實施例1所述步驟進(jìn)行。
實施例5 植物表達(dá)載體pAHC-BcDh2的構(gòu)建將連接在pGEM-T Easy載體上的BcDh2基因編碼區(qū)用Nco I和Sac I切下來，連接到用Nco I和Sac I處理過的原核表達(dá)載體pET-30a上，構(gòu)建表達(dá)BcDh2蛋白的質(zhì)粒pET-30aBcDh2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5α菌株，篩選正確的克隆。用Bgl II和Sac I消化質(zhì)粒p30aBcDh2，回收BcDh2片段，將它連接到用BamH I和Sac I消化過的質(zhì)粒pAHC25中形成pAHC-BcDh2。
操作過程中有關(guān)質(zhì)粒提取、酶切、回收、連接、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、重組質(zhì)粒的酶切鑒定和PCR鑒定均按照實施例1所述步驟進(jìn)行。
實施例6 植物表達(dá)載體p3ubiBcDh2的構(gòu)建用Apa I切pTRD，補(bǔ)平，用Spe I切下ubiquitin啟動子(2.0kb)，亞克隆到pBluescriptKS(+)EcoR V和Spe I位點間得到質(zhì)粒pBRD；pBRD用Xba I和Sac I消化后，連上用XbaI和Sac I從質(zhì)粒pT-BcDh2上切下的BcDh2(0.7kb)片段得質(zhì)粒pBRDI；用Hind III和Sac I消化pBRDI，回收ubiquitin啟動子和BcDh2基因的融合片段(2.9kb)，將它與HindIII和Sac I消化pCAMBIA3300回收的大片段連接，得到ubiquitin啟動子驅(qū)動BcDh2基因的植物雙元表達(dá)載體p3ubiBcDh2。
操作過程中有關(guān)質(zhì)粒提取、酶切、回收、連接、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、重組質(zhì)粒的酶切鑒定和PCR鑒定均按照實施例1所述步驟進(jìn)行。
實施例7 土壤農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化土壤農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備(1)將土壤農(nóng)桿菌菌株LBA4404接種于含適當(dāng)抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期；(2)4℃，8,000rpm離心5分鐘，收集菌體于小離心管中；(3)用600ul冰預(yù)冷的500mM CaCl2重懸洗滌細(xì)胞；(4)4℃，8,000rpm離心5分鐘，細(xì)胞沉淀中加入200ul冰預(yù)冷的500mM CaCl2，混勻后備用(24hr至48hr使用最佳)；土壤農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化
(1)分別加入約1ug構(gòu)建好的植物表達(dá)載體質(zhì)粒DNA，輕輕混勻，于液氮中速凍5分鐘，然后37℃溫育5分鐘；(2)加入600ul YEB液體培養(yǎng)基，28℃輕搖2-4小時；(3)取200ul菌液均勻涂布于含適當(dāng)抗生素的YEB選擇平板上，28℃倒置培養(yǎng)兩天。挑幾個菌落進(jìn)行PCR檢測，得到陽性菌株。
實施例8 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化及植株再生煙草的遺傳轉(zhuǎn)化采用葉盤法。
葉盤法轉(zhuǎn)化煙草及植株再生(1)接種農(nóng)桿菌單菌落于含適當(dāng)抗生素的2ml YEB液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)1-2天，轉(zhuǎn)接入40ml YEB液體培養(yǎng)基中，28℃繼續(xù)培養(yǎng)至OD600約0.5，8,000g離心10分鐘，菌體用40ml MS液體培養(yǎng)基重新懸浮。
(2)取無菌煙草葉片和不含腋芽的莖段，于MS固體培養(yǎng)基中25℃預(yù)培養(yǎng)一天。
(3)重新取出材料，用剪刀切成小塊放入無菌MS液體培養(yǎng)基稀釋過的農(nóng)桿菌中，浸泡15-20分鐘，其間輕搖幾次。
(4)用無菌濾紙吸去多余菌液，于煙草培養(yǎng)基[MS+BA(0.5)+NAA(0.1)+Km(5.0)+Cb(500)，單位為mg/L]中25℃暗培養(yǎng)兩天。
(5)把材料轉(zhuǎn)入煙草培養(yǎng)基[MS+BA(0.5)+NAA(0.1)+Km(5.0)，單位為mg/L]中，25℃光照培養(yǎng)至分化出愈傷組織，直至長出芽；每14-20天繼代培養(yǎng)一次；(6)將長至3-5cm的芽轉(zhuǎn)入煙草生根培養(yǎng)基[1/2MS培養(yǎng)基]上誘導(dǎo)生根；(7)約2-3周后根系形成，移栽于滅菌的土壤中培養(yǎng)。
PCR檢測和Southern檢測證明BcDh2基因整合到煙草的基因組中，Northern boltting檢測證明BcDh2基因在轉(zhuǎn)基因植物中正常轉(zhuǎn)錄，保水力測定顯示轉(zhuǎn)基因株系比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ毡Ｋγ黠@提高。
實施例9對草坪草和牧草的遺傳轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)法(1)成熟種子用0.1％升汞消毒后，先接于N6基本培養(yǎng)基上，讓其萌動3天，露出小芽時，將胚縱切后轉(zhuǎn)接于誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上，形成愈傷(約30天左右)后，每次挑選色澤鮮、增殖快、質(zhì)地硬的愈傷組織繼代培養(yǎng)。
(2)接種農(nóng)桿菌單菌落于含適當(dāng)抗生素的2ml YEB液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)1-2天，轉(zhuǎn)接入40ml YEB液體培養(yǎng)基中，28℃繼續(xù)培養(yǎng)至OD600約0.5，8,000g離心10分鐘，菌體用40ml MS液體培養(yǎng)基重新懸浮。
(3)重新取出材料，用剪刀切成小塊放入無菌MS液體培養(yǎng)基稀釋過的農(nóng)桿菌中，浸泡15-20分鐘，其間輕搖幾次。
(4)用無菌濾紙吸去多余菌液，于煙草培養(yǎng)基[N6+BA(0.5)+NAA(0.1)+Km(5.0)+Cb(500)，單位為mg/L]中25℃暗培養(yǎng)兩天。
(5)把材料轉(zhuǎn)入煙草培養(yǎng)基[N6+BA(0.5)+NAA(0.1)+Km(5.0)，單位為mg/L]中，25℃光照培養(yǎng)至分化出愈傷組織，直至長出芽；每14-20天繼代培養(yǎng)一次；(6)將長至3-5cm的芽轉(zhuǎn)入煙草生根培養(yǎng)基[1/2MS培養(yǎng)基]上誘導(dǎo)生根；(7)約2-3周后根系形成，移栽于滅菌的土壤中培養(yǎng)。
基因槍法轉(zhuǎn)化過程包括種子或幼穗(包括草坪植物如早熟禾、高羊茅、黑麥草、紫羊茅、剪股潁、結(jié)縷草、狗牙根以及牧草如苜蓿、沙打旺、百脈根、畫眉草、冰草)誘導(dǎo)愈傷組織、基因槍轟擊、抗性愈傷篩選、苗的分化、植株鑒定。
種子誘導(dǎo)愈傷的步驟成熟種子用0.1％升汞消毒后，先接于MS基本培養(yǎng)基上，讓其萌動3天，露出小芽時，將胚縱切后轉(zhuǎn)接于誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上，形成愈傷(約30天左右)后，每次挑選色澤鮮、增殖快、質(zhì)地硬的愈傷組織繼代培養(yǎng)，繼代愈傷可供基因槍轉(zhuǎn)化；幼穗誘導(dǎo)愈傷的步驟取長約0.2～1cm左右的幼穗，用70％乙醇表面消毒后，在超凈臺內(nèi)剝出幼穗，接種于誘導(dǎo)誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，形成愈傷后，每20天繼代培養(yǎng)一次，供基因槍轉(zhuǎn)化；基因槍的轉(zhuǎn)化及苗的分化質(zhì)粒提取的質(zhì)粒濃度調(diào)整為1μg/μL。子彈配制30mg金粉或鎢粉加1mL 100％乙醇旋渦洗滌15分鐘，無菌水洗3次，加500μL 50％甘油備用。取上述鎢或金粉懸液50μL，加5μL DNA，加50μL 2.5M CaCl2，加20μL 0.1M亞精胺，旋渦，冰上靜置15分鐘，離心數(shù)秒，70％乙醇142μL洗一次，離心數(shù)秒，100％140μL乙醇洗一次，離心數(shù)秒，加50μL 100％乙醇，供5槍用。
供試基因槍PDS-1000/He(美國伯樂公司)基因槍可裂膜用1350Psi可裂膜，真空度25 InHg，6cm射擊距離，每皿射擊一槍。槍擊前的愈傷組織在含0.4M甘露醇的繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)4～8小時，槍擊16小時后移入正常繼代培養(yǎng)基。槍擊后的愈傷組織一周后轉(zhuǎn)至含除草劑2-5mg/L的繼代篩選2～4輪，每輪20天。篩選后得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入含50g糖的培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)20天，然后轉(zhuǎn)入去掉2，4-D的分化培養(yǎng)基中分化成苗。當(dāng)小苗長到4-5片葉時，取少量葉片提取植物總DNA，進(jìn)行PCR檢測。小苗長至5～10cm大小時，移入蛭石∶松針土為1∶1的土中，塑料袋保溫一周后，苗即成活。
實施例10 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定與檢測植物基因組DNA的制備(1)稱取0.1g植物葉片或莖組織，于研缽中快速用液氮研至粉末并轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，立即加入500ul的提取緩沖液(500mM NaCl，50mM Tris-Cl PH8.0，50mM EDTA，1％(V/V)β-巰基乙醇)，輕輕混勻；(2)解凍后放置于冰上，加入冰冷20％存貯液PVP(存于-20℃)至終濃度為6％。
(3)加入50ul 20％SDS，輕輕混勻后于65℃水浴10分鐘；(4)加入250ul 5M KAc于冰上反應(yīng)30分鐘，離心(15000rpm，10分鐘，4℃)。
(5)取上相轉(zhuǎn)入一新的離心管，加入0.6倍體積異丙醇，輕輕混勻三次，再置于冰上10分鐘。離心(15000rpm，10分鐘，4℃)，棄去上清；(6)沉淀物抽真空或室溫吹干后，溶解于500ul 1×TE(pH8.0)。用1倍體積的飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提一至兩次，取上相；(7)離心(12000rpm，10分鐘，20℃)，取上相轉(zhuǎn)入一新的離心管；(8)加入1倍體積的異丙醇(20℃，5分鐘)，并將管至少顛倒5次；(9)離心(15000rpm，10分鐘，4℃)，用70％乙醇沖洗沉淀物，抽真空或吹干，最后溶于適量TE(pH8.0)中。
轉(zhuǎn)基因草坪草和牧草的PCR鑒定得到抗生素篩選陽性的轉(zhuǎn)基因草坪草和牧草(早熟禾、高羊茅、黑麥草、紫羊茅、剪股潁、結(jié)縷草、狗牙根、苜蓿、沙打旺、百脈根、畫眉草、冰草)后，在生長初期，取轉(zhuǎn)基因植株葉片并用SDS法提取植株的總DNA進(jìn)行PCR鑒定，以合成的BcDh2基因特異性引物(p15’AGGATCCATATGGAGCCATACGGGAACCA 3’；p25’GGCAG GTATGCTCGGACACA 3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以得到約700bp的條帶，說明BcDh2基因已整合至轉(zhuǎn)基因植株的基因組。(見圖5轉(zhuǎn)基因草坪草和牧草的PCR鑒定)實施例11 轉(zhuǎn)基因植株的Southern檢測
酶切及電泳提取植物總DNA，取10ug用限制性內(nèi)切酶消化過夜，電泳檢測是否酶切完全，以3V/cm恒壓電泳4-6小時。
轉(zhuǎn)膜(1)將凝膠的加樣孔及不含樣品的多余部分切掉，在0.25M HCl中浸泡10分鐘；(2)用蒸餾水稍沖洗后，浸于變性液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)中室溫變性2次，每次15分鐘，其間輕搖數(shù)次；(3)用蒸餾水稍沖洗后，浸于中和液(0.5M Tris.Cl，pH7.4，1.5M NaCl)中于室溫中和2次，每次15分鐘，其間輕搖數(shù)次；(4)用蒸餾水稍沖洗后，浸于10×SSC緩沖溶液中10分鐘，其間輕搖數(shù)次；(5)在一個較大可以密封的容器中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；(6)在該容器底部鋪上4-7cm的吸水紙，在上面鋪三層被10×SSC緩沖溶液微微蘸濕的Whatman 3MM濾紙；(7)凝膠塊切除一角作記號正面朝上放于濾紙上，趕除氣泡；(8)上面鋪五張完全浸潤10×SSC緩沖溶液的Whatman 3MM濾紙，密封容器轉(zhuǎn)膜約4小時；(9)轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將尼龍膜在空氣中晾干，用紫外交聯(lián)儀進(jìn)行交聯(lián)。
探針的標(biāo)記和制備在50ul反應(yīng)體系中加入5ul 10×PCR buffer，各50pmol引物，1ul dNTP，1ul Taq酶，0.1ul DIG-labeled-dUTP，100pg模板DNA。反應(yīng)條件根據(jù)不同的模板稍有變動。反應(yīng)結(jié)束后電泳檢測，標(biāo)記后的探針比沒有標(biāo)記的產(chǎn)物分子量大。95℃煮5分鐘，迅速移至冰水中，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 雜交和檢測(1)將轉(zhuǎn)移后的尼龍膜置于雜交袋中，放于預(yù)雜交液中(10ml/100cm2膜)，趕盡氣泡，68℃保溫4小時；(2)棄去預(yù)雜交液，按2.5ml/100cm2膜的量加入雜交液，雜交液中含DIG標(biāo)記的探針(2ulDIG探針/1ml雜交液)，68℃雜交16小時；(3)用2×漂洗液(2×SSC，0.1％SDS)洗膜2×5分鐘；(4)用0.1×漂洗液(0.1×SSC，0.1％SDS)68℃洗膜2×15分鐘；
(5)將膜在Buffer I(0.15M NaCl，0.1M馬來酸，調(diào)pH＝7.5)中平衡1分鐘；(6)在Buffer II(Buffer I中加入1％封閉劑)中室溫輕搖30分鐘；(7)取anti-DIG-AP，13000rpm離心5分鐘，按1∶2000稀釋于Buffer II中，取20ml該溶液浸泡尼龍膜，室溫輕搖30分鐘。
(8)用20mlBuffer I洗膜2×15分鐘。
(9)在Buffer III(0.1M Tris-HCl pH9.5，0.1M NaCl，0.15M MgCl2)中平衡2-5分鐘；(10)按1∶500把檢測底物稀釋于Buffer III中，把膜在室溫下暗處靜置反應(yīng)，當(dāng)預(yù)期條帶顯現(xiàn)后，立即用Buffer I終止反應(yīng)。
實施例12 轉(zhuǎn)基因株系的保水力測定稱取0.2g轉(zhuǎn)基因和對照樣品置于干燥器中，每3小時(3hr，6hr，9hr)測定其重量，24小時再測定重量。
計算保水力值(1-失水量/鮮重)×100％選取具有除草劑抗性、PCR鑒定和Southern陽性的轉(zhuǎn)基因植株及未轉(zhuǎn)基因?qū)φ者M(jìn)行保水力測定。結(jié)果顯示不同的轉(zhuǎn)基因株系在離體條件下保水力均高于對照(見表1)，6小時后保水力提高20～33％，9小時后保水力提高22～50％。
實施例13 不同轉(zhuǎn)基因草坪草和牧草株系的節(jié)水性試驗將不同轉(zhuǎn)基因草坪草和牧草株系以及未轉(zhuǎn)基因?qū)φ站糜诤蹬镏?防止天然降雨，可通過人工灌溉控制對試驗植物的給水量)，經(jīng)過7～10天的煉苗后同時澆足一次水，之后不再接受天然和人工降水，直到植物葉片開始出現(xiàn)中度萎蔫。測定不同株系萎蔫的天數(shù)，節(jié)水百分比＝[(轉(zhuǎn)基因株系萎蔫天數(shù)—對照株系萎蔫天數(shù))/對照株系萎蔫天數(shù)]×100％統(tǒng)計不同轉(zhuǎn)基因株系的節(jié)水百分比，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ漳芄?jié)水25～40％。(見表2)
表1不同轉(zhuǎn)BcDh2基因植物株系在3、6、9、24小時的保水力3小時6小時9小時24小時CK 83％ 58.5％ 46％ 20％不同株系 93.5％ 71.9％ 60.1％ 24％不同株系 98.4％ 78.6％ 68％ 30.4％不同株系 90％ 65.5％ 54％ 24％表2不同轉(zhuǎn)基因株系的節(jié)水百分比

表3農(nóng)桿菌YEB培養(yǎng)基配方成分每升含量(克)牛肉膏提取物 5.0酵母提取物 1.0蛋白胨 5.0蔗糖 5.0MgSO4.7H2O 0.5瓊脂(固體培養(yǎng)基用) 10
實施例4除用糖蜜替代工業(yè)葡萄糖，細(xì)胞生長階段的pH＝5.2，表達(dá)階段的pH＝4.4外，其他條件與實施例1相同。
以本發(fā)明的碳源和氮源進(jìn)行細(xì)胞生長培養(yǎng)時，細(xì)胞光密度(OD600)可達(dá)400-700，細(xì)胞干重為150g/L以上，達(dá)到高密度發(fā)酵的要求。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的結(jié)果見下表表本發(fā)明細(xì)胞生長碳源和氮源與國內(nèi)外發(fā)明生產(chǎn)植酸酶的比較

六、專利菌種說明此專利涉及的菌種已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，單位地址中國北京中關(guān)村，該微生物分類名稱為大腸埃希氏菌(Escherichia coli(DH5α))，保藏代號為pT-BcDh2，保藏編號為CGMCCNO.0838，保藏日期為2002年11月22日。
總之，本發(fā)明克隆了一個新的脫水素基因BcDh2和其啟動子BcDh2P，并且利用此基因構(gòu)建了多個植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)和基因槍法遺傳轉(zhuǎn)化獲得了耐旱節(jié)水轉(zhuǎn)基因植物。PCR檢測和Southern檢測證明該基因整合到轉(zhuǎn)基因植株基因組中，Northern Blotting檢測證明該基因能在植物中高效表達(dá)，保水力測定和節(jié)水性試驗均證明轉(zhuǎn)基因株系比對照顯著提高了耐旱性，在草坪和牧業(yè)中具有重要意義，并且能夠大規(guī)模放大生產(chǎn)。
<110>林忠平<120>脫水素基因BcDh2及其啟動子在培育耐旱植物中的應(yīng)用<150>CN02153276.1<151>2002-11-26<160>2<210>1<211>402<212>DNA<213>厚葉懸蒴苣苔(Boea crassifolia Hemsl.)<220>
<221>CDS<222>(1)...(402)<400>1atggagccat acgggaacca ccaaattggt gaccaattga ggaagactga tgagtatggc 60aaccccgtcc accacacgcc tggaggagaa tacggcggac ctcatgttgg agccgaacat 120caccatggtg ctcctatttc gattcccccc accaccgatg tcccccacca ccgtcgatcc 180ggcagctcaa gcagctcgtc ttctgaggac gacgggcaag gtggtaggag aaagaagggg 240atcaaggaca aggtcaagga gaagctaccc ggcggccaca aagacaacca gccacatcac 300gaagcgggat acggcggagg ctacggcgcg caaccagaac ctgagaagaa ggggatgatg 360gacaaaatca aggagaaact gcctggcggc caccacaact aa402
<210>2<211>1084<212>DNA<213>厚葉懸蒴苣苔(Boea crassifolia Hemsl.)<220>
<221>Promoter<222>(1)...(1084)<400>2ggatccgtat ggacatttct atactatgaa aatccttttg agtggttcaa cagatgtcgg 60atcgagaaaa agaattttac tgttgacaac tgtcgagttt ggtttgggaa ccatctcaag 120ctaaaatatt tcgaaaagag tttcaagagt ttattcacgt aatttaaatt ctgaacccga 180tcctaacagt gtaagtaaat tcagtagaag tttatatact tcggtgcttg gttgatgaat 240aaatttcgtt gaaaggcaac tgattaaaca aacgtagaac tgaaggtata ttagacctat 300atatccacgt gagtgttcca tgttaagaga aacacaatcc tacacgagtc atgggcactg 360ggcagtctgg aatgggtaga gttgtaattt cacaatattt ccccatcaat ttgatcgatt 420ttgagtttta atctaataaa ttttcaaaat tcgattttaa taaaatattt ttaattttta 480tgcattttga tcaaattatt aatatgacat cgataaatat taaaataaca acgaaaaata 540atgatattac atcgaaaaat actaatatca tataaaatat tgttaagtaa ttagatatca 600catcaaataa gataaataaa ataaccaaaa aaaaatttaa tataccatta ccaactccaa 660aattaaacaa attaataaaa taaaaatatc attttccttt cgctacaaag aaaggtcaat 720atccttcttt cgaaatccag atacatgttt gatatattct attattctat caagtacacg 780tgcccttcta ttcggacaaa ggccaaagtt gcaaaagtac acgtatccta ataaaactta 840gctacgtgtc cacctacttc gctttcatcc gacgcttgtc ctgtccgagc tcattttcta 900ttaccacctt cacactatat atatccctca ctagctcgct ttctatatca cttgtatcac 960gcatcactct atcgaattgg agctatattc acttttgaac atcatttcat tttgaaacga 1020gaaggtacga aggctgatgg agccatacgg gaaccaccaa attggtgacc aattgaggaa 1080gaca 108權(quán)利要求
1.從厚葉旋蒴苣苔中克隆的脫水素基因BcDh2、其5’端調(diào)控區(qū)PBcDh2、部分如序列表所示的核苷酸序列和同源序列、以及利用這些核苷酸序列獲得耐旱轉(zhuǎn)基因植物的方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于該基因編碼一條由133個氨基酸組成的多肽---一個典型的YSK2型脫水素，在氨基末端具有一個Y-區(qū)段，中部為7個絲氨酸組成的S-區(qū)段，羧基末端含有兩個重復(fù)排列的K-區(qū)段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于該基因5’端調(diào)控區(qū)PBcDh2具有序列表所示的1～1084bp序列或其部分序列。
4.適合在植物細(xì)胞中表達(dá)脫水素基因BcDh2的植物表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的植物表達(dá)載體，其中包括說明書中提到的pBI121BcDh2載體、pAHC-BcDh2載體、p3ubiBcDh2載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4和5所述的植物表達(dá)載體，pBI121BcDh2載體的特征在于驅(qū)動BcDh2基因的啟動子為CaMV35S，終止子為Tnos，篩選標(biāo)記為NPTII基因，啟動子為CaMV35S，終止子為CaMV35S polyA。
7.根據(jù)權(quán)利要求4和5所述的植物表達(dá)載體，pAHC-BcDh2載體的特征在于驅(qū)動BcDh2基因的啟動子為Ubiqituin，終止子為Tnos，篩選標(biāo)記為bar基因，啟動子為Ubiqittuin，終止子為Tnos。
8.根據(jù)權(quán)利要求4和5所述的植物表達(dá)載體，p3ubiBcDh2載體的特征在于驅(qū)動BcDh2基因的啟動子為Ubiqituin，終止子為Tnos，篩選標(biāo)記為bar基因，啟動子為Ubiqittuin，終止子為Tnos，目的基因和篩選標(biāo)記基因兩側(cè)有左邊界(Left Border，LB)和右邊界序列(Right Border，RB)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于利用獲得的脫水素基因BcDh2或其啟動子PBcDh2構(gòu)建了植物表達(dá)載體，將這些植物表達(dá)載體直接通過基因槍法或通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入植物細(xì)胞，生長出含有目的基因BcDh2的轉(zhuǎn)基因植株。
10.根據(jù)權(quán)利要求1和9所述的方法，所指的植物是指煙草、早熟禾、高羊茅、黑麥草、紫羊茅、剪股潁、結(jié)縷草、狗牙根、苜蓿、沙打旺、百脈根、畫眉草、冰草。
全文摘要
本發(fā)明克隆了厚葉懸蒴苣苔(Boea crassifoliaHemsl.)一個新的402bp長的脫水素基因及該基因5’端調(diào)控序列1084bp。該基因為脫水素家族YSK
文檔編號A01H5/00GK1544631SQ20031011505
公開日2004年11月10日 申請日期2003年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月26日
發(fā)明者林忠平, 申業(yè), 胡鳶雷, 倪挺 申請人:林忠平