專利名稱：西瓜離體誘變四倍體的方法及倍性早期鑒定技術的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種西瓜離體誘變四倍體的方法及倍性早期鑒定技術。
背景技術：
三倍體無籽西瓜是通過四倍體和二倍體西瓜雜交獲得的。為了獲得優(yōu)良的三倍體無籽西瓜品種，通過二倍體西瓜染色體加倍獲得四倍體材料成為關鍵。自從Kikara于1951年報道了三倍體無籽西瓜育種的研究后，諸多研究者相繼開展了利用秋水仙素(Colchicine)誘導四倍體西瓜的研究。獲得四倍體西瓜主要有以下途徑(1)從自然界中發(fā)掘天然變異。一些自然現(xiàn)象如雷電、空氣、溫度劇變、土壤中的化學物質，使西瓜植株創(chuàng)傷等有時能誘發(fā)四倍體。(2)利用物理方法誘導利用各種射線、異常溫度、超速離心力、高電壓等誘導變異。(3)生物方法如多次摘心、嫁接后在愈傷組織處出現(xiàn)四倍體。(4)利用化學方法誘導利用化學試劑如秋水仙素、苯乙烷、吲哚乙酸、苯及其衍生物、有機砷制劑、有機汞制劑、磺胺劑、及其它植物堿不下200種。
人們通常主要用秋水仙素誘導四倍體西瓜。現(xiàn)有誘導技術主要用整體植株進行誘導。整體植株誘導是用秋水仙素對整體植株生長點誘導?？梢杂幸韵伦龇ńN法；胚芽倒置浸漬法；滴苗法；涂抹法。以上方法要受品種、處理季節(jié)和當時的氣侯條件而定，手續(xù)煩瑣，秋水仙素藥劑處理容易造成幼苗死亡，誘導頻率較低(＜5％＝，并且容易造成嵌合體。
隨著生物技術和植物組織培養(yǎng)技術的發(fā)展，西瓜離體組織細胞染色體加倍有以下途徑(1)利用植物組織培養(yǎng)過程中自發(fā)出現(xiàn)四倍體無性系變異獲得四倍體再生植株。Compton等在西瓜幼胚子葉和無性胚再生的植株中觀察到了四倍體變異，但西瓜再生植株中四倍體頻率則較低，一般在5％左右，其四倍體變異均為非嵌合體。(2)在離體培養(yǎng)過程中用誘導劑對外植體直接誘導，或將經(jīng)外植體誘導的細胞、胚狀體、愈傷組織、不定芽等轉入含有秋水仙素等誘導劑的誘導培養(yǎng)基中，經(jīng)一定時間處理后，再轉入分化培養(yǎng)基、成苗培養(yǎng)基培養(yǎng)成再生變異株，并經(jīng)篩選固定，進行間接誘導。但用秋水仙素作為誘導劑，對離體組織有較強的毒害作用，能明顯抑制不定芽的分化，使其分化的植株生長緩慢，繼代幾次后，在培養(yǎng)中逐漸褐化死亡。對植物產(chǎn)生副作用，諸如不育、產(chǎn)生畸形植株等。象西瓜這樣的草本植物在離體培養(yǎng)過程中其再生能力較差，且在再生培養(yǎng)初期使用秋水仙素會顯著抑制不定芽的再生，給離體加倍帶來許多困難。這就需要更為穩(wěn)定可靠的誘導劑代替秋水仙素進行離體誘導四倍體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過用低毒的二硝基甲苯類除草劑誘導劑代替秋水仙素，研究出簡單有效的早期鑒定和篩選西瓜四倍體的方法，創(chuàng)建一整套快速有效的西瓜離體組織加倍創(chuàng)造四倍體新種質的技術體系，提高西瓜二倍體誘導成四倍體的頻率和數(shù)量，為誘導西瓜四倍體提供一條新的快速有效的途徑。
本發(fā)明的技術方案是一種西瓜離體誘變四倍體的方法及倍性早期鑒定技術，包括以下步驟(1)莖尖培養(yǎng)將二倍體種子去掉種皮，用千分之一升汞消毒10分鐘，無菌水清洗3～5遍，黑暗下浸種8小時，在1/2MS培養(yǎng)基上發(fā)芽，培養(yǎng)8天；(2)誘導處理先將用20-200μmol/L濃度的二硝基苯胺類除草劑-氟樂靈(Trifluralin)或雙丁樂靈(Butralin)或二甲戊樂靈(Pendimethalin)進行過濾滅菌處理，然后將藥液加到液體培養(yǎng)基中(MS+BA2.0mg/L)中；將二倍體西瓜莖尖切下，放在液體培養(yǎng)基(激素及濃度為BA2.25mg/L)中，在25℃的空氣震蕩浴中處理一定時間；(3)分化與繼代培養(yǎng)將藥液中的莖尖取出，放在滅菌水中清洗，用濾紙吸干，放在MS+BA2.25mg/L固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)30天，轉至MS+BA1.5mg/L繼代培養(yǎng)基中繼代2次；(4)生根培養(yǎng)將伸長的幼苗轉至MS+IAA0.5mg/L生根培養(yǎng)基中，生根后取平展的葉片和根尖備用；(5)西瓜倍性早期鑒定把組織葉片放在載玻片上，將0.1％熒光黃(FDA)滴于葉片背面，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下很清楚看出氣孔內(nèi)的葉綠體呈熒光，一對保衛(wèi)細胞內(nèi)葉綠體數(shù)目多于15個初步判斷為四倍體；(6)根據(jù)試驗結果，處理濃度10μmol/L，處理時間6天誘變頻率較高(50-60％)。但不同品種對不同誘導劑反應不同。而秋水仙素處理(CK)在100μmol/L，處理時間9天最高，只有15-23％的誘導頻率；(7)擴繁對初步鑒定的四倍體轉至MS+BA1.5mg/L繼代培養(yǎng)基中擴繁，然后生根移栽。
近年來，通過研究我們發(fā)現(xiàn)二硝基甲苯類除草劑(DNH)也可作為誘導劑，如Amiprophos methyl(APM)、Pronamide、Oryzalin、Trifluralin，此類除草劑的作用是通過干擾紡錘體的機制而抑制細胞分裂中期的有絲分裂，使組織細胞染色體加倍，而且DNH在離體情況下對植物微管蛋白作用比秋水仙素更有效。Oryzalin在低濃度下仍使組織細胞多倍體化是由于Oryzalin和微管蛋白的高親和性(形成Oryzalin-微管蛋白復合體)，更主要的是Oryzalin通過影響Ca2+在微管絲組裝中的作用干擾細胞器的Ca2+運輸系統(tǒng)，這兩種因素共同作用導致Oryzalin更多微管解聚合，最終結果使產(chǎn)生四倍體的比率比秋水仙素作用更有效。
為了獲得有效的誘導西瓜四倍體途徑，對誘導的組織材料進行有效的倍性鑒定是不可缺少的。(1)傳統(tǒng)的方法是用根尖染色體直接計數(shù)法，但在大量的植株需要檢測時，工作量大，繁瑣。(2)根據(jù)葉片保衛(wèi)細胞的大小、單位面積上的氣孔數(shù)及保衛(wèi)細胞中葉綠體的數(shù)目，也可以有效區(qū)分不同西瓜倍性，但由于環(huán)境的影響，方法有時不可靠。(3)可以利用DNA流式細胞測定儀(DNA Flow cytometry)測定組織細胞核DNA含量，根據(jù)其DNA含量在試管苗時期快速有效地進行染色體倍性分析。但儀器使用昂貴費用高。(4)也可以利用植物形態(tài)學鑒定法，不同倍性植株在早期幼苗形態(tài)上有比較明顯的差別，主要表現(xiàn)葉片大、厚且多汁，植株較壯。但經(jīng)驗因素太大。
本發(fā)明的效果應用組織培養(yǎng)進行多倍體誘導與常規(guī)植株誘變方法相比，具有明顯的優(yōu)越性。(1)可以反復大批量地處理植物愈傷組織、叢生芽等，提高誘導成功率；(2)組織培養(yǎng)條件不受季節(jié)等自然條件的影響，可在室內(nèi)進行，誘導條件易于控制，可以大大縮短誘導所需要的時間；(3)組織培養(yǎng)誘變后的植株，用試管苗進行早期倍性鑒定，比田間更直接。(4)利用乙酸鹽熒光黃(FDA)染料涂抹在西瓜離體幼葉的下表皮上，在熒光顯微鏡下觀察保衛(wèi)細胞葉綠體的數(shù)目，根據(jù)熒光葉綠體的數(shù)目進行倍性早期鑒定。該方法簡單直觀，易于操作。(5)用三種二硝基苯胺類誘導劑(Trifluralin，Butralin，Pendimethalin)對西瓜子葉、莖尖、愈傷組織進行誘導，二硝基苯胺類誘導劑比秋水仙素毒性小，誘導頻率高，且成本較低。
具體實施例方式
實施方案 本發(fā)明的技術步驟如上面的方框圖所示1.莖尖培養(yǎng)將二倍體種子去掉種皮，用千分之一升汞消毒10分鐘，無菌水清洗3～5遍，黑暗下浸種8小時，在1/2MS培養(yǎng)基上發(fā)芽，培養(yǎng)8天。
2、誘導處理先將用20-200μmol/L濃度的二硝基苯胺類除草劑-氟樂靈(Trifluralin)或雙丁樂靈(Butralin)或二甲戊樂靈(Pendimethalin)進行過濾滅菌處理，然后將藥液加到液體培養(yǎng)基中(MS+BA2.0mg/L)中；將二倍體西瓜莖尖切下，放在液體培養(yǎng)基(激素及濃度為BA2.25mg/L)中，在25℃的空氣震蕩浴中處理一定時間。
3、分化與繼代培養(yǎng)將藥液中的莖尖取出，放在滅菌水中清洗，用濾紙吸干，放在MS+BA2.25mg/L固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)30天，轉至MS+BA1.0mg/L繼代培養(yǎng)基中繼代2次。
4、生根培養(yǎng)將伸長的幼苗轉至MS+IAA0.5mg/L生根培養(yǎng)基中，生根后取平展的葉片和根尖備用。
5、西瓜倍性早期鑒定把組織葉片放在載玻片上，將0.1％熒光黃(FDA)滴于葉片背面，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下很清楚看出氣孔內(nèi)的葉綠體呈熒光，一對保衛(wèi)細胞內(nèi)葉綠體數(shù)目多于15個初步判斷為四倍體。
6、根據(jù)試驗結果，處理濃度10μmol/L，處理時間6天誘變頻率較高(50-60％)。但不同品種對不同誘導劑反應不同。而秋水仙素處理(CK)在100μmol/L，處理時間9天最高，只有15-23％的誘導頻率。
7、擴繁對初步鑒定的四倍體轉至MS+BA1.5mg/L繼代培養(yǎng)基中擴繁，然后生根移栽。
8、從這個結果得出，用二硝基甲苯類誘導劑離體誘變西瓜四倍體的方法，誘導劑毒性小，處理時間短，誘導頻率高，可以快速擴繁誘導成功的試驗材料，并且易于操作。
權利要求
1.一種西瓜離體誘變四倍體的方法及倍性早期鑒定技術，包括以下步驟(1)莖尖培養(yǎng)將二倍體種子去掉種皮，用千分之一升汞消毒10分鐘，無菌水清洗3～5遍，黑暗下浸種8小時，在1/2 MS培養(yǎng)基上發(fā)芽，培養(yǎng)8天；(2)誘導處理先將用20-200μmol/L濃度的二硝基苯胺類除草劑-氟樂靈(Trifluralin)或雙丁樂靈(Butralin)或二甲戊樂靈(Pendimethalin)進行過濾滅菌處理，然后將藥液加到液體培養(yǎng)基中(MS+BA 2.0mg/L)中；將二倍體西瓜莖尖切下，放在液體培養(yǎng)基(激素及濃度為BA2.25mg/L)中，在25℃的空氣震蕩浴中處理一定時間；(3)分化與繼代培養(yǎng)將藥液中的莖尖取出，放在滅菌水中清洗，用濾紙吸干，放在MS+BA 2.25mg/L固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)30天，轉至MS+BA 1.5mg/L繼代培養(yǎng)基中繼代2次；(4)生根培養(yǎng)將伸長的幼苗轉至MS+IAA 0.5mg/L生根培養(yǎng)基中，生根后取平展的葉片和根尖備用；(5)西瓜倍性早期鑒定把組織葉片放在載玻片上，將0.1％熒光黃(FDA)滴于葉片背面，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下很清楚看出氣孔內(nèi)的葉綠體呈熒光，一對保衛(wèi)細胞內(nèi)葉綠體數(shù)目多于15個初步判斷為四倍體；(6)根據(jù)試驗結果，處理濃度10μmol/L，處理時間6天誘變頻率較高(50-60％)。但不同品種對不同誘導劑反應不同。而秋水仙素處理(CK)在100μmol/L，處理時間9天最高，只有15-23％的誘導頻率；(7)擴繁對初步鑒定的四倍體轉至MS+BA 1.5mg/L繼代培養(yǎng)基中擴繁，然后生根移栽。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種西瓜離體誘變四倍體的方法及倍性早期鑒定技術，它利用二硝基甲苯類除草劑(DNH)代替常用的秋水仙素作為誘導劑，作用是通過干擾紡錘體的機制而抑制細胞分裂中期的有絲分裂，使組織細胞染色體加倍，應用組織培養(yǎng)進行多倍體誘導與常規(guī)植株誘變方法相比，具有明顯的優(yōu)越性。(1)可以反復大批量地處理植物愈傷組織、叢生芽等，提高誘導成功率；(2)組織培養(yǎng)條件不受季節(jié)等自然條件的影響，可在室內(nèi)進行，誘導條件易于控制，可以大大縮短誘導所需要的時間；(3)組織培養(yǎng)誘變后的植株，用試管苗進行早期倍性鑒定，比田間更直接。(4)利用乙酸鹽熒光黃(FDA)染料涂抹在西瓜離體幼葉的下表皮上，在熒光顯微鏡下觀察保衛(wèi)細胞葉綠體的數(shù)目，根據(jù)熒光葉綠體的數(shù)目進行倍性早期鑒定，二硝基苯胺類誘導劑比秋水仙素毒性小，誘導頻率高，且成本較低。
文檔編號A01H1/04GK1631101SQ200310110238
公開日2005年6月29日 申請日期2003年12月22日 優(yōu)先權日2003年12月22日
發(fā)明者劉文革, 閻志紅 申請人:劉文革, 閻志紅