專利名稱：一種培育銀杉菌根苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種培育銀杉菌根苗的方法。
背景技術(shù)：
銀杉(Cathaya argyrophylla Chun et Kuang)是20世紀(jì)50年代在我國發(fā)現(xiàn)的松科單型屬植物，是我國特有的珍稀瀕危植物，有“植物中的大熊貓”之稱。
銀杉主要分布于我國亞熱帶山地，目前，僅在我國廣西，四川，貴州，湖南等地有少量分布。分布區(qū)域狹小，對生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)性差，在分類系統(tǒng)上比較孤立。在自然條件下，銀杉通過種子繁殖，但銀杉的結(jié)實量很少，而且發(fā)芽率也不高，所以銀杉的自然繁殖能力低下。同時，用扦插法或嫁接法繁殖時成活率很低(王伏雄.銀杉生物學(xué).科學(xué)出版社.101.1990；謝宗強.中國特有植物銀杉及其研究.生物多樣性.399-103.1995)。
我國研究人員對瀕危植物-銀杉已進行了一系列的研究工作，特別是對于銀杉的胚胎發(fā)育進行了較全面的研究，發(fā)現(xiàn)銀杉有性生殖周期長，并且在傳粉，受精以及種子發(fā)育過程中遭到不良生境，導(dǎo)致生殖效率低，種子產(chǎn)量極少，嚴(yán)重影響銀杉的天然更新。同時，銀杉是陽性植物，隨著年齡的增加對光照的要求逐漸增強，而銀杉往往與闊葉樹種混生，受到闊葉樹種蔭蔽，導(dǎo)致種群更新不良，數(shù)量下降(王伏雄.銀杉生物學(xué).科學(xué)出版社.101.1990)。
目前，在各銀杉保護區(qū)一般用人工種子繁殖法來繁育銀杉小苗，在一定程度上提高了種子的發(fā)芽率，但是小苗的成活率還是不高。但是目前為止，還沒有找到有效的提高銀杉幼樹生存率，復(fù)壯其種群的方法。
銀杉是典型的松科植物，而絕大多數(shù)的松科植物都是外生菌根植物。外生菌根在植物營養(yǎng)代謝，抗逆境及抗病蟲害方面的功能越來越引起人們的關(guān)注，目前外生菌根技術(shù)在引種、菌根化育苗造林、逆境造林、植物病害防治方面的應(yīng)用都已在許多樹種上取得了初步成效。但是，有關(guān)銀杉菌根的報道還沒有。
目前，在世界上已有不少先例是運用菌根技術(shù)進行造林，如桉樹(Dell B，Malajczuk N and Dunstan WA.Persistence of some Australian Pisolithusspecies introduced into eucalypt plantations in China.Forest Ecology andManagement.169271-281.2002)，樺樹(Fleming LV.Experimental study ofsequences of ectomycorrhizal fungi on birth(Betula SP.)seedling root systems.Soil Biology and Biochemistry.17591-600.1985)。無菌條件下人工菌根苗的誘導(dǎo)是一種非常有效的合成和驗證菌根苗的方法，如在赤松(Yamada A，Maeda K andOhmasa M Ectomycorrhiza formation of Tricholoma matsutake isolates onseedlings of Pinus densiflora in vitro.Mycoscience，40455-463.1999)；桉樹(Chilvers GA，Douglass PA and Lapeyrie FF A paper-sandwich techniquefor rapid synthesis of ectomycorrhizas.New Phytol 103397-402.1986)；歐洲松(Bending GD，Poole EJ，Whipps JM and Read DJ.Characterisation ofbacteria from Pinus sylvestris-Suillus luteus mycorrhizas and theireffects on root-fungus interactions and plant growth.FEMS MicrobiologyEcology，39219-227.2002)；冷杉(Vaario LM，Tanaka M，Ide Y，Gill WM andSuzuki K.In vitro ectomycorrhiza formation between Abies firma and Pisolithustinctorius.Mycorrhiza 9177-183.1999；Vaario LM，Gill WM，Tanaka M，Ide Y andSuzuki K.Aseptic ectomycorrhizal synthesis between Abies firma and Cenococcumgeophilum in artificial culture.Mycoscience，41395-399.2000b；Vaario LM andSuzuki K.Ectomycorrhizal synthesis between Abies firma roots/callus and Laccariabicolor strain S238.Acta Botany Sinica，(in press).2003)；楊樹(Massicotte HB，Melville LH，Peterson RL and Unestam T.Comparative studies of ectomycorrhizaformation in Alnus glutinosa and Pinus resinosa with Paxillus involutus.Mycorrhiza，8229-240.1999；Hampp R，Ecke M，Schaeffer C，Wallenda T，Wingler A，Kottke Iand Sundberg B.Axenic mycorrhization of wild type and transgenic hybrid aspenexpressing T-DNA indoleacetic acid-biosynthetic genes.Trees-Structure andFunction，1159-64.1996)；櫟樹(Diez J，Manjon JL，Kovocs GM，Celestino C andToribio M.Mycorrhization of in vitro plants raised from somatic embryos of corkoak(Quercus suber L).Applied Soil Ecology 15119-123.2000)等樹種上已有不少報道，但對于離體條件下生長困難的樹種來說，成功率并不是很高。主要的技術(shù)障害是無法有效地誘導(dǎo)植物根和菌的同時生長，常造成菌的過剩生長，從而影響植物的生長。菌根菌的篩選、植物體的生長誘導(dǎo)、以及菌根誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選都是人工菌根苗誘導(dǎo)的關(guān)鍵。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種可快速培育銀杉菌根苗的方法。
一種培育銀杉菌根苗的方法，包括以下步驟1)培育苗高為2-6厘米的銀杉小苗；
2)將銀杉小苗和菌根菌土生空團菌(C.geophilum)一同接種于供銀杉菌根合成的培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)得到銀杉菌根苗。
其中，步驟1)中的小苗可由常規(guī)方法得到，為使銀杉種子的萌芽率提高，可按如下方法培育將銀杉種子4℃低溫處理2周-8周后，消毒，在含0.2-0.8％葡萄糖，其中優(yōu)選為含0.5％葡萄糖的瓊脂培養(yǎng)基中在23±2℃，光照周期為16h/8h，光照強度為4000lux條件下無菌培養(yǎng)1-14天，以3-5天為佳，將種子胚乳的外周切開1/3-1/5，繼續(xù)無菌培養(yǎng)得到苗高為2-6厘米的銀杉小苗。按上述方法培養(yǎng)的種子萌芽率可從4％提高到60％以上。
所述適合銀杉菌根合成的培養(yǎng)基優(yōu)選為RM(Vaario LM，Guerin-laguette A，Matsushita N，Suzuki K and Lapeyrie F(2002)Saprobic potential of Tricholomamatsutakegrowth over bark treated with surfactants.Mycorrhiza 12(1)1-6)培養(yǎng)基。
因過多的碳源會引起菌根菌自我生長過剩，從而影響共生體的形成，所以，所述RM培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度為0.05-1.0g/l，優(yōu)選為0.1-0.3g/l。
步驟3)中的培養(yǎng)條件為在18-26℃，光照周期為14-18h/10-6h，2000-6000lux光強，其中，優(yōu)選為在23±2℃，光照周期為16h/8h，4000lux光照強度，將上述接種于適合銀杉菌根合成的培養(yǎng)基中的銀杉苗根部避光培養(yǎng)4-6周。
本發(fā)明通過組織培養(yǎng)法誘導(dǎo)銀杉無菌小苗、進行培養(yǎng)基和外生菌根菌的篩選，并對傳統(tǒng)的用于菌根合成的paper-sandwish方法進行改良，找到同時適合銀杉幼苗與外生菌根菌生長的培養(yǎng)條件，成功地建立起銀杉快速人工菌根苗的誘導(dǎo)法。這一方法為拯救銀杉種群，打下了一個良好的研究平臺。本發(fā)明的方法誘導(dǎo)效率高，操作簡便，適合推廣應(yīng)用，具有顯著的社會效益、經(jīng)濟效益和生態(tài)效益。


圖1為土生空團菌(C.geophilum)分別在MMN和RM培養(yǎng)基上的菌落生長速率曲線。
圖2為土生空團菌(C.geophilum)分別在MMN和RM培養(yǎng)基上培養(yǎng)43天的菌絲體干重柱狀圖。
圖3為土生空團菌(C.geophilum)和銀杉發(fā)芽2個月的小苗共培養(yǎng)接種示意圖。
圖4A為銀杉菌根的照片。
圖4B為銀杉菌根橫切片的顯微鏡照片。
具體實施例方式
實施例1、銀杉菌根苗的培育
1、銀杉種子的發(fā)芽誘導(dǎo)將采于廣西大瑤山銀杉種子4度低溫處理4周后，首先用洗劑輕輕搓洗，隨后用流水沖洗數(shù)小時。70％酒精表面消毒30秒，用30％過氧化氫溶液浸泡30分鐘，然后移入無菌濾紙上涼干。最后，培養(yǎng)在含0.5％葡萄糖的瓊脂培養(yǎng)基中。培養(yǎng)室的溫度，光照條件為23±2℃，16小時光照，光照強度為4000lux。培養(yǎng)3天后，在超凈工作臺內(nèi)，用解剖刀將種子的胚乳切開，以種子胚乳的外周切開1/3-1/5為佳，然后再培養(yǎng)在相同培養(yǎng)基上。10-20天，銀杉的胚根，胚芽開始萌發(fā)。經(jīng)過上述處理，種子的萌芽率從4％提高到60％以上。移入培養(yǎng)基A，進行小苗生長的誘導(dǎo)。5-7周，可以得到苗高2-3厘米的銀杉小苗。
2、適合銀杉菌根誘導(dǎo)的外生菌根菌的篩選將苗高為3-4厘米的銀杉小苗培養(yǎng)于100ml三角燒瓶MMN斜面培養(yǎng)基上，分別接上外生菌根菌Cenococcum geophilum，Pisolithus tinctorius，Boletus edulis，Russula foetens。將培養(yǎng)燒瓶下部用錫箔紙包上，培養(yǎng)于23±2℃，16小時光照，光照強度為4000lux的培養(yǎng)室。培養(yǎng)1個月后，對于銀杉的生長進行觀察。B.edulis以及R.foetens菌生長過剩，一個月后，菌絲體覆蓋整個銀杉小苗，使小苗枯死。而P.tinctorius生長速度較B.edulis，R.foetens，慢，但還是很快蓋過銀杉小根。C.geophilum的生長速度適中，銀杉小苗生長能與此共存。
3、適合銀杉菌根合成培養(yǎng)基的篩選菌種土生空團菌(C.geophilum)培養(yǎng)基MMN培養(yǎng)基和RM培養(yǎng)基，分別含有0.1％葡萄糖和1.2％瓊脂。
培養(yǎng)從生長在MMN(Marx，DH，(1969)The influence of ectotrophic mycorrhizalfungi on the resistance of pine roots to pathogenic infections.I.Antagonism ofmycorrhizal fungi to root pathogenic fungi and soil bacteria.Phytopathology 59153-163.)培養(yǎng)基上(約一個月)的C.geophilum菌落上，從外往內(nèi)地切割直徑為6厘米的接種塊，分別接種在MMN及RM培養(yǎng)基上，每隔一周進行菌落直徑的測定，第6周時，用80度溫水洗脫法，將菌落洗脫，60℃烘箱中烘干一宿，測其干重。
結(jié)果表明，菌絲體趨于在RM培養(yǎng)基的表面或淺層平鋪生長，菌絲體的生長速率如圖1所示，表明在同樣的生長期內(nèi)，生長在RM培養(yǎng)基上的菌落的直徑遠遠大于生長在MMN培養(yǎng)基上的，有利于與植物根形成最大面積的接觸。培養(yǎng)6周后菌絲體的干重比較如圖2所示，表明在RM培養(yǎng)基和MMN培養(yǎng)基上培養(yǎng)6周后的菌絲體干重并不存在統(tǒng)計學(xué)上的差異。RM培養(yǎng)基被選為菌根合成用培養(yǎng)基。表1和表2中的數(shù)值為5個重復(fù)的平均值。
4、銀杉菌根的合成菌種土生空團菌(C.geophilum)植物銀杉發(fā)芽2個月的小苗(苗高為4厘米)接種方法如圖3所示。
接種培養(yǎng)將平板培養(yǎng)皿的下部2/3部分包上錫箔紙以避光，放置在23±2℃，16小時光照，光照強度為4000lux處培養(yǎng)。每周進行細根的顯微鏡觀察。3-4周后，能觀察到細根的周邊的黑色菌絲體，5-6周后，形成明顯的黑色菌套(圖4A)。通過石蠟切片法觀察結(jié)果如圖4B所示，發(fā)現(xiàn)銀杉-土生空團菌(C.geophilum)的菌根外形(黑色的菌套及外延菌絲)和明顯的皮層中哈啼氏(Hartig)網(wǎng)，確認為菌根形成。
權(quán)利要求
1.一種培育銀杉菌根苗的方法，包括以下步驟
1)培育苗高為2-6厘米的銀杉小苗；
2)將銀杉小苗和菌根菌土生空團菌(C.geophilum)一同接種于供銀杉菌根合成的培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)得到銀杉菌根苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟1)中所述苗高為2-6厘米的銀杉小苗可按如下方法培育將銀杉種子4℃低溫處理2-8周后，消毒，在含0.2-0.8％葡萄糖的瓊脂培養(yǎng)基中在23±2℃，光照周期為16h/8h，光照強度為4000lux條件下無菌培養(yǎng)無菌培養(yǎng)1-14天后，將種子胚乳的外周切開1/3-1/5，繼續(xù)無菌培養(yǎng)得到苗高為2-6厘米的銀杉小苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述葡萄糖的含量為0.5％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述供銀杉菌根合成的培養(yǎng)基為RM培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述RM培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度為0.05-1.0g/l。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述葡萄糖的濃度為0.1-0.3g/l。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)銀杉菌根苗的條件為在18-26℃，光照周期為14-18h/10-6h，2000-6000lux光強下，根部避光培養(yǎng)4-6周。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)溫度為23±2℃，所述光照周期為16h/8h，所述光照強度為4000lux。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培育銀杉菌根苗的方法，目的是提供一種可快速培育銀杉菌根苗的方法。本發(fā)明所提供的培育銀杉菌根苗的方法，包括以下步驟1)培育苗高為2－6厘米的銀杉小苗；2)將銀杉小苗和菌根菌土生空團菌(C.geophilum)一同接種于供銀杉菌根合成的培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)得到銀杉菌根苗。本發(fā)明的方法誘導(dǎo)效率高，操作簡便，適合推廣應(yīng)用，具有顯著的社會效益、經(jīng)濟效益和生態(tài)效益。
文檔編號A01H17/00GK1620855SQ20031010389
公開日2005年6月1日 申請日期2003年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月24日
發(fā)明者傅祿敏, 李玉花, 邢樹堂, 謝宗強, 倫志明 申請人:中國科學(xué)院植物研究所, 東北林業(yè)大學(xué)