專利名稱：利用d－氨基酸的選擇性植物生長(zhǎng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有外源遺傳物質(zhì)的植物細(xì)胞、植物組織或維管植物的選擇性生長(zhǎng)。
植物需要大量的氮作為礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)素。植物生長(zhǎng)，特別是在農(nóng)業(yè)中，通常受到可獲得氮量的限制。
傳統(tǒng)上一直認(rèn)為植物僅能利用銨和/或硝酸鹽作為氮源。這些化合物要么由如有機(jī)氮的礦化和共生的原核生物固氮作用的自然過程提供，要么通過施用含有經(jīng)工業(yè)固定的氮的肥料提供。
然而最近的研究表明，植物也可以利用某些有機(jī)氮化合物以及無機(jī)氮(Nholm，T.等(1998)，Nature，392914-916；Nholm，T.等，(2000)，Ecology，811155-1161；Nholm，T.和Persson，J.(2001)，Physiol Plant，111419-426；Lipson，D.和Nholm，T.(2001)，Oecologia 128305-316)。特別是，從土壤中吸收和代謝氨基酸似乎是植物的普遍特征。
在所有用作構(gòu)建蛋白質(zhì)的氨基酸中，發(fā)現(xiàn)除一種氨基酸(甘氨酸)外所有的氨基酸均具有兩種異構(gòu)體形式，這兩種異構(gòu)體利用其旋轉(zhuǎn)偏振光的能力進(jìn)行區(qū)分。自然界中使光左旋的異構(gòu)體的量最多，并將其命名為L(zhǎng)-或左旋的，而較少見的異構(gòu)體形式命名為D-或右旋的。
雖然在自然界中存在D-氨基酸，但它們僅以極低的濃度存在，并且僅存在于如細(xì)菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)的特定化合物中(如在化合物肽葡聚糖中)。
盡管植物氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)D-和L-兩種形式的氨基酸的運(yùn)輸(Soldal，T.和Nissen，P.(1978)，Physiol.Plant.43181-188，Boorer，K.J.等.1996.J.Biol.Chem 2712213-2220，Montamat等，1999，Plant Mol.Biol.41259-268)，但是植物缺乏將D-氨基酸轉(zhuǎn)換成在可用于植物體內(nèi)合成反應(yīng)的氮形式所必需的酶。因此植物不能利用D-氨基酸作為氮源。
然而細(xì)菌、真菌和動(dòng)物中普遍存在著代謝D-氨基酸的能力。導(dǎo)致生物體內(nèi)D-氨基酸分解代謝的幾種反應(yīng)已得到描述(參見圖2)(Friedman，M(1999)J.Agric.Food Chem.473457-3479，Pilone，M.S.(2000)CMLS 571732-1747，Yurimoto等，(2000)Yeast 16(13)1217-1227)。
本發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，表達(dá)編碼代謝D-氨基酸的酶的異源基因的植物能夠利用該D-氨基酸作為氮源，并能夠在不能使野生型植物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
通常，僅需要一種D-氨基酸代謝酶即可將D-氨基酸轉(zhuǎn)換成可參與普通植物氮代謝路徑的化合物(即非右旋化合物)。例如，可應(yīng)用D-絲氨酸脫水酶將D-絲氨酸轉(zhuǎn)換成氨、丙酮酸和水，可應(yīng)用D-氨基酸氧化酶將D-氨基酸轉(zhuǎn)換成氨、酮酸(由D-氨基酸底物決定)和過氧化氫。因此，組成D-氨基酸的否則無法利用的氮能被酶促轉(zhuǎn)化成植物可易于利用的形式。
本發(fā)明的一個(gè)方面是提供了一種包含有編碼具D-氨基酸代謝活性的多肽的序列的分離核酸，該序列可操作地連接到一種或多種植物特異的調(diào)節(jié)元件。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，分離核酸可由編碼具有D-氨基酸代謝活性的多肽的序列和一種或多種與該序列可操作地連接的植物特異的調(diào)節(jié)元件組成。
在一些實(shí)施方案中，D-氨基酸可用作選擇性標(biāo)記。上述的分離核酸可進(jìn)一步包含編碼目的多肽的異源核酸序列。例如，該多肽的表達(dá)可以有利方式改變植物的表型或產(chǎn)生其它有利的影響。具有D-氨基酸代謝活性的多肽的表達(dá)允許包含該異源核酸序列的轉(zhuǎn)化株的有效篩選，如此處所描述的。
具有D-氨基酸代謝活性的多肽意指這樣的多肽，所述多肽將D-氨基酸底物轉(zhuǎn)化成的產(chǎn)物用作內(nèi)源植物酶的底物(即該底物可由植物進(jìn)行代謝)。由植物進(jìn)行代謝的產(chǎn)物包括非右旋化合物，即非手性或L-化合物。因此，D-氨基酸代謝多肽催化D-氨基酸底物向產(chǎn)物的生物化學(xué)轉(zhuǎn)化，所述產(chǎn)物如非右旋產(chǎn)物，這些產(chǎn)物可以被植物用作營(yíng)養(yǎng)源，特別是用作氮源。
適宜的D-氨基酸代謝多肽可為真核生物酶，例如來于酵母(例如纖細(xì)紅酵母(Rhodotorula Gracilis))、真菌或動(dòng)物的酶，或?yàn)樵松锩?，例如來于?xì)菌如大腸桿菌的酶。代謝D-氨基酸的適宜多肽的示例在表1和表2中顯示。
如上所述，還未報(bào)道在植物內(nèi)發(fā)現(xiàn)內(nèi)源的D-氨基酸代謝活性。
用于D-氨基酸代謝多肽的底物可為D-arg、D-glu、D-ala、D-asp、D-cys、D-gln、D-his、D-ile、D-leu、D-lys、D-met、D-asn、D-phe、D-pro、D-ser、D-thr、D-trp、D-tyr或D-val。
其它作為D-氨基酸代謝酶的適宜底物包括非蛋白的右旋氨基酸、右旋氨基酸前體及右旋氨基酸衍生物。此類底物僅在由D-氨基酸代謝酶使之轉(zhuǎn)化成適宜的可代謝形式之后才可能被用作植物氮源。適宜的前體包括D-鳥氨酸和D-瓜氨酸。
優(yōu)選地用于D-氨基酸代謝多肽的底物為D-ser，D-asn，D-ala，D-ile，D-glu，D-arg，D-lys，D-his或D-asp中的一種，更優(yōu)選地為D-ala，D-ile或D-ser。
在D-氨基酸中非手性酰胺基團(tuán)的存在可能導(dǎo)致少量的植物生長(zhǎng)，這是由于該基團(tuán)通常能夠由植物代謝并用作氮源。例如，在含D-gln的培養(yǎng)基上，內(nèi)源的谷氨酸合成酶作用于非手性酰胺基團(tuán)并產(chǎn)生D-glu。因?yàn)樵摲鞘中曰钚缘漠a(chǎn)物是其它的自身不能被內(nèi)源的植物酶代謝的D-氨基化合物，利用這些D-氨基酸生長(zhǎng)的生長(zhǎng)速率很低，盡管一些氮是可用的。
D-氨基酸代謝多肽可為如氧化酶、消旋酶、脫羧酶、轉(zhuǎn)氨酶、脫水酶(也稱作氨裂解酶)。氧化酶催化D-氨基酸轉(zhuǎn)化成NH4+、酮酸(取決于D-氨基酸底物)和H2O2(參見圖2)。消旋酶將D-氨基酸轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的L-氨基酸形式。L-氨基酸可用作植物氮源。脫羧酶將D-氨基酸轉(zhuǎn)化成可由植物代謝的γ-氨基酸。轉(zhuǎn)氨酶將D-氨基酸轉(zhuǎn)化成不同的L或D氨基酸形式。L-氨基酸能直接被代謝，而D-氨基酸則需進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成可代謝的形式。脫水酶催化D-氨基酸轉(zhuǎn)化成NH4+、酮酸(取決于D-氨基酸底物)和H2O(參見圖2)。適宜的氧化酶、消旋酶、脫羧酶、轉(zhuǎn)氨酶和脫水酶的示例在表1和表2中顯示。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，D-氨基酸代謝多肽為脫水酶，例如D-ser氨裂解酶(以前稱作D-ser脫水酶)，或?yàn)檠趸?，如D-氨基酸氧化酶。
采用常規(guī)技術(shù)，技術(shù)人員能夠容易地確定多肽是否具有D-氨基酸代謝活性(即其為D-氨基酸代謝酶)，如上所述。
適宜的D-氨基酸代謝多肽也包括該多肽的片段、突變體、衍生物、變體和等位基因，所述多肽在表1和表2進(jìn)行示例。
適宜的片段、突變體、衍生物、變體和等位基因保留了D-氨基酸代謝多肽的功能特性，即其催化D-氨基酸底物轉(zhuǎn)化成植物可代謝形式的反應(yīng)。產(chǎn)生突變體、變體或衍生物的序列變化可為核酸中一處或多處一個(gè)或多個(gè)核苷酸的添加、插入、缺失或替換，導(dǎo)致所編碼多肽中出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的添加、插入、缺失或替換。當(dāng)然，也包括不使所編碼氨基酸的序列發(fā)生變化的核酸改變。
代謝D-氨基酸底物的多肽可包含與表1或表2中所示序列的同一性大于約30％、大于約35％、大于約40％、大于約45％、大于約55％、大于約65％、大于約70％、大于約80％、大于約90％或大于約95％的氨基酸序列。該序列與表1或表2中所示序列的相似性可大于約30％、大于約40％、大于約50％、大于約60％、大于約70％、大于約80％或大于約90％。
序列相似性和同一性，通常參考GAP(Genetics Computer Group，麥迪遜，WI)算法進(jìn)行定義。GAP用Needleman和Wunsch算法進(jìn)行兩條完整序列的比對(duì)，以達(dá)到最大匹配數(shù)和最小化缺口(gap)數(shù)。通常應(yīng)用默認(rèn)參數(shù)，其缺口創(chuàng)建罰分＝12，缺口延伸罰分＝4。
盡管應(yīng)用GAP為優(yōu)選，但也可應(yīng)用其它算法，例如BLAST(該算法應(yīng)用Altschul等，(1990)J.Mol.Boil.215405-410的方法)、FASTA(該算法應(yīng)用Pearson和Lipman，(1988)PNAS USA 852444-2448的方法)或Smith-Waterman算法(Smith和Waterman(1981)J.Mol.Boil.147195-197)或前述的Altschul等人(1990)的TBLASTN程序，所述程序通常應(yīng)用默認(rèn)參數(shù)。特別是，可應(yīng)用psi-Blast算法(Nucl.AcidsRes.(1997)25 3389-3402)。
相似性允許“保守變異”，例如將如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或蛋氨酸的疏水殘基替換為另一疏水殘基，或?qū)⒁粯O性殘基替換為另一極性殘基，如精氨酸替換為賴氨酸、谷氨酸替換為天冬氨酸或谷氨酰胺替換為天冬酰胺。特定的氨基酸序列變體可能與此處描述的已知多肽的序列不同，所述變體通過插入、添加、替換或缺失1、2、3、4、5-10、10-20、20-30、30-50或多于50個(gè)氨基酸而形成。
植物特異的調(diào)控序列或元件是指相對(duì)于其它細(xì)胞類型而言優(yōu)選地指導(dǎo)植物細(xì)胞內(nèi)核酸表達(dá)(即轉(zhuǎn)錄)的序列。
例如，該序列在非植物細(xì)胞如細(xì)菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)可降低或失效。例如，適宜的調(diào)控序列可來自植物病毒如花椰菜花葉病毒35(Cauliflower Mosaic Virus 35)。
調(diào)控序列優(yōu)選地異源或外源于編碼D-氨基酸代謝酶的基因。這種調(diào)控序列可在植物細(xì)胞內(nèi)提供有效的表達(dá)。
術(shù)語“異源的”可用于指出所研究的核苷酸基因/序列已導(dǎo)入到該植物細(xì)胞或其祖先，所述導(dǎo)入利用基因工程或重組方法，也即通過人工干預(yù)進(jìn)行。
對(duì)植物細(xì)胞而言異源的或外源的核苷序列在所述類型、品系或種類的細(xì)胞內(nèi)可為非天然存在。例如，未見報(bào)道植物細(xì)胞內(nèi)含有D-氨基酸代謝酶(即將D-氨基酸轉(zhuǎn)化成植物可代謝形式的酶)，且因此編碼具有該活性的多肽的核酸對(duì)于用其進(jìn)行轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞而言是“異源的”。
除了與編碼D-氨基酸代謝多肽的基因異源的調(diào)控序列之外，核酸可包含一個(gè)或多個(gè)源自D-氨基酸代謝多肽的內(nèi)源啟動(dòng)子的順式元件。
“啟動(dòng)子”意指這樣的核苷酸序列，即該序列可啟動(dòng)與其可操作地連接的下游(即雙鏈DNA有意鏈上的3’方向)DNA的轉(zhuǎn)錄。
“可操作地連接”是指作為同一核酸分子的一部分進(jìn)行連接、置于適宜的位置并正確導(dǎo)向以使其可由啟動(dòng)子啟動(dòng)而進(jìn)行轉(zhuǎn)錄?？刹僮鞯剡B接到啟動(dòng)子的DNA置于啟動(dòng)子的“轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)調(diào)節(jié)之下”。
適宜的調(diào)節(jié)元件可包括與核酸編碼序列可操作地連接的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。本發(fā)明也提供了用該基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞和方法，所述方法包括將該構(gòu)建體導(dǎo)入植物細(xì)胞和/或誘導(dǎo)構(gòu)建體在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，例如通過施用適宜的刺激而實(shí)現(xiàn)。
本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員充分理解用于啟動(dòng)子的術(shù)語“可誘導(dǎo)的”。本質(zhì)上而言，對(duì)施加的刺激(該刺激可為細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生或外源提供)作出響應(yīng)時(shí)在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的表達(dá)得以“打開”或增加。在不同啟動(dòng)子間刺激的本質(zhì)存在差異。無論缺乏刺激時(shí)的表達(dá)水平如何，在恰當(dāng)?shù)拇碳ご嬖跁r(shí)，源自任何誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的表達(dá)均得以提高。優(yōu)選的情形是，在有效量的相關(guān)刺激存在下的表達(dá)水平提高改變了表型特征，即增強(qiáng)D-氨基酸的耐受。因此誘導(dǎo)型(或“可開啟的”)啟動(dòng)子可用于在缺乏刺激時(shí)引起基礎(chǔ)水平的表達(dá)，所述水平太低(且實(shí)際上有可能為零)以至于不能導(dǎo)致產(chǎn)生所需的D-氨基酸耐受表型。在施加刺激后，表達(dá)提高(或開啟)到可引起D-氨基酸耐受增強(qiáng)的水平。
誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的多種示例為本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員已知。
其它的適宜啟動(dòng)子可包括實(shí)際上在所有植物組織中均以高水平表達(dá)的花椰菜花葉病毒35S(CaMV 35S)基因啟動(dòng)子(Benfey等，(1990)EMBO J91677-1684)；在蔬菜頂端分生組織及一些植物體的局限部位如內(nèi)韌皮部、花原基、根和新芽的發(fā)枝點(diǎn)表達(dá)的花椰菜meri 5啟動(dòng)子(Medford，J.I.(1992)Plant Cell 4，1029-1039；Medford等，(1991)Plant Cell 3，359-370)，以及在花發(fā)育非常早期表達(dá)的鼠耳芥LEAFY啟動(dòng)子(Weigel等，(1992)細(xì)胞(Cell)69，843-859)。其它示例在下述出版物的第120頁(yè)公開，Lindsey和Jones(1989)，“農(nóng)學(xué)植物生物技術(shù)(PLANT BIOTECHNOLOGY inAGRICULTURE)”，OU Press出版，Milton Keynes，英國(guó)。
本發(fā)明提供了包含如上所述的核酸的載體，例如質(zhì)粒或病毒表達(dá)載體。
如此處所描述的，從編碼核酸表達(dá)具有D-氨基酸代謝活性的多肽可被用于篩選含有如此處描述的核酸構(gòu)建體或載體的轉(zhuǎn)化株。
在一些實(shí)施案例中，載體另外包括由嵌合基因組成的選擇性遺傳標(biāo)記，所述嵌合基因賦予載體可選擇的表型，例如抗生素的抗性，如卡那霉素、潮霉素、膦絲菌素、綠黃隆(chlorsulfuron)、氨甲蝶呤、慶大霉素、壯觀霉素、咪唑啉酮類和草甘膦抗性。如果需要，除應(yīng)用D-氨基酸代謝多肽的表達(dá)進(jìn)行篩選之外，上述標(biāo)記允許進(jìn)行二級(jí)篩選。
本發(fā)明的另一方面提供了如此處所描述的核酸在產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。該方法可允許進(jìn)行下述轉(zhuǎn)基因植物的篩選或選擇性繁殖，所述轉(zhuǎn)基因植物包含外源遺傳物質(zhì)或可用于提高植物對(duì)D-氨基酸的耐受。優(yōu)選地通過將植物或植物細(xì)胞培養(yǎng)在下述的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，所述培養(yǎng)基具有包含D-氨基酸的詳細(xì)定義的氮含量，即培養(yǎng)基中的氮全部或部分以D-氨基酸形式存在。
培養(yǎng)基中D-氨基酸的特性通過植物或植物細(xì)胞表達(dá)的異源D-氨基酸代謝多肽的專一性確定，即培養(yǎng)基含有異源D-氨基酸代謝多肽的D-氨基酸底物。例如，當(dāng)植物表達(dá)異源D-絲氨酸脫水酶時(shí)，培養(yǎng)基中需存在D-絲氨酸。
根據(jù)本發(fā)明的核酸可提供為從自然環(huán)境中分離和/或純化而獲得的核酸，為相當(dāng)純的或均質(zhì)的形式，或其不含或基本不含來源于該物種的其它核酸。這里用到的術(shù)語“分離的”包含所有的這些可能性。
當(dāng)然，核酸可為雙鏈或單鏈的cDNA、基因組DNA或RNA。因此可在適宜的條件下在適宜的宿主植物細(xì)胞內(nèi)由編碼核酸進(jìn)行表達(dá)制備表達(dá)產(chǎn)物。
核酸分子可為全部或部分合成的分子。特別是，核酸分子可為重組體，其中在自然中并不共同存在(并非鄰近存在)的核酸序列已經(jīng)被連接或人工組合。備選地，可直接合成核酸分子，例如應(yīng)用自動(dòng)合成儀進(jìn)行合成。
本領(lǐng)域內(nèi)那些技術(shù)人員能夠很好地構(gòu)建載體，并為重組基因表達(dá)設(shè)計(jì)方案，特別是在植物細(xì)胞內(nèi)中的表達(dá)?？蛇x擇或構(gòu)建包含適宜調(diào)控序列的適宜載體，所述調(diào)控序列包括啟動(dòng)子序列、終止子片斷、聚腺苷酸化序列、增強(qiáng)子順序、標(biāo)記基因和其它適宜的序列。更多的細(xì)節(jié)參見，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)第三版，Sambrook和Russell，2001，冷泉海港實(shí)驗(yàn)室出版(Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
“載體”定義為其中包括雙鏈或單鏈的線型或環(huán)型的任何質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或農(nóng)桿菌雙元載體，載體可是或不是可自身傳遞的或可移動(dòng)的，且其可轉(zhuǎn)化原核或真核宿主，特別是植物宿主，所述轉(zhuǎn)化通過整合到細(xì)胞基因組中或存在于染色體外(例如具有復(fù)制起點(diǎn)的自主復(fù)制質(zhì)粒)實(shí)現(xiàn)。
特別地包括穿梭載體，該載體是指其天然具有或通過設(shè)計(jì)而具有在兩種不同生物體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的能力的DNA載體，該載體可篩選自于放線菌及相關(guān)物種、細(xì)菌和真核(例如高等植物、哺乳動(dòng)物、酵母或真菌)細(xì)胞。
用于操縱核酸的多種已知技術(shù)和方法如核酸構(gòu)建體的制備、誘變、測(cè)序、將DNA導(dǎo)入細(xì)胞以及基因表達(dá)和蛋白分析在以下中詳細(xì)描述，分子生物學(xué)方法(Protocols in Molecular Biology)，第二版，Ausubel等編輯，JOHN WILEY & SONS，1992。
Bevan等(Bevan等，核酸研究(Nucl Acids Res.)(1984)12，8711-8721)以及Guerineau和Mullineaux(Guerineau和Mullineaux(1993)植物轉(zhuǎn)化與表達(dá)載體，在Plant Molecular Biology Labfax(Croy RRD編輯)牛津，BIOS Scientific Publishers，121-148頁(yè))描述了之前已用于植物并獲得廣泛成功的具體方法和載體。
當(dāng)將核酸構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，必須考慮為本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員所熟知的因素。必須有可將該構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞的可用方法。一旦該構(gòu)建體位于細(xì)胞膜內(nèi)，將發(fā)生或不發(fā)生與內(nèi)源染色體物質(zhì)的整合。D-氨基酸代謝基因的表達(dá)產(chǎn)物可定向于細(xì)胞內(nèi)的特定小室，例如過氧化物酶體或胞質(zhì)，也或者產(chǎn)物在細(xì)胞的任何地方表達(dá)。最后，就植物而言，靶細(xì)胞類型必須是能夠再生成整個(gè)植株的細(xì)胞。
可應(yīng)用本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員熟知的技術(shù)將核酸構(gòu)建體和載體導(dǎo)入植物細(xì)胞以產(chǎn)生具有適當(dāng)D-氨基酸耐受表型的轉(zhuǎn)基因植物。
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化是本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員廣泛應(yīng)用的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞特別是雙子葉物種植物細(xì)胞的方法。對(duì)幾乎所有的經(jīng)濟(jì)學(xué)相關(guān)的單子葉植物，其穩(wěn)定、可繁殖的轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生目前均為常規(guī)操作(Toriyama等，(1988)BIO/TECHNOLOGY 6，1072-1074；Zhang等，(1988)Plant Cell Rep.7，379-384；Zhang等，(1988)Theor Appl Genet 76，835-840；Shimamoto等，(1989)Nature 338，274-276；Datta等，(1990)BIO/TECHNOLOGY8，736-740；Christou等，(1991)BIO/TECHNOLOGY 9，957-962；Peng等，(1991)國(guó)際水稻研究所(International Rice Research Institute)，菲律賓馬尼拉，563-574；Cao等，(1992)Plant Cell Rep.11，585-591；Li等，(1993)Plant Cell Rep.12，250-255；Rathore等，(1993)植物分子生物學(xué)(Plant Molecular Biology)21，871-884；Fromm等，(1990)BIO/TECHNOLOGY 8，833-839；Gordon-Kamm等，(1990)植物細(xì)胞(Plant Cell)2，603-618；D′Halluin等，(1992)植物細(xì)胞(Plant Cell)4，1495-1505；Walters等，(1992)植物分子生物學(xué)(Plant MolecularBiology)18，189-200；Koziel等，(1993)Biotechnology 11，194-200；Vasil，I.K.，(1994)植物分子生物學(xué)(Plant Molecular Biology)25，925-937；Weeks等，(1993)植物生理學(xué)(Plant Physiology)102，1077-1084；Somers等，(1992)BIO/TECHNOLOGY 10，1589-1594；WO92/14828)。特別是，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化目前是一種高效的用于單子葉植物的轉(zhuǎn)化方法(Hiei等.(1994)植物學(xué)雜志(The Plant Journal)6，271-282)。
本發(fā)明的諸方面提供了用于該轉(zhuǎn)化方法的表達(dá)載體和包含該表達(dá)載體的根瘤農(nóng)桿菌，所述表達(dá)載體為卸甲農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒。
用此方法已在谷物大米、玉米、小麥、燕麥和大麥中產(chǎn)生了可繁殖的轉(zhuǎn)基因植物(參見Shimamoto，K.(1994)Current Opinion in Biotechnology5，158-162.；Vasil等，(1992)BIO/TECHNOLOGY 10，667-674；VAIN等，1995，Biotechnology Advances 13(4)653-671；Vasil，1996，NatureBiotechnology 14，702頁(yè))。Wan和Lemaux(1994)植物生理學(xué)(PlantPhysiol.)10437-48中描述了能夠用于產(chǎn)生大量獨(dú)立轉(zhuǎn)化的可繁殖大麥植物的技術(shù)。
當(dāng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率低或無效時(shí)，可優(yōu)選應(yīng)用其他方法，如微投射或粒子轟擊(US 5100792，EP-A-444882，EP-A-434616)、電穿孔(EP 290395，WO 8706614)、顯微注射(WO 92/09696，WO 94/00583，EP 331083，EP175966，Green等.(1987)植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)(Plant Tissue and CellCulture)，學(xué)院出版社(Academic Press)、直接的DNA攝入(DE 4005152，WO 9012096，US 4684611)、脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA攝入(例如Freeman等，植物細(xì)胞生理學(xué)(Plant Cell Physiol)，291353(1984))或渦旋方法(如Kindle，PNAS U.S.A.871228(1990d))。
特別地，可應(yīng)用粒子轟擊技術(shù)進(jìn)行裸子植物如針葉樹的轉(zhuǎn)化(Clapham，D.等.2000.Scan.J.For.Res.15151.160)。用于植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的物理方法在Oard，(1991)Biotech.Adv.91-11中綜述。
備選地，可應(yīng)用不同技術(shù)的組合來提高轉(zhuǎn)化方法的效率，例如用農(nóng)桿菌包被的粒子轟擊(EP-A-486234)或用微投射轟擊來誘導(dǎo)產(chǎn)生傷口隨后與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)(EP-A-486234)。
轉(zhuǎn)化后，可由如單細(xì)胞、愈傷組織或葉盤進(jìn)行植物再生，上述為領(lǐng)域內(nèi)的表標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。幾乎所有的植物均可通過其細(xì)胞、組織和器官獲得完全再生?？蓱?yīng)用的技術(shù)在以下中綜述，Vasil等，植物的細(xì)胞培養(yǎng)與體細(xì)胞遺傳學(xué)(Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants)，第I、II和III卷，實(shí)驗(yàn)方法及其應(yīng)用(Laboratory Procedures and TheirApplications，)，學(xué)院出版社，1984以及WEISSBACH與Weissbach，植物分子生物學(xué)方法(Methods for Plant Molecular Biology)，學(xué)院出版社，1989。
具體轉(zhuǎn)化技術(shù)的選擇由其轉(zhuǎn)化靶植物種的效率以及掌握特定方法的使用者的經(jīng)驗(yàn)及偏愛決定。對(duì)技術(shù)人員而言顯而易見的是，將核酸導(dǎo)入植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的特定選擇并非本發(fā)明的關(guān)鍵或限制，對(duì)植物再生技術(shù)的選擇也是如此。
本發(fā)明的另一方面提供了產(chǎn)生細(xì)胞特別是產(chǎn)生植物細(xì)胞的方法，該方法包括應(yīng)用轉(zhuǎn)化方法將分離的核酸或含該核酸的載體摻入細(xì)胞，所述核酸包含與植物特異調(diào)控序列可操作地連接的編碼D-氨基酸代謝多肽的序列。這種產(chǎn)生細(xì)胞的方法可包括該核酸與細(xì)胞基因組核酸的重組以將該核酸穩(wěn)定摻入其中。植物可由此處描述一個(gè)或更多個(gè)經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中再生。
D-氨基酸代謝多肽、編碼核酸和/或包含核酸的載體可與用其轉(zhuǎn)染的細(xì)胞異源，即為外源的。
產(chǎn)生植物細(xì)胞的方法可包括表達(dá)核酸以及引起或允許由其表達(dá)的D-氨基酸代謝多肽在該植物細(xì)胞的胞質(zhì)、過氧化物酶體、葉綠體和/或其它胞內(nèi)小室內(nèi)進(jìn)行積聚。
制備該植物細(xì)胞的方法可包括將該核酸序列或包括該核酸的適宜載體導(dǎo)入植物細(xì)胞并引起或允許在載體與植物細(xì)胞基因組間發(fā)生重組以將核酸序列導(dǎo)入基因組內(nèi)。
方法還可進(jìn)一步包括有性或無性繁殖或產(chǎn)生由上述植物細(xì)胞再生的植物的下一代或后裔。
本發(fā)明進(jìn)一步包含經(jīng)上述的核酸序列或載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，即細(xì)胞包含以上描述的核酸或載體，宿主細(xì)胞特別地為植物細(xì)胞如高等植物細(xì)胞，或微生物植物細(xì)胞。因此，提供了包含如此處所述的核苷酸序列的宿主細(xì)胞，如植物細(xì)胞。在細(xì)胞內(nèi)，核苷酸序列可整合到染色體，也可能位于染色體之外。每個(gè)單倍染色體可能存在不只一種的異源核苷酸序列。例如，與內(nèi)源水平相比前述情形可提高基因產(chǎn)物的表達(dá)，如下所述。植物細(xì)胞內(nèi)包含編碼序列的核酸可位于植物特異的調(diào)控元件的調(diào)控之下，例如所述調(diào)控元件為外部可誘導(dǎo)的基因啟動(dòng)子以將表達(dá)置于使用者的控制之下。
D-氨基酸代謝多肽可存在于植物細(xì)胞的胞質(zhì)、過氧化物酶體或其它細(xì)胞內(nèi)小室。通過下述方法可獲得D-氨基酸代謝多肽的小室區(qū)域化，所述方法將編碼D-氨基酸代謝多肽的核酸序列與編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列融合以產(chǎn)生融合蛋白。不含有該轉(zhuǎn)運(yùn)肽的基因表達(dá)產(chǎn)物通常在胞質(zhì)內(nèi)積聚。
穩(wěn)定整合到植物基因組上的核酸一代又一代地遺傳給植物后代，后代細(xì)胞可表達(dá)所編碼的D-氨基酸代謝多肽，并因此可增強(qiáng)對(duì)D-氨基酸的耐受。
將核酸序列導(dǎo)入祖先細(xì)胞的結(jié)果是，植物細(xì)胞可包含與植物特異調(diào)控元件可操作地連接的編碼D-氨基酸代謝多肽的核酸序列。
此處所描述的植物細(xì)胞可包含在植物、植物部分、植物繁殖體、植物提取物或衍生物之內(nèi)，如下所述。
本發(fā)明也提供了包含如此處所描述的植物細(xì)胞的植物，以及提供了該植物的任何部分或繁殖體、種子、自花受精或雜交的后代及后裔。本發(fā)明特別提供了轉(zhuǎn)基因單子葉植物、雙子葉植物、裸子植物以及藻類、蕨類和蘚類。其中值得關(guān)注的是轉(zhuǎn)基因高等植物尤其是農(nóng)作物和森林作物，例如谷類、樹木和觀賞花卉，這些植物均經(jīng)過改造以攜帶有上述的核酸構(gòu)建體。
適宜的植物的示例包括煙草、葫蘆、胡蘿卜、蔬菜蕓苔、瓜類、辣椒、葡萄藤、萵苣、草莓、油種蕓苔、甜菜、小麥、大麥、玉米、大米、大豆、豌豆、高粱屬植物、向日葵、番茄、土豆、胡椒、菊、香石竹、白楊、桉樹、棉花、亞麻籽、大麻、云杉、樺樹、花生、黑麥和松樹。
根據(jù)本發(fā)明的植物可在一種或多種特性上不為純育?？蓪⒁恍┲参镒兎N排除在外，特別是根據(jù)植物繁殖條款(Plant Breeders Rights)可注冊(cè)的植物變種。有人指出，不應(yīng)僅因?yàn)橹参锘蚪M內(nèi)穩(wěn)定含有由于導(dǎo)入植物細(xì)胞或其祖先而存在的轉(zhuǎn)基因就將該植物判定為“植物變種”。
除了植物，本發(fā)明提供了該植物、種子、自花受精體或雜交后代及后裔的任意克隆，以及上述任何一項(xiàng)中的任意部分或繁殖體如插條及種子，可用于有性或無性的繁殖或再生。本發(fā)明也包含由該植物、該植物的任意部分或繁殖體、后代、克隆或后裔經(jīng)有性或無性繁殖而獲得的后代、克隆或后裔。
本發(fā)明的其它方面提供了應(yīng)用D-氨基酸選擇性地培養(yǎng)、再生或繁殖包含如上所述的異源D-氨基酸代謝多肽的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物組織或維管植物。
產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法可包括用包含編碼多肽的序列的核酸或載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述多肽代謝如這里所述的D-氨基酸底物；以及在包含特定氮源的培養(yǎng)基上將細(xì)胞再生為植物，其中所述的特定性氮源包含該D-氨基酸底物或由其組成。
經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞能夠利用存在于培養(yǎng)基中的D-氨基酸作為氮源。未經(jīng)轉(zhuǎn)化或不含具有D-氨基酸代謝活性多肽的細(xì)胞不能利用這種氮源，且因此細(xì)胞的生長(zhǎng)受到限制。此外，培養(yǎng)基中的D-氨基酸對(duì)未轉(zhuǎn)化的植物(該植物不具有D-氨基酸代謝活性)可能具有毒性作用。
培養(yǎng)基中適合用作D-氨基酸代謝酶底物的適宜D-氨基酸可包括D-arg、D-ser、D-glu、D-ALA、D-asp、D-cys、D-gln、D-his、D-ile、D-leu、D-lys、D-met、D-phe、D-pro、D-asn、D-thr、D-trp、D-tyr和D-val。優(yōu)選地應(yīng)用D-ser、D-ala、D-glu、D-asn、D-arg、D-lys、D-His或D-asp其中之一，更優(yōu)選地應(yīng)用D-ala或D-ser。這些D-氨基酸對(duì)于不含有適宜D-氨基酸代謝酶的植物來說具有毒性。
用于D-氨基酸代謝酶的其它適宜底物包括非蛋白氨基酸、氨基酸前體及氨基酸衍生物。
氮通常是農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中限制植物生長(zhǎng)的元素。對(duì)于表達(dá)代謝D-氨基酸的酶的轉(zhuǎn)基因植物而言，應(yīng)用下述組合物作為優(yōu)選的或可選擇的肥料，所述組合物中的部分或全部氮含量以一種或多種D-氨基酸的形式存在(即肥料的氮含量部分或全部為一種或多種D-氨基酸的形式)。不表達(dá)該酶的非轉(zhuǎn)基因植物從該肥料組合物中的獲益將降低。在一些實(shí)施方案中，D-氨基酸對(duì)該植物具有毒性并明顯阻礙或限制其生長(zhǎng)。例如，D-ser對(duì)野生型植物具有毒性(圖3)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了用作下述轉(zhuǎn)基因植物的選擇性培育的組合物；所述轉(zhuǎn)基因植物包含此處描述的代謝D-氨基酸底物的多肽；所述組合物包含該D-氨基酸底物。
組合物中氮含量的全部或部分可為D-氨基酸底物形式(即其為組合物中的唯一氮源或多種氮源之一)。組合物中以D-氨基酸形式存在的可用氮的比例可為0.1％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。
適合用于組合物中的D-氨基酸底物包括D-arg、D-ser、D-glu、D-ala、D-asp、D-cys、D-gln、D-his、D-ile、D-leu、D-lys、D-met、D-phe、D-pro、D-asn、D-thr、D-trp、D-tyr或D-val。
優(yōu)選地應(yīng)用D-ser、D-ala、D-glu、D-arg、D-lys、D-his、D-asn或D-asp其中之一，更優(yōu)選地應(yīng)用D-ala或D-ser。這些D-氨基酸對(duì)于不含有代謝該D-氨基酸的異源多肽的植物來說具有毒性，因而起到既促進(jìn)目標(biāo)植物的生長(zhǎng)又抑制不需要的植物生長(zhǎng)的“雙重”作用。
用于D-氨基酸代謝多肽的其它適宜底物包括非蛋白D-氨基酸、D-氨基酸前體和D-氨基酸衍生物。
產(chǎn)生如上所述的肥料的方法可包括提供缺乏或?qū)嵸|(zhì)上缺乏氮源的植物肥料組合物，以及將該組合物與此處描述的D-氨基酸底物混合。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了含有如上所述的D-氨基酸的選擇性除草劑組合物。
該除草劑將抑制或限制不含有適宜D-氨基酸代謝酶的植物的生長(zhǎng)，而能夠代謝D-氨基酸的轉(zhuǎn)基因植物的生長(zhǎng)將不會(huì)受到影響，或優(yōu)選地，生長(zhǎng)得到提高或促進(jìn)。
組合物可包含0.1％(w/w)或更多、1％(w/w)或更多、5％(w/w)或更多、10％(w/w)或更多、15％(w/w)或更多、20％(w/w)或更多、25％(w/w)或更多、30％(w/w)或更多的D-氨基酸。
該除草劑組合物可用于控制植物生長(zhǎng)的方法中，所述方法包括應(yīng)用該組合物處理一種或多種植物。
產(chǎn)生該除草劑組合物的方法可包括將D-氨基酸與基質(zhì)、載體或賦形劑混合物。
用于農(nóng)業(yè)特別是除草劑組合物中的適宜基質(zhì)、載體或賦形劑為本領(lǐng)域內(nèi)公知。
D-氨基酸通過氨基酸氧化酶代謝產(chǎn)生過氧化氫(H2O2)。該化合物用作植物中誘導(dǎo)防御反應(yīng)的信號(hào)。該反應(yīng)通常由環(huán)境壓力引發(fā)，所述環(huán)境壓力如過量光線、寒冷或病原體感染。
含D-氨基酸氧化酶的植物對(duì)添加的D-氨基酸作出響應(yīng)，產(chǎn)生增加的H2O2并由此觸發(fā)防御反應(yīng)。這就提供這樣的一種機(jī)制，即通過該機(jī)制植物的防御反應(yīng)可由培養(yǎng)者特異地觸發(fā)。將D-氨基酸添加到表達(dá)D-氨基酸氧化酶基因的植物內(nèi)，導(dǎo)致內(nèi)源的H2O2產(chǎn)物突現(xiàn)，該產(chǎn)物在這些植物內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生正常的防御反應(yīng)。當(dāng)將植物從戶內(nèi)移動(dòng)到戶外環(huán)境時(shí)培養(yǎng)者可引發(fā)該防御反應(yīng)以提高植物的逆境耐性，當(dāng)存在霜凍害危險(xiǎn)時(shí)可引發(fā)該防御反應(yīng)以增加植物的冰凍耐性，當(dāng)已知害蟲和病原體積聚或處于其它的情況時(shí)，植物體內(nèi)積極防御反應(yīng)具有潛在好處。
產(chǎn)生具有可誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植物的方法可包括將編碼D-氨基酸氧化酶的核酸序列轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；以及由該植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物。
刺激轉(zhuǎn)基因植物的逆境耐性的方法可包括在該植物內(nèi)表達(dá)氧化D-氨基酸底物的多肽；以及用D-氨基酸底物處理該植物。
適宜的D-氨基酸氧化酶多肽在以上描述并在表1和表2中示例。
適當(dāng)劑量的D-氨基酸刺激應(yīng)激反應(yīng)而不引起永久的細(xì)胞損害。盡管精確劑量根據(jù)植物類型、生長(zhǎng)階段、土壤類型、溫度和氣候條件的不同而存在差異，但也可容易地由技術(shù)人員應(yīng)用常規(guī)方法學(xué)測(cè)定出用于特定情形的劑量。
在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，可應(yīng)用高水平的D-氨基酸誘導(dǎo)逆境耐性，例如培養(yǎng)基中的D-氨基酸濃度為從0.1到50mM，更優(yōu)選地從1到10mM。
與正常的、未處理的植物相比，逆境耐性的改善可提高或增強(qiáng)對(duì)環(huán)境壓力的耐性，所述環(huán)境壓力如紫外線UV輻射、極端溫度、輻射和/或病原體感染，如細(xì)菌或真菌感染，特別是引起壞死的病原體的感染。
如果存在下述情況則如上所述的由D-氨基酸氧化酶產(chǎn)生的H2O2或D-氨基酸代謝產(chǎn)物的積聚對(duì)轉(zhuǎn)基因植物可能是有害的，即如果產(chǎn)率高和/或如果產(chǎn)物產(chǎn)生在對(duì)H2O2或其它代謝產(chǎn)物敏感的細(xì)胞小室內(nèi)時(shí)。
因此本發(fā)明的方法可用于從混合群體中選擇性地移除轉(zhuǎn)基因植物，或甚至從天然群體中移除轉(zhuǎn)基因植物與野生型間的雜合體。
如此處描述的使表達(dá)氧化D-氨基酸底物的多肽的轉(zhuǎn)基因植物的生長(zhǎng)或生存能力受到抑制的方法可包括用D-氨基酸底物處理該植物。
D-氨基酸氧化酶在過氧化物酶體內(nèi)的定位表達(dá)使得產(chǎn)生的H2O2能夠可迅速由H2O2降解酶即過氧化氫酶代謝掉。因此需要高水平的D-氨基酸以產(chǎn)生破壞性水平的H2O2。在過氧化氫酶活性較低的胞質(zhì)內(nèi)，D-氨基酸氧化酶的表達(dá)降低了所需的產(chǎn)生有破壞性水平H2O2的D-氨基酸的量。
可通過移除編碼核酸序列中的過氧化酶體靶向信號(hào)或轉(zhuǎn)運(yùn)肽來獲得D-氨基酸氧化酶在胞質(zhì)內(nèi)的表達(dá)。
因此添加D-氨基酸可用于抑制或降低其胞質(zhì)內(nèi)具有D-氨基酸氧化酶活性的轉(zhuǎn)基因植物的生長(zhǎng)或生存能力。
在此描述的使得表達(dá)氧化D-氨基酸底物的多肽的轉(zhuǎn)基因植物的生長(zhǎng)或生存能力受到抑制的方法可包括引起或允許在該植物胞質(zhì)內(nèi)積聚該多肽；以及用D-氨基酸底物處理該植物。
下述D-氨基酸特別適用于該方法，即該D-氨基酸對(duì)野生型植物呈現(xiàn)出低毒性，但當(dāng)其在含有外源D-氨基酸氧化酶的轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)進(jìn)行代謝之后導(dǎo)致產(chǎn)生H2O2產(chǎn)物或其它的有毒代謝產(chǎn)物，所述D-氨基酸如D-ile、D-asn或D-gln。
可在此處描述的方法中進(jìn)行適宜的對(duì)照試驗(yàn)。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員具有足夠的能力來進(jìn)行適宜的對(duì)照試驗(yàn)。
由本公開來看，本發(fā)明的多種進(jìn)一步的方面和實(shí)施方案對(duì)于那些領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員而言是顯而易見的。本說明書中所有提及的文件在此全部引入作為參考。
本發(fā)明的某些方面和實(shí)施方案將通過以下描述的實(shí)施例和圖的參考進(jìn)行闡述。


圖1顯示鼠耳芥植物在無菌瓊脂培養(yǎng)基上且提供以不同的N源生長(zhǎng)20天的鮮重。對(duì)照植物不提供任何氮源進(jìn)行培養(yǎng)。
圖2顯示生物體內(nèi)D-氨基酸的潛在代謝轉(zhuǎn)化的示例。
圖3顯示野生型植物(Wt；黑色柱)和經(jīng)編碼細(xì)菌酶D-絲氨酸脫水酶的細(xì)菌基因轉(zhuǎn)化的植物(dsdA21，淺灰色柱)的鮮重，前述植物培養(yǎng)在無菌瓊脂上并提供以帶有(MS)或不帶有(MS-N)標(biāo)準(zhǔn)氮源、硝酸鹽的不同濃度(2.5，30，3和0.3mM)的D-絲氨酸。
圖4顯示萌芽后培養(yǎng)14天所收獲的鼠耳芥的生物量(a)與氮含量(b)。植物培養(yǎng)于除了D-絲氨酸外不含其它氮源的半強(qiáng)度MS培養(yǎng)基上。空白柱為表達(dá)dsdA的轉(zhuǎn)基因植物，陰影柱為野生型植物。柱代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝4。
圖5顯示萌芽后培養(yǎng)鼠耳芥14天所收獲的生物量(a)與氮含量(b)。植物培養(yǎng)在3mM硝酸鹽作為基本N源并以不同的D-絲氨酸濃度作為改良的半強(qiáng)度MS培養(yǎng)基上?？瞻字鶠楸磉_(dá)dsdA的轉(zhuǎn)基因植物，陰影柱為野生型植物。柱代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝4。
表1和表2顯示具有可根據(jù)本發(fā)明使用的具有D-氨基酸代謝活性的多肽的例子。
實(shí)驗(yàn)方法鼠耳芥屬轉(zhuǎn)化應(yīng)用引物5’-AATGGATCCTCATCTAAGCGCAAAGAGACGTACTATGG和5’-ATTGGATCCATGCTGCGTTGAAACGTTATTAACGG通過PCR擴(kuò)增大腸桿菌基因dsdA(D-絲氨酸脫水酶(D-絲氨酸脫氨酶)[EC4.3.1.18]NCBI編號(hào)J01603)。將PCR產(chǎn)物亞克隆到pT-easy(Promega)中并用DYEnamics循環(huán)測(cè)序試劑盒(Amersham Pharmacia biotech)進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)用數(shù)據(jù)庫(kù)序列進(jìn)行的比對(duì)分析確認(rèn)成功獲得了dsdA的全長(zhǎng)克隆。隨后將克隆連接到雙元載體pPCV702Km的CAMV 35S表達(dá)盒的BamH1位點(diǎn)以產(chǎn)生載體pPCV702dsdA，其中所述雙元載體為根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的卸甲Ti-質(zhì)粒。用核酸內(nèi)切酶對(duì)該載體的限制性分析確定了插入方向。
鼠耳芥植物，生態(tài)型Col-0，用根瘤農(nóng)桿菌菌株(GV3101pMP90 RK)通過真空浸潤(rùn)轉(zhuǎn)化(Clough，S.J.和Bent，A.F.植物雜志(Plant Journal)，16，735-743(1998))。在含卡那霉素的平板上篩選轉(zhuǎn)化子，并應(yīng)用Northern印跡在分子水平上進(jìn)行確認(rèn)。應(yīng)用轉(zhuǎn)基因特性純合的品系進(jìn)行所有的分析。
表達(dá)D-氨基酸氧化酶的轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建與上述dsdA植物基本相同，改變之處在于以下述cDNA文庫(kù)作為模板通過PCR克隆源自酵母菌中纖細(xì)紅酵母(Rhodosporidium toruloides)的daol基因(EC1.4.3.3NCBIU60066)，所述文庫(kù)從在含D-丙氨酸培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)以誘導(dǎo)靶基因表達(dá)的酵母中進(jìn)行制備。PCR引物為5’-ATTAGATCTTACTACTCGAAGGACGCCATG和5’-ATTAGATCTACAGCCACAATTCCCGCCCTA。
用另一套引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中的一條引物位于如上列出的開放讀碼框5’末端的外側(cè)且和3′引物不包括最后6個(gè)核苷酸。后9個(gè)核苷酸編碼信號(hào)肽SKL，該信號(hào)肽將蛋白質(zhì)引導(dǎo)到過氧化物酶體亞細(xì)胞器上。
產(chǎn)生的擴(kuò)增序列所編碼的蛋白質(zhì)具有相同的氨基酸序列在其在細(xì)胞內(nèi)的定位不同。不帶有信號(hào)肽的截短多肽在胞質(zhì)中表達(dá)，而全長(zhǎng)多肽在過氧化物酶體表達(dá)。
植物培養(yǎng)來自未經(jīng)轉(zhuǎn)化植物和經(jīng)D-絲氨酸氨裂解酶轉(zhuǎn)化的植物鼠耳芥種子用70％乙醇和0.1％吐溫80進(jìn)行10分鐘的表面消毒并用95％乙醇快速漂洗。每個(gè)平板上接種10粒種子，而后培養(yǎng)皿用空氣透過型帶密封。生長(zhǎng)培養(yǎng)基為半強(qiáng)度MS(Murashige，T.和Skoog，F(xiàn).Physiol Plant 15，310-313(1962))(含0.5％(W/V)蔗糖和0.8％(W/V)瓊脂)，培養(yǎng)基加有或不加有3mM硝酸鹽作為氮源。培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌后，將過濾除菌的D-絲氨酸加入到培養(yǎng)基中。植物萌芽后以16小時(shí)光周期于24℃培養(yǎng)14天。從培養(yǎng)皿中取出植物，在0.5mM的CaCl2中漂洗3次，然后于40℃干燥48小時(shí)，之后測(cè)干重。干燥植物的N含量用元素分析儀(PerkinElmer 2400CHN)進(jìn)行測(cè)定。測(cè)量基于每個(gè)平板的生物量和氮含量，且每個(gè)平板有10株植物。對(duì)6種單獨(dú)的轉(zhuǎn)基因品系在D-絲氨酸上的生長(zhǎng)能力進(jìn)行評(píng)估，盡管根據(jù)RNA印跡分析發(fā)現(xiàn)dsdA轉(zhuǎn)錄水平存在相當(dāng)大的變化，但未在品系間發(fā)現(xiàn)實(shí)質(zhì)性差異。
用于云杉轉(zhuǎn)化時(shí)，表達(dá)載體具有含35S表達(dá)盒的pUC8骨架，所述表達(dá)盒具有dsdA和用于basta篩選目的的pUbi-Bar(泛素啟動(dòng)子，具有賦予basta抗性的Bar基因)盒。應(yīng)用的轉(zhuǎn)化方法為細(xì)胞懸液的粒子轟擊法。
結(jié)果D-氨基酸對(duì)野生型植物生長(zhǎng)的影響觀察野生型鼠耳芥植物應(yīng)用不同氮源在無菌瓊脂培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)。結(jié)果在
圖1中顯示。觀察到培養(yǎng)于D-氨基酸培養(yǎng)基上的植物很少或沒有生長(zhǎng)。
對(duì)來自茄(Solanum esculentum)、大麥(Hordeum vulgare)、玉米(Zea mays)、山楊(Populus tremuloides)、煙草(Nicotiana tabacum)和鼠耳芥的種子進(jìn)行表面消毒，并在瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)2到3周，其中所述的瓊脂培養(yǎng)基與上述無硝酸鹽培養(yǎng)基完全相同并補(bǔ)充以0、0.3、3和30mM的D-絲氨酸。觀察到番茄(Lycopersicon esculentum)、山楊、煙草和鼠耳芥的生長(zhǎng)在培養(yǎng)基中D-絲氨酸濃度為3mM時(shí)受抑制，而玉米和大麥的生長(zhǎng)則在30mM時(shí)受抑制。
觀察了D-絲氨酸和幾種其它的D-氨基酸對(duì)野生型鼠耳芥和其它物種的生長(zhǎng)抑制。對(duì)于鼠耳芥，生長(zhǎng)培養(yǎng)基中D-絲氨酸濃度為0.3mM時(shí)觀察到明顯的生長(zhǎng)抑制，且濃度為3mM時(shí)生長(zhǎng)完全受到抑制(圖2)。
歐洲云杉(Picea abies)的體胚細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物應(yīng)用其濃度范圍為0、0.3、3和30mM的D-絲氨酸進(jìn)行培養(yǎng)。D-絲氨酸在3mM及高于3mM對(duì)細(xì)胞是致死性的。發(fā)現(xiàn)在含3mM D-絲氨酸的D-絲氨酸培養(yǎng)基上篩選經(jīng)dsdA-轉(zhuǎn)化的胚芽是可能的。
這些結(jié)果證明了D-氨基酸對(duì)于野生型植物的除草劑特性。
表達(dá)大腸桿菌D-絲氨酸氨裂解酶的鼠耳芥用大腸桿菌基因dsdA轉(zhuǎn)化鼠耳芥，所述基因編碼D-絲氨酸氨裂解酶[EC4.3.1.18]并位于CAMV 35S啟動(dòng)子控制之下。D-絲氨酸氨裂解酶將D-絲氨酸轉(zhuǎn)化成容易被植物利用的產(chǎn)物銨、丙酮酸和水，且經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物能夠以D-絲氨酸作為其唯一N源進(jìn)行生長(zhǎng)。
表達(dá)編碼D-絲氨酸脫水酶的基因的轉(zhuǎn)基因鼠耳芥植物在無菌瓊脂上與野生型植物一同培養(yǎng)20天，所述瓊脂培養(yǎng)基為標(biāo)準(zhǔn)MS培養(yǎng)基并補(bǔ)充以不同濃度D-絲氨酸(30mM、3mM、0.3mM)作為唯一N源，對(duì)照則不含任何氮源。
觀察到在缺乏氮的對(duì)照培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)基因和野生型植物均為最小生長(zhǎng)。觀察到轉(zhuǎn)基因植物的生長(zhǎng)和N含量隨著D-絲氨酸濃度增加都顯著提高(方差分析，p＜0.0001)(圖4a，b)。未觀察到野生型植物生長(zhǎng)的提高(圖3)。在存在基礎(chǔ)水平硝酸鹽的情況下，轉(zhuǎn)基因植物的生長(zhǎng)和N含量隨著D-絲氨酸濃度的增加也得以顯著提高(P＜0.0001)，而野生型植物存在相反的反應(yīng)(圖5)。這表明D-絲氨酸對(duì)于野生型植物具有毒性作用，而對(duì)轉(zhuǎn)基因植物則無毒。在觀察的D-Ser范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)基因植物未表現(xiàn)出中毒癥狀。
無論轉(zhuǎn)基因植物是否施加基礎(chǔ)供應(yīng)量的硝酸鹽，其對(duì)于增加D-絲氨酸濃度所作出的相關(guān)生長(zhǎng)反應(yīng)是類似的(圖4a和5a)。然而，在既提供D-絲氨酸又提供硝酸鹽的植物中，植物N含量的相應(yīng)反應(yīng)提高(圖4b和5b)。在相同濃度時(shí)，植物在硝酸鹽上的生長(zhǎng)顯著高于在D-絲氨酸上的生長(zhǎng)(圖4a和5a)。然而，在3mM的D-絲氨酸上生長(zhǎng)的植物的N濃度顯著低于在3mM硝酸鹽上生長(zhǎng)的植物(ANOVA，p＜0.0001)。在D-絲氨酸上較低生長(zhǎng)的原因還不清楚，但D-絲氨酸培養(yǎng)植物的N濃度相對(duì)較低可能提示與硝酸鹽相比該N形式的吸收率較低。
通過在一周內(nèi)往土壤中生長(zhǎng)的鼠耳芥種苗上噴灑3次30mM的D-絲氨酸，也成功篩選出轉(zhuǎn)基因鼠耳芥植物。
表達(dá)大腸桿菌D-谷氨酸消旋酶的鼠耳芥表達(dá)大腸桿菌D-谷氨酸消旋酶的鼠耳芥植物的制備方法與上述方法基本相同。NCBI編號(hào)為AAC76949的基因murI編碼消旋酶EC5.1.1.3。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)序列設(shè)計(jì)用于克隆基因的引物，并將引物設(shè)計(jì)為位于開放讀碼框兩側(cè)。
觀察轉(zhuǎn)基因植物在常規(guī)培養(yǎng)基和常規(guī)氮源上的生存與生長(zhǎng)。
代謝D-氨基酸并同時(shí)產(chǎn)生過氧化氫的鼠耳芥制備出表達(dá)纖細(xì)紅酵母D-氨基酸氧化酶兩個(gè)變種的鼠耳芥植物，所述制備按如上所述方法進(jìn)行。
觀察這些轉(zhuǎn)基因植物在常規(guī)培養(yǎng)基和常規(guī)氮源上的生存和生長(zhǎng)。
當(dāng)在鼠耳芥中表達(dá)編碼酵母(纖細(xì)紅酵母)D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)的基因時(shí)，獲得了與描述表達(dá)D-絲氨酸氨裂解酶的植物相似的結(jié)果，即在含有D-氨基酸的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)基因植物的生長(zhǎng)和N含量與野生型植物相比有所增加。
D-氨基酸氧化酶存在多種D-氨基酸底物，且以D-丙氨酸和D-絲氨酸進(jìn)行的試驗(yàn)證實(shí)D-氨基酸氧化酶也能將這些N形式轉(zhuǎn)換成可接受的N源，并因此減輕由D-丙氨酸和D-絲氨酸所引起的毒性。
觀察到30mM D-Asn有效地終止了表達(dá)D-氨基酸氧化酶的植物在無菌瓊脂培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)。未觀察到表達(dá)D-氨基酸氧化酶的植物出現(xiàn)萌芽，表明其生長(zhǎng)受到完全抑制。觀察到野生型植物萌芽并緩慢長(zhǎng)出細(xì)小綠枝。因此，野生型植物的生長(zhǎng)僅部分地受到抑制，然后將野生型植物置于土壤中并進(jìn)行恢復(fù)救治。
發(fā)現(xiàn)D-ile對(duì)于抑制表達(dá)dao1的轉(zhuǎn)基因植物的生長(zhǎng)甚至更為有效，而對(duì)野生型植物則無明顯的抑制作用。發(fā)現(xiàn)在檢測(cè)的濃度范圍(0.3到30mM)內(nèi)，野生型鼠耳芥的生長(zhǎng)隨著D-ile濃度的增加而增加。
盡管未觀察到由胞質(zhì)和過氧化物酶所表達(dá)D-氨基酸氧化酶存在有顯著差異，但對(duì)于抑制D-氨基酸氧化酶植物在30mM D-Asn條件下的萌芽而言，發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體構(gòu)建體較之胞質(zhì)構(gòu)建體或多或少更為有效。然而，這兩種構(gòu)建體比野生型植物受到更顯著的抑制，因此可用于條件性陰性篩選。
表達(dá)大腸桿菌基因dsdA(D-絲氨酸脫水酶)的白楊和煙草應(yīng)用與以上描述的用于轉(zhuǎn)化鼠耳芥的相同載體和轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行白楊和煙草的轉(zhuǎn)化。
觀察到，當(dāng)將白楊和煙草置于根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上時(shí)，3mM和30mM的D-Ser足以分別終止野生型白楊和煙草所有根系的形成。然而，發(fā)現(xiàn)經(jīng)dsdA轉(zhuǎn)化的煙草和白楊在D-Ser濃度超過30mM時(shí)產(chǎn)生了D-Ser抗性。
如此處描述而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物，其代謝的N形式為其它植物無法獲得的N形式。這就允許將N靶向添加給混合植物環(huán)境中的該植物。所施用的D-氨基酸有著雙重作用，即促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植物生長(zhǎng)并抑制其它植物的生長(zhǎng)，當(dāng)其用于農(nóng)業(yè)時(shí)可產(chǎn)生協(xié)同作用。直接控制N源可降低良好生長(zhǎng)所需要的N量，潛在地降低了由不需要的高N載量所引起的環(huán)境壓力。此外，在作物植物具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中，通過使用特異的N源可減少雜草控制的需求，并降低除草劑的總需要量。
表1
表2D-氨基酸轉(zhuǎn)移酶/D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶P54692 D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.21)(DAAT)地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)DATP54693 D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.21)(DAAT)球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus)DATP19938 D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.21)(DAAT)芽孢桿菌屬的某些種(YM-1株)DAT007597 D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.21)(DAAT)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)DAT085046 D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.21)(DAAT)單核細(xì)胞增生桿菌DAT。
P54694 D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.21)(DAAT)溶血葡萄球菌(Staphylococcus heamolyticus)DATD-天冬氨酸氧化酶P31228 D-天冬氨酸氧化酶(EC1.4.3.1)(DASOX)(DDO)Bos taurus(牛)DDOQ99489 D-天冬氨酸氧化酶(EC1.4.3.1)(DASOX)(DDO)Homo sapiens(人)DDOQ9UJ09 DJ 261 KS.2(D-天冬氨酸氧化酶(EC1.4.3.1))Homo sapiens(人)DDOQ9TRA3 D-天冬氨酸氧化酶(EC1.4.3.1)(片段)Bos taurus(牛)D-絲氨酸脫水酶P54555 可能的D-絲氨酸脫水酶(EC4.2.1.14)(D-絲氨酸脫氨酶)枯草芽孢桿菌YQJRP00926 D-絲氨酸脫水酶(EC4.2.1.1 4)(D-絲氨酸脫氨酶)大腸桿菌.DSDA
Q9KL72 D-絲氨酸脫水酶霍亂弧菌(Vibrio cholerae)VCA0875Q9KC12 D-絲氨酸脫水酶(EC4.2.1.14)Bacillus halodurans.DSDAD-氨基酸氧化酶Q19564 推定的D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO)Caenorhabditis elegans F18E3.7P24552 D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO)腐皮鐮孢(亞種，豌豆)(Fuarium solani(subsp.pisi))(Nectriahaematococca)P14920 D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO)Homo apiens(人)DAO或DAMOXP18894 D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO)Mus musculus(小鼠)DAO或DAO1P00371 D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO)Sus scrofa(豬)DAOP22942 D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO)Oryctolagus cuniculus(兔)DAOO35078 D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO)Rattus norvegicus(大鼠)DAOP80324 D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO)紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)(酵母)(纖細(xì)紅酵母)DAOQ99042 D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO)三角酵母(Trigonopsis variabilis)DAO1Q9Y7N4 推定的D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAAO)粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(裂殖酵母)SPCC1450O01739 類似于D-氨基酸氧化酶Caenorhabditis elegans F20H11.5Q28382 D-氨基酸氧化酶(片段)Sus scrofa(豬)DAOO33145 推定的D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)麻瘋分枝桿菌(Mycobacterium leprae)AAOQ9X7P6 推定的D-氨基酸氧化酶天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)SC5F2A.23C
Q9JXF8 推定的D-氨基酸氧化酶黃素蛋白，腦膜炎奈瑟氏球菌(B血清組)(Neisseria meningitidis(serogroup B))NMB2068Q9Z302 D-氨基酸氧化酶Cricetulus griseus(中國(guó)倉(cāng)鼠)Q9Z1M5 D-氨基酸氧化酶Cavia porcellus(豚鼠)消旋酶O68006 谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)地衣芽孢桿菌BACAQ9L870 谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)魚腥藻屬的某些種(Anabaena sp)(PCC 7120株)MURIO66662 谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)Aquifex aeolicus MURI或AQ 325P56868 谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)Aquifex pyrophilus MURIO31332 谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)MURI或GLRO82826 谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)枯草桿菌變種natto(Bacillus subtilis var.Natto)MURI或GLRP52972 谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus.)MURI或GLR。
P94556 谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)枯草桿菌，RACEO51127 谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)Borrelia burgdorferi(萊姆病螺旋菌)MURI或BB0100Q9XDZ7 谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)MURIP57619 谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)Buchnera aphidicola(subsp.Acyrthosiphon pisum)Acyrthosipmupi或BU554Q9PM24 谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)Campylobacter jejuni.MURI或CJ1652Q9L4V5 谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)棒桿菌的某些種(Carnobacterium sp.)(ST2株)MURI或GLRQ9RU10 谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)Deinococcus radiodurans.MURI或DR1586。
P22634 谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)大腸桿菌.MURI或DGA或GLRP52973 谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)流感嗜血桿菌MURI或HI1739.2Q9ZLTO 谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)幽門螺旋桿菌J99(Helicobacter pylori J99)(幽門彎曲桿菌J99(Campylobacter pylori J99))MURI或GLR或HP0549P56068 谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)幽門螺旋桿菌(幽門彎曲桿菌(Campylobacter pylori))MURI或GLR或HP0549P48797 谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)短乳桿菌(Lactobacillus brevis)MURIQ03469 谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)MURIP46705 谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)麻瘋分枝桿菌(Mycobacterium leprae)MURI或B1549_C2_210Q10626 谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis.)MURI或RV1338或MTCY130.23或MTCY02B10.02Q9RQW7 谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)腦膜炎奈瑟氏球菌(A血清組)和MURI或GLR或NMA2026或NMB0458Q08783 谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)戊糖片球菌MURIP40723 谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)(片段) 鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium.)MURIP52974 谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)MURI或DGA.
P73737 谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)集胞藻屬的某些種(Synechocystis sp.)(PCC 6803株)MURI或SLR1746O83421 谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)蒼白密螺旋體(Treponema pallidum.)MURI或TP0406Q9KVI7 谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)霍亂弧菌(Vibrio cholerae.)MURI或VC0158
權(quán)利要求
1.分離的核酸，其包含編碼具有D-氨基酸代謝活性的多肽的核苷酸序列，所述序列被可操作地連接至植物特異的調(diào)控元件。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的核酸，其中D-氨基酸代謝活性選自氧化酶、消旋酶、羧化酶、轉(zhuǎn)氨酶和脫水酶活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的核酸，其中多肽在表1或表2中顯示。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的核酸，其中所述D-氨基酸選自D-ser、D-ala、D-glu、D-arg、D-lys、D-his、D-asp、D-asn或D-gln。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任意一項(xiàng)所述的核酸，其還包含編碼異源多肽的核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5中任意一項(xiàng)所述的核酸，其中具有D-氨基酸代謝活性的所述多肽包含轉(zhuǎn)運(yùn)肽，所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽指導(dǎo)所述酶在所述植物細(xì)胞的胞內(nèi)小室中進(jìn)行積聚。
7.表達(dá)載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求1到6中任意一項(xiàng)所述的核酸。
8.包含根據(jù)權(quán)利要求7的表達(dá)載體的植物細(xì)胞。
9.包含根據(jù)權(quán)利要求8的植物細(xì)胞的植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的植物，其為單子葉植物、雙子葉植物、裸子植物、藻類、蕨類或蘚類。
11.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括用根據(jù)權(quán)利要求7的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；以及，在包含D-氨基酸的培養(yǎng)基上由所述細(xì)胞再生出所述植物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中培養(yǎng)基包含唯一氮源，所述氮源由D-氨基酸組成。
13.用于對(duì)根據(jù)權(quán)利要求9或10的植物進(jìn)行選擇性施肥的肥料組合物；所述肥料包含D-氨基酸。
14.具有除草劑活性且包含一種或多種D-氨基酸的組合物。
15.控制植物生長(zhǎng)的方法，該方法包括應(yīng)用根據(jù)權(quán)利要求13的組合物處理植物。
16.刺激植物的逆境耐性的方法，其包括在所述植物中表達(dá)氧化D-氨基酸底物的多肽；以及用所述D-氨基酸底物處理所述植物。
17.抑制表達(dá)氧化D-氨基酸底物的氧化酶多肽的轉(zhuǎn)基因植物生長(zhǎng)的方法；該方法包括允許所述多肽在植物胞質(zhì)溶膠中積聚；以及用D-氨基酸底物處理植物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中D-氨基酸底物為D-ile或D-asn。
19.根據(jù)權(quán)力要求1到6中任意一項(xiàng)所述核酸的用途，用在篩選經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的方法中。
全文摘要
本發(fā)明涉及表達(dá)異源D－氨基酸代謝酶并且因此可利用D－氨基酸作為氮源的植物和植物細(xì)胞。提供了應(yīng)用D－氨基酸選擇性調(diào)控此類植物的生長(zhǎng)和逆境耐性的方法和手段。
文檔編號(hào)C05F11/10GK1620506SQ03802344
公開日2005年5月25日 申請(qǐng)日期2003年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月17日
發(fā)明者T·內(nèi)斯霍爾姆, O·埃里克松, M·赫茨貝里 申請(qǐng)人:巴斯福植物科學(xué)有限公司, 瑞典植物技術(shù)有限公司