專利名稱：利用游離小孢子培養(yǎng)技術培育花椰菜再生植株的方法
所屬領域本發(fā)明屬于一種蔬菜育種材料的培養(yǎng)方法，特別涉及一種利用游離小孢子培養(yǎng)技術培育花椰菜再生植株的方法
背景技術：
目前蕓薹屬蔬菜育種中游離小孢子培養(yǎng)技術日趨成熟，如大白菜、甘藍型油菜、莖椰萊(綠菜花)等蔬菜采用游離小孢子培養(yǎng)均獲得了成功，并應用于育種工作中?；ㄒ藢儆谑|苔屬蔬萊，但是應用其他蕓苔屬蔬菜游離小孢子培養(yǎng)方法根難獲得成功。特別是花椰菜小孢子胚的植株再生一直是世界上尚未解決的技術難點，花椰萊小孢子培養(yǎng)可以得一定數量的球形期胚和心形期胚，但此時的胚一般不再繼續(xù)發(fā)育停滯于這個時期，即使繼代也不會成苗而逐漸褐化死亡。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就在于提供一種利用游離小孢子培養(yǎng)技術獲得花椰菜再生植株的方法，這種方法解決了小孢子胚停滯發(fā)育的問題，使得到的小孢子胚經過繼代培養(yǎng)繼續(xù)發(fā)育成為再生植株。
本發(fā)明的技術方案是一種利用游離小孢子培養(yǎng)技術培育花椰菜再生植株的方法，是待小孢子胚長產生時，轉到溫度25℃、光照4000LX、光周期12-16hr/d的光照條件下培養(yǎng)，將轉綠后的胚轉移到含蔗糖3％的MS無激素固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上，直至幼苗長成；其特征在于在含蔗糖3％的MS無激素固體培養(yǎng)基中添加激動素、6芐基嘌呤和萘乙酸三種生長素。
上述激動素的濃度范圍為0.01-3ppm、6芐基嘌呤濃度范圍為0.01-3ppm、萘乙酸濃度范圍在0.01-3ppm。
本發(fā)明的優(yōu)點是1、可有效地解決小孢子胚發(fā)育停滯不前的問題，使獲得的小孢子胚70 80％能發(fā)育成為再生植株。由于一個胚代表著一種遺傳基因型，所以此方法的成功為花椰萊育種提供了大量的新基因型純系，極大地豐富了花椰菜育種資源。2、可加快育種步伐，大大的縮短育種時間，為應用生物技術開展花椰菜育種奠定了技術基礎。
具體實施例方式一種利用游離小孢子培養(yǎng)技術培養(yǎng)花椰菜的方法，依下列步驟進行①取材取花蕾長3-6mm的花序，其花粉發(fā)育時期為單核晚期。②材料滅菌用7％(w/v)飽和次氯酸鈣溶液，表面消毒15分鐘，用無菌水沖洗3次。③小孢子的收集與培養(yǎng)將無菌的花蕾放入研缽中，加入少量B5洗滌培養(yǎng)基(配方見附表)，用研缽輕壓材料，使小孢子從花藥中游離出來，用45μm孔徑的尼龍網過濾，收集濾液1000轉/分，離心3次，每次3分鐘，最后一次離心后，將小孢子懸浮于經過抽濾滅菌的NLN培養(yǎng)基(配方見附表)中，將小孢子濃度調整為1×10/ml，采用液體培養(yǎng)的方法，每個60×15mm培養(yǎng)皿中放入2-3ml，石蠟膜封口；經33℃、24hr高溫處理后，置于25℃下繼續(xù)暗培養(yǎng)，一般經2-3周便可獲得小孢子胚；④小孢子胚培養(yǎng)及再生植株的獲得待小孢子胚產生時，轉到溫度25℃、光照4000LX、光周期12hr/d的光照條件下培養(yǎng)，將轉綠后的胚轉移到含蔗糖3％的MS無激素固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上，3-4周便可成果獲得再生植株。在MS培養(yǎng)基中根據生長情況添加濃度為0.01-3ppm的激動素、濃度為0.01-3ppm的6芐基嘌呤、濃度為0.01-3ppm的萘乙酸。⑤再生植株的馴化；移栽前揭開培養(yǎng)瓶蓋練苗3天，練苗后將帶根幼苗洗去根部殘留的培養(yǎng)基，移栽于裝有育苗營養(yǎng)土的營養(yǎng)缽中，移栽前期用塑料小棚保濕，待幼苗健壯后定植于溫室。
培養(yǎng)基組成(mh/l)化學名稱 B5NLNMSKNO3300.0 125.0 1900.0MgSO4·7H2O500.0 125.0 370.0Ca(NO3)2·4H2O/ 500.0 /CaCl2·2H2O750.0 / 440.0KH2PO4/ 125.0 170.0NaH2PO4·H2O 150.0 / /(NH4)2·SO4134.0 / /NH4NO3/ / 1650.0Fe-EDTA 40.0 40.0 40.0MnSO4·4H2O10.0 22.3 22.3H3BO33.06.26.2ZnSO4·7H2O2.08.68.6Na2MoO4·2H2O 0.25 0.25 0.25CuSO4·5H2O0.025 0.025 0.025CoCl·6H2O 0.025 0.025 0.025KI 0.75 0.83 0.83甘氨酸 / 2.02.0肌醇 100.0 100.0 100.0煙酸 1.00.50.5B61.00.50.5B11.00.50.4生物素 / 0.05 /葉酸 / 0.5/谷胺酰氨 / 800.0 /絲氨酸 / 100.0 /谷胱甘肽 / 30.0 /蔗糖 130000.0 130000.0 30000.0瓊脂 / / 10000.0
權利要求
1.一種利用游離小孢子培養(yǎng)技術培育花椰菜再生植株的方法，是待小孢子胚長產生時，轉到溫度25℃、光照4000LX、光周期12-16hr/d的光照條件下培養(yǎng)，將轉綠后的胚轉移到含蔗糖3％的MS無激素固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上，直至幼苗長成；其特征在于在含蔗糖3％的MS無激素固體培養(yǎng)基中添加激動素、6芐基嘌呤和萘乙酸三種生長素。
2.根據權利要求1所述的利用游離小孢子培養(yǎng)技術培育花椰菜再生植株的方法，其特征在于上述激動素的濃度范圍為0.01-3ppm、6芐基嘌呤濃度范圍為0.01-3ppm、萘乙酸濃度范圍在0.01-3ppm。
全文摘要
一種利用游離小孢子培養(yǎng)技術培育花椰菜再生植株的方法，是待小孢子胚長產生時，轉到溫度25℃、光照4000LX、光周期12－16hr/d的光照條件下培養(yǎng)，將轉綠后的胚轉移到含蔗糖3％的MS無激素固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上，直至幼苗長成；其特征在于在含蔗糖3％的MS無激素固體培養(yǎng)基中添加激動素、6芐基嘌呤和萘乙酸三種生長素。本發(fā)明的優(yōu)點是1.可有效地解決小孢子胚發(fā)育停滯不前的問題。由于一個胚代表著一種遺傳基因型，所以此方法的成功為花椰萊育種提供了大量的新基因型純系，極大地豐富了花椰菜育種資源。2.可加快育種步伐，大大的縮短育種時間。
文檔編號A01H4/00GK1552198SQ0312998
公開日2004年12月8日 申請日期2003年6月5日 優(yōu)先權日2003年6月5日
發(fā)明者孫德嶺, 蔡榮期, 趙前程 申請人:天津科潤農業(yè)科技股份有限公司