專(zhuān)利名稱(chēng)：轉(zhuǎn)化效率更高的將基因?qū)胫参锏姆椒?br> (1)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種改善轉(zhuǎn)化效率的方法，其中用基因工程技術(shù)將所需基因?qū)胫参铩?br> (2)背景技術(shù)通過(guò)使用基因工程技術(shù)將基因?qū)胫参锏姆椒ǎ苤苯訉⑺杌驅(qū)胫参?。因此，它與傳統(tǒng)的重復(fù)雜交育種相比有許多優(yōu)點(diǎn)。例如，通過(guò)基因?qū)耄?a)可僅導(dǎo)入一種要改變的特征，(b)植物外其它物種(微生物等)的特征也可以導(dǎo)入到植物中，和(c)可顯著減少育種期。
然而，由于基因工程技術(shù)的轉(zhuǎn)化效率低，由喬木的種類(lèi)而定。有許多植物不能充分獲得這些優(yōu)點(diǎn)，例如，由于喬木的生命周期長(zhǎng)，通過(guò)重復(fù)雜交進(jìn)行的常規(guī)育種需要大量的土地和許多年。另外，喬木是最重要的生物質(zhì)來(lái)源之一，近年來(lái)期望它能維持和改善地球環(huán)境，因此人們關(guān)注針對(duì)開(kāi)發(fā)各種具有更卓越的性質(zhì)的品種，這些性質(zhì)包括生長(zhǎng)率、環(huán)境抗性等。因此，雖然基因?qū)氲闹苯佑N也在喬木中產(chǎn)生了很大的進(jìn)步，但工業(yè)上重要的樹(shù)種中轉(zhuǎn)化的效率在大多數(shù)情況下還是很低的。
因此，為了轉(zhuǎn)化這些喬木，已嘗試通過(guò)各種觀點(diǎn)的檢測(cè)，例如用組織類(lèi)型，基因?qū)胩幚淼臈l件和在處理前后組織的培養(yǎng)條件，來(lái)提高轉(zhuǎn)化效率。用芽(shoot)作為導(dǎo)入基因的組織進(jìn)行基因?qū)氲奶幚?，從其重新分生出的不定芽?lái)獲得導(dǎo)入所需的導(dǎo)入基因的個(gè)體，即轉(zhuǎn)化株，這種方法也已對(duì)樹(shù)種進(jìn)行了檢測(cè)。
然而，提高原來(lái)轉(zhuǎn)化效率低的樹(shù)種的效率也是困難的。畢竟事實(shí)上還未有通過(guò)基因工程技術(shù)獲得品質(zhì)改善到有實(shí)際價(jià)值水平的工業(yè)上重要的樹(shù)種。
另外，迄今為止，已建立的，如轉(zhuǎn)化植物的制備法是這樣的方法，根據(jù)所用不同的植物種類(lèi)，通過(guò)確定基因?qū)胩幚項(xiàng)l件、基因?qū)虢M織的培養(yǎng)條件等而建立起來(lái)，并且試圖從個(gè)體上提高轉(zhuǎn)化效率，而針對(duì)許多植物能同樣提高轉(zhuǎn)化效率的轉(zhuǎn)化方法現(xiàn)在還是未知的。
(3)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中通過(guò)用基因工程技術(shù)提高轉(zhuǎn)化效率，而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，該方法用于多種植物，包括轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是困難的喬木。
本發(fā)明的這個(gè)和其它目的可用一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法實(shí)現(xiàn)，它包括制備有至少一個(gè)具有生長(zhǎng)點(diǎn)的末端，和不含生長(zhǎng)點(diǎn)的基部的芽(shoot)作為導(dǎo)入基因的組織；和在基部導(dǎo)入所需的基因，同時(shí)維持至少一端中的生長(zhǎng)點(diǎn)分化成不定芽(bud)。
(4)


圖1是一張示意圖，顯示摻入pBI121載體中的植物基因內(nèi)的T-DNA區(qū)的結(jié)構(gòu)。
圖2是一張示意圖，顯示摻入pIPT10載體中的植物基因內(nèi)的T-DNA區(qū)的結(jié)構(gòu)。
(5)具體實(shí)施方式
作為深入研究的結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了當(dāng)用具有生長(zhǎng)點(diǎn)的芽作為導(dǎo)入基因的組織，將所需基因?qū)胙康幕繒r(shí)，所需基因能有效導(dǎo)入基部的細(xì)胞，而且導(dǎo)入所需基因的芽的基部重新分化成所需的導(dǎo)入基因的不定芽的能力很強(qiáng)。因此，完成了本發(fā)明。
本發(fā)明可用于任何植物，而不論其物種。然而，在被認(rèn)為為導(dǎo)入基因困難的植物，例如喬木等中尤其能獲得本發(fā)明的效果。
在本發(fā)明中，用作導(dǎo)入基因的組織的芽意味著延長(zhǎng)的定芽(bud)或不定芽。另外，為了進(jìn)一步改善轉(zhuǎn)化效率，優(yōu)選用具有高重新分生能力的組織或部分，例如具有低濃度聚苯酚(使組織變黑)的嫩組織作為導(dǎo)入基因的組織。由此可見(jiàn)，在本發(fā)明中選擇種子發(fā)芽獲得的下胚軸和延伸的頂芽或在培養(yǎng)容器中培養(yǎng)的植株側(cè)芽作為導(dǎo)入基因的合適組織。
然而，該芽必需具有至少一個(gè)具有生長(zhǎng)點(diǎn)的末端，和不含生長(zhǎng)點(diǎn)的基部。例如，當(dāng)用下胚軸作為作為本發(fā)明導(dǎo)入基因的組織時(shí)，可在種子發(fā)芽后通過(guò)從下胚軸切去根部和含有根基的部分，而留下頂芽和頂芽原基不動(dòng)，獲得芽。就此，具有生長(zhǎng)點(diǎn)的一端意味著具有頂芽等的芽的一端，不含生長(zhǎng)點(diǎn)的基部意味著通過(guò)切去根等形成的具有端面的部分。另外，當(dāng)用植株的延伸的頂芽或側(cè)芽作為本發(fā)明導(dǎo)入基因的組織，可以簡(jiǎn)單從植株上切下獲得。就此，具有生長(zhǎng)點(diǎn)的一端意味著具有頂芽等的芽末端，與下胚軸類(lèi)似，而不含生長(zhǎng)點(diǎn)的基部意味著具有從植株切下的端面的部分。即所需基因優(yōu)選導(dǎo)入當(dāng)制備芽作為基因?qū)氲慕M織時(shí)，產(chǎn)生的芽的基部的端面。
在本發(fā)明中，不定芽是通過(guò)在不含生長(zhǎng)點(diǎn)的基部導(dǎo)入所需基因，同時(shí)保留至少一端的生長(zhǎng)點(diǎn)分化而成的。作為所需的基因，可選擇和使用各種基因，例如可提供工業(yè)上卓越性質(zhì)的基因和不能總是提供工業(yè)上卓越的特征，但在研究基因表達(dá)機(jī)制中是必需的基因。
可間接通過(guò)雙粒病毒、雀麥草花葉病毒、根癌土壤桿菌(Agrobactriumtumefaciens)(此后稱(chēng)為(A.tumefaciens))、發(fā)根土壤桿菌(Agrobateriumrhizogenes)等病毒和細(xì)菌，通過(guò)將所需基因插入合適的載體，或直接用顆粒轟擊法等(I.Potrykus，Annu.rev.Plant.Physiol.Plant.Mol.Biol.，42205(1991))將所需基因?qū)胙炕俊?br> 例如，在使用土壤桿菌(土壤桿菌法，例如EP-A-0290799，美國(guó)專(zhuān)利4,940,838和5,591,616等)的基因?qū)敕ㄖ?，將其中插入了所需基因的合適載體通過(guò)土壤桿菌感染導(dǎo)入組織，來(lái)導(dǎo)入基因。土壤桿菌的感染是通過(guò)例如將要導(dǎo)入基因的組織浸在懸浮土壤桿菌的溶液中進(jìn)行的。
另外，由于土壤桿菌的感染在植物組織的傷口中發(fā)生，當(dāng)在基部形成傷口的芽浸在土壤桿菌懸液中時(shí)，傷口被土壤桿菌感染，所需基因?qū)胙炕俊．?dāng)下胚軸通過(guò)切去根等用作基因?qū)氲慕M織，或通過(guò)將其從植株上切下使用延伸的頂芽等時(shí)，感染在切割形成的芽基部的端面(切面)發(fā)生。即在這些情況下，僅通過(guò)將要導(dǎo)入基因的組織簡(jiǎn)單浸在土壤桿菌懸液中就將所需的基因?qū)胙恐小?br> 另外，當(dāng)要導(dǎo)入基因的組織被浸在細(xì)胞懸液中，然后通過(guò)將組織置于固態(tài)培養(yǎng)基與土壤桿菌共培養(yǎng)數(shù)日，可肯定用土壤桿菌感染植物組織。作為培養(yǎng)基，可使用恰當(dāng)補(bǔ)充了碳源和培養(yǎng)基固化劑，和如需要植物激素例如生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素等的熟知的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，例如MS(Murashige和Skoog，Physiol.Plant，15473-497(1962))或WPM(Loyd和McCown，Prop.Int.Plant Prop.Soc.，30421-427(1980))，或其改良的組合，來(lái)適合要被土壤桿菌感染的要導(dǎo)入基因的組織。就此，用10-30g/L蔗糖作為碳源；5-10g/L瓊脂或1-4g/L瓊脂糖膠作為培養(yǎng)基固化劑；0.01-5.0mg/L玉米素、芐基腺嘌呤等作為細(xì)胞分裂素，0.01-2.0mg/L萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)、吲哚乙酸等作為生長(zhǎng)素。另外，在某些情況下通過(guò)在上述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入10-200mg/L乙酰丁香酮提高了土壤桿菌的感染力。
在其它方面，當(dāng)通過(guò)轟擊槍導(dǎo)入所需基因時(shí)，可用上述共培養(yǎng)培養(yǎng)基作為導(dǎo)入基因處理的培養(yǎng)基。就此，導(dǎo)入基因的組織至于培養(yǎng)基上，以其要導(dǎo)入所需基因的位置，即芽基部向上，通過(guò)以常規(guī)方法操縱顆粒槍進(jìn)行基因?qū)搿?br> 一般當(dāng)所需基因?qū)胍獙?dǎo)入基因的組織時(shí)，可選擇標(biāo)記基因與所需基因一起導(dǎo)入，并用可選擇標(biāo)記基因的表達(dá)作為導(dǎo)入所需基因的標(biāo)記。在本發(fā)明的方法中，還可用細(xì)胞分裂素相關(guān)基因作為可選擇標(biāo)記基因改善轉(zhuǎn)化效率。
本文中細(xì)胞分裂素相關(guān)的基因是一個(gè)基因，它起到指導(dǎo)導(dǎo)入的植物細(xì)胞中細(xì)胞分裂素的影響增強(qiáng)，從而提高細(xì)胞的不定芽分化能力的作用?；虻睦影ㄗ鳛楦┩寥罈U菌-衍生的細(xì)胞分裂素合成基因(A.C.Smigocki和L d.Owens，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，855131(1988))的ipt基因，細(xì)胞分裂素的大腸桿菌衍生的β-半乳糖苷酶基因(Morten Loersbo和Finn T.Okkels，Plant CellReports，16219-221(1996))，擬南芥(Arabidopsis thaliana)衍生的CKll基因(視為細(xì)胞分裂素受體基因(Kakimoto T.，Science，274982-985(1996)))等。特別是在本說(shuō)明書(shū)的實(shí)施例中使用的ipt基因是一種最熟知的基因，其功能已被揭示。
另外，可通過(guò)將所需的基因、細(xì)胞分裂素相關(guān)基因和其它可任選的核苷酸序列和基因插入同一載體而導(dǎo)入，或通過(guò)將其插入沒(méi)有問(wèn)題的不同載體導(dǎo)入，只要它們能導(dǎo)入要導(dǎo)入基因的組織的同一細(xì)胞。然而當(dāng)基因等摻入相同載體時(shí)，必需安排它們，使基因等一側(cè)的存在不抑制基因等另一側(cè)的表達(dá)。
通過(guò)用合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)組織，在導(dǎo)入基因后可從組織中分化出不定芽。根據(jù)每種植物改變適合不定芽分化的培養(yǎng)基組成，但對(duì)于桉樹(shù)屬，可用其中銨氮和硝酸氮的濃度比改成1∶3的MS培養(yǎng)基(下文中簡(jiǎn)稱(chēng)為“改良MS培養(yǎng)基”)，在將其稀釋1-4倍，并補(bǔ)充10-30g/L蔗糖，1-4g/L瓊脂糖膠或5-10g/L瓊脂和0.2-5.0mg/L玉米素和0.01-1.0mg/L NAA作為植物激素后，用作不定芽分生培養(yǎng)基(芽再生培養(yǎng)基)。然而，當(dāng)用細(xì)胞分裂素相關(guān)基因作為可選擇標(biāo)記基因時(shí)，可以不加入植物激素(可以是無(wú)激素的)或僅加入生長(zhǎng)素。另外，當(dāng)用上述土壤桿菌法導(dǎo)入基因時(shí)，在培養(yǎng)基中以10-10,000mg/L的量加入抗生素，例如羧芐西林、替卡西林、頭孢氨噻等，來(lái)抑制土壤桿菌生長(zhǎng)。優(yōu)選溫度是15-30℃，光強(qiáng)度是0-200微摩爾/m2/s。由于在基因?qū)霑r(shí)間保持的芽生長(zhǎng)點(diǎn)在后面的步驟中不是特別需要的，可以在合適的階段將其切去。
用芽再生培養(yǎng)基培養(yǎng)的組織一般在培養(yǎng)開(kāi)始后幾周分化產(chǎn)生不定芽。就此，在不定芽分生前可能會(huì)長(zhǎng)出輕微的愈傷組織。所需基因?qū)脒@樣分化的不定芽的頻率比基于常規(guī)方法將基因?qū)胙糠稚姆稚牟欢ㄑ扛摺Ｈ欢?，?dāng)用細(xì)胞分裂素相關(guān)的基因作為可選擇標(biāo)記基因進(jìn)行基因?qū)霑r(shí)，導(dǎo)入了所需基因的不定芽有時(shí)可以顯示由于基因的形態(tài)學(xué)異常性誘導(dǎo)產(chǎn)生形態(tài)異常，例如多芽等。然而甚至在該情況下，當(dāng)將細(xì)胞分裂素相關(guān)基因與具有分離能力的DNA因子，如所示例如JP-A-9-154580中，也可最終獲得具有正常形態(tài)的不定芽。
可將獲得的不定芽切下，并將其移植到用于生根的生根培養(yǎng)基(含有0-1.0mg/ml生長(zhǎng)素)上再生出導(dǎo)入了所需基因的幼苗。
本發(fā)明認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)是，當(dāng)對(duì)基部進(jìn)行基因?qū)胩幚?，同時(shí)保持芽的至少一端的生長(zhǎng)點(diǎn)，以該方式導(dǎo)入基因的芽基部重新分化出導(dǎo)入所需基因的不定芽的能力，比將所需基因?qū)肭腥ドL(zhǎng)點(diǎn)的芽基部的情況強(qiáng)，所需基因被有效導(dǎo)入芽基部的細(xì)胞。
其理由不是一定要清楚的。但是考慮同一芽的至少一端存在的生長(zhǎng)點(diǎn)以某種形式對(duì)此起到了作用。由于植物組織和細(xì)胞常常在進(jìn)行基因?qū)霑r(shí)遭到一定程度的損傷，而該損傷的恢復(fù)強(qiáng)度在生長(zhǎng)點(diǎn)的存在下增強(qiáng)，因此似乎活躍生長(zhǎng)的能力也能維持在導(dǎo)入基因的細(xì)胞中，因此對(duì)所需基因?qū)?，?或重新分化導(dǎo)入所需基因的不定芽起到有利作用。
另外，通常將不含有生長(zhǎng)點(diǎn)的芽基部視為適合生根的部分。因此考慮當(dāng)用細(xì)胞分裂素相關(guān)的基因作為可選擇標(biāo)記基因，將基因?qū)氩糠謺r(shí)，分化不定芽的能力的差異在導(dǎo)入基因的細(xì)胞和未導(dǎo)入基因的細(xì)胞之間極端不同，結(jié)果導(dǎo)入所需基因的細(xì)胞選擇性的分化出不定芽。因此用該基因作為可選擇標(biāo)記基因更有利的分化出導(dǎo)入了所需基因的不定芽。
根據(jù)本發(fā)明，可通過(guò)將基因?qū)胫参锔纳扑杌虻恼T導(dǎo)效率。另外在本發(fā)明中，導(dǎo)入所需基因的不定芽是從導(dǎo)入所需基因的組織有效分化產(chǎn)生的。因此根據(jù)本發(fā)明，所需基因?qū)氩欢ㄑ康男视绕涮岣吡恕?br> 本發(fā)明可用于許多植物，本發(fā)明的效果對(duì)于認(rèn)為導(dǎo)入基因困難的植物尤其具有重要的意義。
因此，根據(jù)本發(fā)明，可進(jìn)行將基因?qū)氲焦I(yè)上重要的樹(shù)種中，本發(fā)明打開(kāi)了制備實(shí)際上有價(jià)值的轉(zhuǎn)化株的途徑。
本發(fā)明基于下面的實(shí)施例詳細(xì)描述；然而本發(fā)明不受其限制。
實(shí)施例1將赤桉(Eucalyptus camaldulensis)的種子浸在70％乙醇中消毒1分鐘，再浸在2％次氯酸鈉水溶液中約2小時(shí)，一邊攪拌，用無(wú)菌水充分洗滌，接種到發(fā)芽培養(yǎng)基上，在4℃的冰箱中保存2天或更長(zhǎng)，然后在光強(qiáng)為40μmol/m2/s的白光條件下25℃培養(yǎng)，影響其發(fā)芽。就此，在2倍稀釋的改良MS培養(yǎng)基(下文稱(chēng)為“赤桉基礎(chǔ)培養(yǎng)基”)中補(bǔ)充10g/L蔗糖、8g/L瓊脂，并用作發(fā)芽培養(yǎng)基。
種子接種到發(fā)芽培養(yǎng)基上后1-2周，從如此發(fā)芽的幼苗上切下根和子葉，收集各下胚軸，保持在其一端的頂芽，將pBI121載體(購(gòu)自CLONTECH，參見(jiàn)圖1)導(dǎo)入其不含生長(zhǎng)點(diǎn)的基部。在圖1中，NPTII表示卡那霉素抗性基因，35S-GUS-T表示分別在5’端和3’端連接有35S啟動(dòng)子和終止子的GUS基因。即pBI121載體利用電穿孔(用BioRad制造的GENE PULSER II)導(dǎo)入根癌土壤桿菌EHA105，然后在YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，用赤桉基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋到OD630＝0.5，來(lái)制備細(xì)胞懸液，然后將上述收集的下胚軸浸到細(xì)胞懸液中。接著，在丟棄過(guò)量細(xì)胞懸液后，用補(bǔ)充有40mg/L的乙酰丁香酮的芽再生培養(yǎng)基在25℃下避光共培養(yǎng)下胚軸和土壤桿菌2天，從而用導(dǎo)入了pBI121載體的土壤桿菌感染。就此，赤桉基礎(chǔ)培養(yǎng)基補(bǔ)充了2.0mg/L玉米素、0.3mg/L NAA、10g/L蔗糖和8g/L瓊脂，用作芽再生的培養(yǎng)基。
本文所用的pBI121載體是一種通過(guò)插入作為所需基因模型的GUS基因和作為可選擇標(biāo)記基因的卡那霉素抗性基因(NPTII基因)制備的載體。因此，細(xì)胞通過(guò)導(dǎo)入pBI121載體導(dǎo)入GUS基因和卡那霉素抗性基因，并顯示GUS活性和卡那霉素抗性。
共培養(yǎng)后的下胚軸移植到還加有500mg/L替卡西林和50mg/L用于選擇的導(dǎo)入pBI121載體的細(xì)胞的卡那霉素的芽再生培養(yǎng)基上，在光強(qiáng)度為40μmol/m2/s的白光條件下25℃培養(yǎng)，在2周的間隔，和土壤桿菌感染3個(gè)月后在相同的培養(yǎng)基組合物上傳代培養(yǎng)，然后用生根培養(yǎng)基使分化和延伸的不定芽生根。作為生根培養(yǎng)基，使用補(bǔ)充有0.05mg/L IBA、500mg/L替卡西林、150mg/L卡那霉素、10g/L蔗糖和2.5g/L瓊脂糖膠的Eucalyputus基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
當(dāng)對(duì)于50個(gè)下胚軸重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)后，在各實(shí)驗(yàn)中土壤桿菌感染后6周開(kāi)始觀察到不定芽的分化，最終在4個(gè)月后觀察到從來(lái)自150個(gè)下胚軸的6個(gè)中從芽生根(下文稱(chēng)為“6個(gè)品系的芽”)。當(dāng)根據(jù)Jefferson等的方法進(jìn)行GUS活性測(cè)試，在5個(gè)品系的芽中確定了其表達(dá)。即這種情況下轉(zhuǎn)化的效率是基于卡那霉素抗性6/150×100＝4.0％，基于GUS活性5/150×100＝3.3％。表1顯示了結(jié)果。
比較性實(shí)施例1以實(shí)施例1的相同方式導(dǎo)入GUS基因和卡那霉素抗性，和植物隨后的再生，除了通過(guò)從赤桉發(fā)芽的幼苗切除根，子葉和頂芽制備的下胚軸用作基因?qū)氲南屡咻S。
對(duì)于在320個(gè)下胚軸上的測(cè)試結(jié)果，最終在8個(gè)品系的芽中觀察到生根，在其中6個(gè)品系的芽中觀察到GUS活性。即這種情況下轉(zhuǎn)化的效率是基于卡那霉素抗性8/320×100＝2.5％，基于GUS活性是6/320×100＝1.9％。結(jié)果如表1所示。
表1
實(shí)施例2將具有根癌土壤桿菌PO22-衍生的ipt基因(其制備方法如JP-A-11-197722，如圖2)的pIPT10載體作為可選擇標(biāo)記基因?qū)氤噼竦南屡咻S基，代替實(shí)施例1中所用的pBI121載體，該下胚軸基是通過(guò)切除根部和子葉，僅在一端剩下頂芽制備的，以實(shí)施例1的相同方法分生不定芽。在圖2中，iptP-ipt-T表示ipt基因本身的啟動(dòng)子和終止子分別在5’側(cè)和3’側(cè)連接的ipt基因以及其它與圖1中相同。然而對(duì)此，在用土壤桿菌感染前用芽再生培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)1天。另外，植物激素和卡那霉素在土壤桿菌感染后未加到不定芽分生培養(yǎng)基中。土壤桿菌感染10周后切除下胚軸頂芽。
當(dāng)用40個(gè)下胚軸進(jìn)行測(cè)試時(shí)，在此在不定芽分生前觀察到長(zhǎng)出了一些愈傷組織。因此，GUS活性測(cè)試在愈傷組織分生出的不定芽上進(jìn)行，也在愈傷組織本身上在土壤桿菌感染3個(gè)月后進(jìn)行。結(jié)果在衍生自20個(gè)下胚軸的愈傷組織中發(fā)現(xiàn)GUS活性(下文稱(chēng)為“20個(gè)品系的愈傷組織”)，20個(gè)品系的愈傷組織中的6個(gè)品系分生出不定芽，其中4個(gè)品系的不定芽顯示GUS活性。即基于GUS活性基礎(chǔ)，愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率是20/40×100＝50.0％，不定芽的轉(zhuǎn)化效率是4/40×100＝10.0％。表2顯示了結(jié)果。
比較實(shí)施例2以實(shí)施例2的相同方式用pIPT10載體通過(guò)導(dǎo)入GUS基因和ipt基因分生出不定芽，除了通過(guò)從赤桉發(fā)芽的幼苗切除根，子葉和頂芽制備的下胚軸用作基因?qū)氲南屡咻S。
對(duì)于在98個(gè)下胚軸上的測(cè)試結(jié)果，在此也在不定芽分化前觀察到一些愈傷組織的生長(zhǎng)。結(jié)果土壤桿菌感染3個(gè)月后GUS活性測(cè)試的結(jié)果，在40個(gè)品系的愈傷組織中發(fā)現(xiàn)GUS活性，在40個(gè)品系的愈傷組織中的5個(gè)品系分生出不定芽。然而在任何不定芽中找不到GUS活性。即基于GUS活性，愈傷組織中的轉(zhuǎn)化效率是40/98×100＝40.8％，不定芽中的轉(zhuǎn)化效率是0/98×100＝0.0％。結(jié)果如表2所示。
實(shí)施例3將藍(lán)桉(Eucalyptus globulus)(下文稱(chēng)作“藍(lán)桉”)的種子浸在70％乙醇中消毒1分鐘，再浸在2％次氯酸鈉水溶液中約4小時(shí)，一邊攪拌，用無(wú)菌水充分洗滌，接種到發(fā)芽培養(yǎng)基上，在4℃的冰箱中保存2天或更長(zhǎng)，然后在光強(qiáng)為40μmol/m2/s的白光條件下25℃培養(yǎng)，影響其發(fā)芽。就此，在MS培養(yǎng)基中補(bǔ)充0.5mg/L玉米素、20g/L蔗糖和9g/L瓊脂用作發(fā)芽培養(yǎng)基。
種子接種到發(fā)芽培養(yǎng)基上后1-2周，從如此發(fā)芽的幼苗上切下根和子葉，獲得各留下一端的頂芽的下胚軸，將GUS基因和作為可選擇標(biāo)記基因的卡那霉素抗性基因?qū)肫洳缓L(zhǎng)點(diǎn)的基部。即將下胚軸浸在以實(shí)施例1中相同的方法制備的導(dǎo)入pBI121載體(購(gòu)自CLONTECH，如圖1)的土壤桿菌細(xì)胞懸液中，接著，在丟棄過(guò)量細(xì)胞懸液后，用補(bǔ)充有40mg/L的乙酰丁香酮的不定芽分化培養(yǎng)基在25℃下避光與土壤桿菌共培養(yǎng)3天，從而用導(dǎo)入了pBI 121載體的土壤桿菌感染。就此，改良的MS培養(yǎng)基中的氮源濃度改變?yōu)?/2，得到的培養(yǎng)基補(bǔ)充了1.0mg/L玉米素、0.05mg/L NAA、20g/L蔗糖和9g/L瓊脂，用作不定芽分化的培養(yǎng)基。
共培養(yǎng)后的下胚軸移植到還補(bǔ)充了500mg/L替卡西林和100mg/L卡那霉素的用于選擇的導(dǎo)入pBI121載體的細(xì)胞的不定芽分化培養(yǎng)基上，在光強(qiáng)度為40μmol/m2/s的白光條件下25℃培養(yǎng)，在2周的間隔在相同的培養(yǎng)基組合物上傳代培養(yǎng)，從而分生出不定芽。就此，在土壤桿菌感染后1個(gè)月切除下胚軸的頂芽。
當(dāng)用182個(gè)下胚軸進(jìn)行測(cè)試時(shí)，在此在不定芽分生前觀察到長(zhǎng)出了一些愈傷組織。因此，GUS活性測(cè)試在愈傷組織分生出的不定芽上進(jìn)行，也在愈傷組織本身上在土壤桿菌感染3個(gè)月后進(jìn)行。結(jié)果在40個(gè)下胚軸的愈傷組織中發(fā)現(xiàn)GUS活性，40個(gè)品系的愈傷組織中的12個(gè)品系分生出不定芽，其中6個(gè)品系的不定芽顯示GUS活性。即基于GUS活性基礎(chǔ)，愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率是40/182×100＝22.0％，不定芽的轉(zhuǎn)化效率是6/182×100＝3.3％。表2顯示了結(jié)果。
比較實(shí)施例3以實(shí)施例3的相同方式進(jìn)行GUS基因和卡那霉素抗性基因的導(dǎo)入，除了通過(guò)從藍(lán)桉發(fā)芽的幼苗切除根，子葉和頂芽制備的下胚軸用作基因?qū)氲南屡咻S。
當(dāng)在220個(gè)下胚軸上進(jìn)行測(cè)試時(shí)，在此也在不定芽分化前觀察到一些愈傷組織的生長(zhǎng)。結(jié)果土壤桿菌感染3個(gè)月后GUS活性測(cè)試的結(jié)果，在9個(gè)品系的愈傷組織中發(fā)現(xiàn)GUS活性，在9個(gè)品系的愈傷組織中的2個(gè)品系分生出不定芽，其中1個(gè)品系的不定芽顯示GUS活性。即基于GUS活性，愈傷組織中的轉(zhuǎn)化效率是9/220×100＝4.1％，不定芽中的轉(zhuǎn)化效率是1/220×100＝0.5％。結(jié)果如表2所示。
實(shí)施例4將pIPT10載體(其制備方法在JP-A-11-197722中描述，如圖2)導(dǎo)入藍(lán)桉的下胚軸基，該下胚軸基是通過(guò)切除根和子葉，僅在一端留下頂芽而制備的，以實(shí)施例3中相同的方式分化不定芽。然而不在此在培養(yǎng)基中加入植物激素和卡那霉素用于不定芽分生。
對(duì)于在120個(gè)下胚軸上的測(cè)試結(jié)果，直到土壤桿菌感染4個(gè)月后從22個(gè)下胚軸分生出不定芽。在其中8個(gè)品系的不定芽中找到GUS活性。即基于GUS活性，不定芽中的轉(zhuǎn)化效率是8/120×100＝6.7％。結(jié)果如表2所示。
比較實(shí)施例4以實(shí)施例4的相同方式用pIPT10載體通過(guò)導(dǎo)入GUS基因和ipt基因分生出不定芽，除了通過(guò)從藍(lán)桉發(fā)芽的幼苗切除根，子葉和頂芽制備的下胚軸用作基因?qū)氲南屡咻S。
對(duì)于在180個(gè)下胚軸上的測(cè)試結(jié)果，在土壤桿菌感染4個(gè)月后18個(gè)下胚軸分生出不定芽。在其中6個(gè)品系的不定芽中找到GUS活性。即基于GUS活性，不定芽中的轉(zhuǎn)化效率是6/180×100＝3.3％。結(jié)果如表2所示。
實(shí)施例5切下體外生長(zhǎng)的雜交白楊(Populus sieboldii×Populus grandidentata)Y-63(從Akita Jujo Chemicals Co.，Ltd.的實(shí)驗(yàn)樹(shù)林)的莖，保持一個(gè)節(jié)點(diǎn)，接種到發(fā)芽培養(yǎng)基中，在約40μmol/m2/s的光強(qiáng)的白光條件下25℃培養(yǎng)，使從節(jié)產(chǎn)生的定芽延伸到約1厘米。就此，用0.5mg/L玉米素、20g/L蔗糖和9g/L瓊脂補(bǔ)充改良MS培養(yǎng)基，用作發(fā)芽培養(yǎng)基。
接著，沿定芽與莖的基部切開(kāi)，獲得在其頂端具有頂芽的短芽，將GUS基因與作為可選擇標(biāo)記基因的ipt基因?qū)牖?。即將?dāng)從莖上切下定芽時(shí)形成的芽基部的切割面浸入2倍稀釋的導(dǎo)入pIPT10載體(其制備方法在JP-A-11-197722中有描述，參見(jiàn)圖2)的如實(shí)施例1的相同方法制備的土壤桿菌懸液中，接著，在丟棄過(guò)量細(xì)胞懸液后，將芽接種到補(bǔ)充有40mg/L的乙酰丁香酮的不定芽分化培養(yǎng)基中，在25℃下避光與導(dǎo)入了pIPT10的土壤桿菌共培養(yǎng)2天。在此，在改良的MS培養(yǎng)基中再補(bǔ)充20g/L蔗糖和9g/L瓊脂，用作不定芽分化的培養(yǎng)基。
共培養(yǎng)后的芽移植到補(bǔ)充了500mg/L替卡西林和100mg/L卡那霉素的用于選擇的導(dǎo)入pBI121載體的細(xì)胞的不定芽分化培養(yǎng)基上，在光強(qiáng)度為40μmol/m2/s的白光條件下25℃培養(yǎng)，在10天的間隔在相同的培養(yǎng)基組合物上傳代培養(yǎng)，從而分生出不定芽。就此，在土壤桿菌感染后1個(gè)月切除下胚軸的頂芽。
作為30個(gè)下胚軸的測(cè)試結(jié)果，在土壤桿菌感染40天后分生出了25個(gè)不定芽，在8個(gè)品系的不定芽中發(fā)現(xiàn)GUS活性。即基于GUS活性基礎(chǔ)，不定芽的轉(zhuǎn)化效率是8/30×100＝26.7％。表2顯示了結(jié)果。
比較實(shí)施例5以實(shí)施例5的相同方式通過(guò)導(dǎo)入GUS基因和ipt基因分生不定芽，除了用切除其頂部的頂芽制備的長(zhǎng)約5mm的芽作為基因?qū)氲墓?jié)(segment)。
作為43個(gè)節(jié)測(cè)試的結(jié)果，在土壤桿菌感染40天后從25個(gè)節(jié)分生出了不定芽，在4個(gè)品系的不定芽中發(fā)現(xiàn)GUS活性。即基于GUS活性基礎(chǔ)，不定芽的轉(zhuǎn)化效率是4/43×100＝9.3％。表2顯示了結(jié)果。
表2
表2(續(xù))
由表1和表2可見(jiàn)，實(shí)施例1-5在卡那霉素抗性基礎(chǔ)上和GUS基因表達(dá)基礎(chǔ)上都比相應(yīng)的比較實(shí)施例1-5顯示更高的轉(zhuǎn)化效率。
另外，實(shí)施例2和3中的GUS基因?qū)氲挠鷤M織顯示比比較實(shí)施例2和3中更高的分化導(dǎo)入GUS基因的不定芽的可能性。另外，實(shí)施例2中的可能性是4/20×100＝20.0％，因?yàn)閷?dǎo)入GUS基因的不定芽是從20個(gè)導(dǎo)入GUS的愈傷組織品系的4個(gè)品系中分生出來(lái)的，而比較實(shí)施例2中的可能性是0/40×100＝15.0％，因?yàn)楂@得40個(gè)導(dǎo)入GUS基因的愈傷組織，但它們都不分生出導(dǎo)入GUS基因的不定芽，實(shí)施例3中的可能性是6/40×100＝15.0％，因?yàn)閷?dǎo)入GUS基因的不定芽是從40個(gè)導(dǎo)入GUS的愈傷組織品系的6個(gè)品系中分生出來(lái)的，比較實(shí)施例3中的可能性是1/9×100＝11.1％，因?yàn)閷?dǎo)入GUS基因的不定芽是從9個(gè)導(dǎo)入GUS的愈傷組織品系的1個(gè)品系中分生出來(lái)的。
作為其原因，認(rèn)為實(shí)施例2和3中的導(dǎo)入GUS的愈傷組織與比較實(shí)施例2和3中導(dǎo)入GUS基因的不定芽相比，總體上活躍的分生出不定芽。導(dǎo)入GUS基因的愈傷組織的不定芽分生比支持該理由。即這些情況下實(shí)施例2中的不定芽分生比是6/20×100＝30％，比較實(shí)施例2中是5/40×100＝12.5％，實(shí)施例3中是12/40×100＝30％，比較實(shí)施例3中是2/9×100＝22.2％。認(rèn)為不定芽分生比中的提高是因?yàn)閷?shí)施例2和3中保持在用作導(dǎo)入基因的組織的下胚軸一端的頂芽的影響。
雖然詳細(xì)描述并參考實(shí)施例描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可對(duì)其進(jìn)行各種改變和修改，而不違背其精神和范圍。本文引用的全部文獻(xiàn)完整導(dǎo)入以供參考。
在此完整引用2001年7月24日提交的在先申請(qǐng)日本專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?001-223664以供參考。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于，該方法包括制備有至少一個(gè)具有生長(zhǎng)點(diǎn)的末端，和不含生長(zhǎng)點(diǎn)的基部的芽作為基因?qū)氲慕M織；和在基部導(dǎo)入所需的基因，同時(shí)維持至少一端中的生長(zhǎng)點(diǎn)分化成不定芽。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該芽是桉屬的芽。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，該芽是具有頂芽或頂芽原基的下胚軸。
4.如權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述所需基因?qū)朐谥苽溲孔鳛閷?dǎo)入基因的組織時(shí)所產(chǎn)生的芽基部的端面。
5.如權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述所需基因用土壤桿菌法導(dǎo)入。
6.如權(quán)利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，與所需基因一起導(dǎo)入作為可選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞分裂素相關(guān)基因。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞分裂素相關(guān)基因是異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因。
全文摘要
一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，它包括制備至少一個(gè)具有一個(gè)生長(zhǎng)點(diǎn)的末端和不含生長(zhǎng)點(diǎn)的基部的芽作為基因?qū)氲慕M織；將所需的基因?qū)牖?，同時(shí)保持至少一端的生長(zhǎng)點(diǎn)分化成不定芽。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1398510SQ0212711
公開(kāi)日2003年2月26日 申請(qǐng)日期2002年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月24日
發(fā)明者松永悅子, 杉田耕一, 海老沼宏安 申請(qǐng)人:日本制紙株式會(huì)社