專利名稱：盾葉薯蕷無(wú)菌高產(chǎn)克隆系工廠化生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種盾葉薯蕷無(wú)菌克隆系工廠化生產(chǎn)方法。
盾葉薯蕷(Dioscorea zingiberensis)是薯蕷皂素含量最高的中國(guó)特有薯蕷科植物。薯蕷皂素是合成甾體激素類藥物的重要原料，其結(jié)構(gòu)經(jīng)改造和合成后，可得到數(shù)千種不同的甾體激素藥物，如雙烯、黃體酮，催產(chǎn)素，避孕藥，強(qiáng)的松系列，可的松系列，還是地奧心血康、盾葉冠心寧的重要原料，在國(guó)際上有“藥用黃金”的美譽(yù)。中國(guó)有皂素生產(chǎn)廠50多家，年產(chǎn)500t左右，出口量位居世界第二。因其價(jià)值高，需求量大，加之連年采挖，野生資源已近枯竭，而薯葉塊莖的生長(zhǎng)周期需要3-5年，造成了目前皂素工業(yè)原料匱乏，轉(zhuǎn)產(chǎn)的41.7％，開工不足的50.6％，滿負(fù)荷運(yùn)轉(zhuǎn)的只有7.8％。選取生長(zhǎng)周期短，性狀穩(wěn)定，高產(chǎn)，抗病的優(yōu)良種苗是發(fā)展薯蕷種植的關(guān)鍵。就目前薯蕷優(yōu)良種源不足和種質(zhì)退化等問題，利用生物技術(shù)繁殖薯蕷植物，既可保存種質(zhì)資源，又可快速繁殖優(yōu)良種苗。現(xiàn)有技術(shù)中還未有利用生物技術(shù)進(jìn)行薯蕷植物繁殖的報(bào)道。
本發(fā)明的目的在于提供一種盾葉薯蕷無(wú)菌高產(chǎn)克隆系工廠化生產(chǎn)方法，該方法解決了因薯蕷莖結(jié)構(gòu)特殊而導(dǎo)致生根困難的問題，同時(shí)無(wú)性系后代保持與母本優(yōu)良特性的高度一致性，并實(shí)現(xiàn)了組培工廠化生產(chǎn)。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案盾葉薯蕷無(wú)菌克隆系工廠化生產(chǎn)方法，包括盾葉薯蕷的初代培養(yǎng)、生長(zhǎng)培養(yǎng)、叢芽增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)步驟，取盾葉薯蕷一年生植株的幼嫩頂芽和腋芽，清洗后，在超菌臺(tái)上用75％酒精浸泡30s，再用0.1％升汞滅菌5-8min，最后用無(wú)菌水沖洗數(shù)次，切成帶單個(gè)腋芽或頂芽的小節(jié)，轉(zhuǎn)于初代培養(yǎng)基即MS無(wú)激素+PH5.8，在光照強(qiáng)度1000LX，光照時(shí)間12h/d，溫度25±1℃中培養(yǎng)，把初代培養(yǎng)得到的無(wú)菌苗切成帶單個(gè)腋芽或頂芽的節(jié)后，轉(zhuǎn)接入6-BA0.2mg/l+NAA0.01+PH5.8的培養(yǎng)基中，然后轉(zhuǎn)入激素配比是BA0.2+IAA0.1或NAA0.1的培養(yǎng)基中進(jìn)行叢芽增殖，再轉(zhuǎn)入IAA0.5+NAA0.5的生根培養(yǎng)基中，待生根后移栽。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)益效果在于1、本發(fā)明采用低齡材料和高齡材料作培養(yǎng)物，結(jié)果得出低齡材料的叢芽誘導(dǎo)率最高，增殖倍數(shù)達(dá)5倍，生根率100％，生長(zhǎng)周期縮短到30d。解決了因薯蕷莖結(jié)構(gòu)特殊而導(dǎo)致生根困難的問題，同時(shí)無(wú)性系后代保持與母本優(yōu)良特性的高度一致性，并實(shí)現(xiàn)了組培工廠化生產(chǎn)。
2、本發(fā)明利用生物技術(shù)繁殖薯蕷植物，既保存了種質(zhì)資源，又快速繁殖了優(yōu)良種苗。
下面結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
實(shí)施例11.1材料1.1.1低齡材料盾葉薯蕷一年生植株的幼嫩頂芽和腋芽。1.1.2高齡材料多年生盾葉薯蕷塊莖上長(zhǎng)出的幼嫩頂芽和腋芽。1.2材料處理用肥皂和自來(lái)水清洗外植體后，在超菌臺(tái)上用75％酒精浸泡30s，再用0.1％升汞滅菌5～8min，最后用無(wú)菌水沖洗數(shù)次，切成帶單個(gè)腋芽或頂芽的小節(jié)，轉(zhuǎn)于初代培養(yǎng)基中。1.3培養(yǎng)基初代培養(yǎng)基為MS無(wú)激素+PH5.8。1.4培養(yǎng)條件光照強(qiáng)度1000LX，光照時(shí)間12h/d，溫度25±1℃。2、結(jié)果與討論2.1不同培養(yǎng)基對(duì)盾葉薯蕷在生長(zhǎng)的影響把初代培養(yǎng)得到的無(wú)菌苗切成帶單個(gè)腋芽或頂芽的節(jié)后，分別轉(zhuǎn)接于表1的培養(yǎng)基中，各培養(yǎng)基的激素均為6-BA0.2mg/l+NAA0.01+PH5.8。試驗(yàn)結(jié)果表明，MS培養(yǎng)基較適宜盾葉薯蕷的生長(zhǎng)；不同年齡的材料在同一種培養(yǎng)基中差異明顯，低齡材料生長(zhǎng)快，自身的增殖能力強(qiáng)，苗的長(zhǎng)勢(shì)較好，而高齡材料在培養(yǎng)基中的反應(yīng)遲緩，增殖能力也較弱。
表1不同培養(yǎng)基對(duì)盾葉薯蕷生長(zhǎng)的影響(接種60d的統(tǒng)計(jì)數(shù))
2.2不同激素及不同激素濃度對(duì)盾葉薯蕷叢芽增殖的影響試驗(yàn)結(jié)果(表2)表明，幼齡材料不論在誘導(dǎo)、增殖、生根、長(zhǎng)勢(shì)上都比高齡材料效果好。最適合低齡材料的激素配比是BA0.2+IAA0.1或NAA0.1，并有90％左右的增殖芽生根。隨BA濃度的增加，叢芽數(shù)量減少，愈傷組織增大，不定芽出現(xiàn)，這對(duì)母本優(yōu)良特性的保存不利。高齡材料誘導(dǎo)芽的數(shù)量與BA濃度成正比，BA濃度在1mg/l以上產(chǎn)生愈傷組織，其形態(tài)與根莖相似，表面光滑，有少量芽眼，無(wú)根。
表2不同激素及不同激素濃度對(duì)盾葉薯蕷叢芽增殖的影響(接種60d的統(tǒng)計(jì)數(shù))
注“-”愈傷組織；“+”愈傷組織0.1～0.5cm；“++”愈傷組織0.5～1.0cm；“+++”愈傷組織1.0cm以上；2.3不同激素及不同激素濃度對(duì)盾葉薯蕷生根的影響試驗(yàn)(表3)表明，高齡材料生根率最高僅36％，不能滿足生產(chǎn)上對(duì)幼苗生產(chǎn)的要求。低齡材料生根容易，在盾葉薯蕷的組培文獻(xiàn)中未見報(bào)道，對(duì)種苗的規(guī)?；a(chǎn)有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
表3不同激素及不同激素濃度對(duì)盾葉薯蕷生根的影響(接種30d的統(tǒng)計(jì)數(shù))
權(quán)利要求
1.盾葉薯蕷無(wú)菌克隆系工廠化生產(chǎn)方法，包括盾葉薯蕷的初代培養(yǎng)、生長(zhǎng)培養(yǎng)、叢芽增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)步驟，其特征是取盾葉薯蕷一年生植株的幼嫩頂芽和腋芽，清洗后，在超菌臺(tái)上用75％酒精浸泡30s，再用0.1％升汞滅菌5-8min，最后用無(wú)菌水沖洗數(shù)次，切成帶單個(gè)腋芽或頂芽的小節(jié)，轉(zhuǎn)于初代培養(yǎng)基即MS無(wú)激素+PH5.8，在光照強(qiáng)度1000LX，光照時(shí)間12h/d，溫度25±1℃中培養(yǎng)，把初代培養(yǎng)得到的無(wú)菌苗切成帶單個(gè)腋芽或頂芽的節(jié)后，轉(zhuǎn)入6-BA0.2mg/l+NAA0.01+PH5.8的培養(yǎng)基中，然后轉(zhuǎn)入激素配比是BA0.2+IAA0.1或NAA0.1的培養(yǎng)基中進(jìn)行叢芽增殖，再轉(zhuǎn)入IAA0.5+NAA0.5的生根培養(yǎng)基中，待生根后移栽。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,其目的在于提供一種盾葉薯蕷無(wú)菌克隆系工廠化生產(chǎn)方法,該方法解決了因薯蕷莖結(jié)構(gòu)特殊而導(dǎo)致生根困難的問題,同時(shí)無(wú)性系后代保持與母本優(yōu)良特性的高度一致性,并實(shí)現(xiàn)了組培工廠化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1343444SQ0112880
公開日2002年4月10日 申請(qǐng)日期2001年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月29日
發(fā)明者羅桂芬, 胡虹, 呂春朝, 許琨, 王 華 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所